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Biochemistry

Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Sono presentati qui i protocolli per la caratterizzazione immunohistochimica e la localizzazione di peptidi orexin, recettori dell'orexina e recettori endocannabinoidi nell'intestino e nel cervello dei modelli di obesità adulta (DIO) normali e indotta dalla dieta immunoperissiasi e metodi di doppia immunofluorescenza.

Abstract

L'immunohistochimica (IHC) è una tecnica altamente sensibile e specifica coinvolta nella rilevazione di antigeni bersaglio nelle sezioni tissutali con anticorpi etichettati. Si tratta di un processo multifase in cui l'ottimizzazione di ogni passo è fondamentale per ottenere il segnale specifico ottimale. Attraverso l'IHC, è possibile rilevare la distribuzione e la localizzazione di biomarcatori specifici, rivelando informazioni sulla conservazione evolutiva. Inoltre, L'IHC consente di comprendere i cambiamenti di espressione e distribuzione dei biomarcatori in condizioni patologiche, come l'obesità. L'IHC, principalmente la tecnica dell'immunofluorescenza, può essere utilizzato nel pesce zebra adulto per rilevare l'organizzazione e la distribuzione di molecole conserve filogeneticamente conservate, ma un protocollo IHC standard non è estasblished. Orexin ed endocannabinoidi sono due sistemi altamente conservati coinvolti nel controllo dell'assunzione di cibo e patologia dell'obesità. Riportati qui sono protocolli utilizzati per ottenere informazioni sul peptide orexin (OXA), recettore dell'orexin (OX-2R), e il recettore cannabinoide (CB1R) localizzazione e distribuzione nell'intestino e nel cervello di normali e indotti dalla dieta obeso (DIO) modelli di pesce zebra adulti. Sono inoltre descritti i metodi per l'immunoperossiasi e la doppia immunofluorescenza, nonché la preparazione di reagenti, la fissazione, l'incorporazione di paraffina e la crioprotezione del tessuto del pesce zebra e la preparazione per una fase endogena di blocco dell'attività e controstatura. L'insieme completo dei parametri è ottenuto da precedenti esperimenti IHC, attraverso i quali abbiamo dimostrato come l'immunofluorescenza può aiutare con la comprensione di OX, OX-2R, e distribuzione CB1R, localizzazione, e conservazione dell'espressione nel pesce zebra adulto Tessuti. Le immagini risultanti con intensità del segnale altamente specifico hanno portato alla conferma che i pesci zebra sono modelli animali adatti per studi immunohistochimici di distribuzione, localizzazione e conservazione evolutiva di biomarcatori specifici condizioni fisiologiche e patologiche. I protocolli qui presentati sono consigliati per gli esperimenti IHC nel pesce zebra adulto.

Introduction

L'immunohistochimica (IHC) è una tecnica classica ben consolidata utilizzata per identificare i componenti cellulari o tissutali (antigeni) dall'interazione antigene-anticorpo1,2. Può essere utilizzato per identificare la localizzazione e la distribuzione di biomolecole bersaglio all'interno di un tessuto. L'IHC utilizza reazioni immunologiche e chimiche per rilevare gli antigeni nelle sezioni tissutali3. I principali marcatori utilizzati per la visualizzazione delle interazioni antigene-anticorpo includono coloranti fluorescenti (immunofluorescenza) e reazioni di colore enzimatico-substrato (immunoperossiasi), entrambe coniugate agli anticorpi4. Utilizzando l'osservazione microscopica è possibile determinare la localizzazione del tessuto etichettato, che corrisponde approssimativamente alla localizzazione dell'antigene bersaglio nel tessuto.

Esistono due metodi per le reazioni fluorescenti o cromogeniche per rilevare le proteine: il metodo di rilevamento diretto, in cui l'anticorpo primario specifico è etichettato direttamente; e il metodo di rilevamento indiretto, in cui l'anticorpo primario è non coniugato mentre l'anticorpo secondario porta l'etichetta5,6,7. Il metodo indiretto ha alcuni vantaggi, che è principalmente la sua amplificazione del segnale. Inoltre, a differenza di altre tecniche molecolari e cellulari, con l'immunofluorescenza, è possibile visualizzare la distribuzione, la localizzazione e la coespressione di due o più proteine espresse in modo differenziale all'interno di cellule e tessuti7. La scelta del metodo di rilevamento utilizzato dipende dai dettagli sperimentali.

Ad oggi, IHC è ampiamente utilizzato nella ricerca di base come uno strumento potente ed essenziale per comprendere la distribuzione e la localizzazione dei biomarcatori e la profilazione generale di diverse proteine nel tessuto biologico dall'uomo agli invertebrati8, 9 (in vie , 10 del sistema , 11. La tecnica aiuta a visualizzare una mappa dell'espressione proteica in un gran numero di organi animali normali e alterati e diversi tipi di tessuto, mostrando possibili down o up-regolazione dell'espressione indotta da cambiamenti fisiologici e patologici. IHC è una tecnica altamente sensibile che richiede precisione e la corretta scelta dei metodi per ottenere risultati ottimali12. Prima di tutto, molti fattori diversi come la fissazione, la reattività incrociata, il recupero dell'antigene e la sensibilità degli anticorpi possono portare a falsi segnali positivi e falsi negativi13. La selezione degli anticorpi è uno dei passi più importanti in IHC e dipende dalla specificità dell'antigene e dalla sua affinità con le proteine e le specie in esame7.

Recentemente, abbiamo ottimizzato la tecnica IHC per rilevare i membri dei sistemi orexin/ipocretin e endocannabinoidi nel tessuto ringiovanito del pesce zebra. Ci siamo concentrati principalmente sulla fissazione, l'incorporamento dei tessuti utilizzando due approcci diversi, il sezionamento e il montaggio (che possono influenzare la risoluzione e il dettaglio durante l'analisi microscopica) e il blocco (per prevenire falsi positivi e ridurre lo sfondo)14. Altre caratteristiche importanti sono la specificità dell'anticorpo e la selettività e riproducibilità dei singoli protocolli IHC. La chiave per fornire la specificità degli anticorpi è l'uso di controlli negativi (compresi gli anticorpi primari o i tessuti che è noto per non esprimere le proteine bersaglio) e controlli positivi (compresi i tessuti che è noto per esprimere le proteine bersaglio)15 . La selezione degli anticorpi per l'IHC viene effettuata in base alla loro specificità delle specie (la probabilità con cui reagiscono con l'antigene di interesse) e ai sistemi di rilevazione antigene-anticorpo utilizzati4,5,6 ,7. Nel caso dell'immunoperossia, il colore della reazione è determinato dalla selezione del cromogeno precipitante, di solito diaminobenzidina (marrone)16. D'altra parte, immunofluorescencence utilizza anticorpi coniugati con un fluorophor per visualizzare l'espressione delle proteine in sezioni di tessuto congelato e consente una facile analisi di più proteine rispetto al sistema di rilevamento cromogenico 5 Del numero 3( , 7.

Nella tecnica dell'immunoperossiasi, l'anticorpo secondario viene coniugato alla biotina, una molecola del linker in grado di reclutare una molecola di reporter cromatogeno [complesso avidino-biotina (ABC)], che porta all'amplificazione del segnale di colorazione. Con il metodo reporter ABC, l'enzima perossidasi reagisce con 3,3'-diaminobenzidina (DAB), producendo una colorazione intensamente marrone dove l'enzima si lega all'anticorpo secondario, che può quindi essere analizzato con un microscopio luminoso ordinario. La colorazione ABC, a causa dell'alta affinità dell'avidina per la biotina, produce una reazione rapida e ottimale, con pochi anticorpi secondari attaccati al sito della reattività primaria dell'anticorpo. Questo metodo di rilevamento cromogenico consente l'analisi densitometrica del segnale, fornendo dati semiquantitativi basati sulla correlazione dei livelli di segnale marrone con i livelli di espressione delle proteine18.

Con le tecniche di immunofluorescenza, il rilevamento simultaneo di più proteine è possibile grazie alla capacità di fluorocromi diversi di emettere luce a lunghezze d'onda uniche, ma è importante scegliere con attenzione i fluorocromi per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale 5. Inoltre, l'uso di anticorpi primari in diverse specie ospiti riduce al minimo le difficoltà relative alla reattività incrociata. In questo caso, ogni anticorpo secondario specifico della specie riconosce solo un tipo di anticorpo primario. I reporter fluorescenti sono piccole molecole organiche, compresi i derivati commerciali, come i coloranti Alexa Fluor.

Molti modelli animali sono utilizzati per comprendere particolari condizioni fisiologiche e patologiche. Ad oggi, è stabilito che molte vie metaboliche sono conservate nel corso dell'evoluzione. Pertanto, gli studi IHC in organismi modello come il pesce zebra possono fornire informazioni sulla genesi e il mantenimento delle condizioni patologiche e non patologiche17. L'obiettivo di questa relazione è illustrare i protocolli IHC che possono essere eseguiti sul tessuto del pesce zebra adulto e utilizzati per ottenere immagini dettagliate della distribuzione e localizzazione di OXA, OX-2R e CB1R a livello periferico e centrale. Sono riportati anche protocolli per l'applicazione di due principali metodi indiretti IHC nei tessuti periferici e centrali del pesce zebra adulto. Descritto è il metodo indiretto, che consente l'amplificazione del segnale nei casi in cui un anticorpo secondario viene coniugato a un tintura fluorescente (metodo di immunofluorescenza) o reporter enzimatico (metodo immunoperossidasi). Entrambi i metodi cromogenici e fluorescenti di rilevamento possiedono vantaggi e svantaggi. Riportato in questo protocollo è l'uso di IHC, principalmente immunofluorescenza, nel pesce zebra adulto, un modello animale ampiamente utilizzato per studiare i sistemi che sono evolutivi conservati in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.

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Protocol

1. Protocollo immunoperossiasi

NOTA: Il pesce zebra sono stati ottenuti dal professor Omid Safari (Dipartimento della Pesca, Facoltà di Risorse Naturali e Ambiente, Ferdowsi Università di Mashhad, Mashhad, Iran)10.

  1. Dissezione dei tessuti
    1. Sacrificare il pesce zebra per sommersione nell'acqua ghiacciata (5 parti di ghiaccio/1 parte di acqua, 4 gradi centigradi); lasciarli fino alla cessazione di tutti i movimenti per garantire la morte per ipossia.
    2. Rimuovere rapidamente l'intestino e il cervello con il seguente metodo di dissezione:
      1. Asciugare il pesce su un tovagliolo di carta e metterlo sapidricamente su un tappetino dissezioso, bloccando la parte ventrale della presa oculare e la parte carnosa della coda.
      2. Per l'intestino: tagliare la pelle e rimuovere con attenzione la pelle e il muscolo sottostante dal lato del pesce fino a quando gli organi interni sono visibili. Rimuovere l'intestino dalla cavità del corpo allungandolo.
      3. Per il cervello: rimuovere la testa con una lama di rasoio. Rimuovere i tessuti molli dal lato ventrale del cranio con pinze. Aprire il cranio e rimuovere l'osso dal lato ventrale del cervello. Rimuovere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello. Togliete il cervello.
  2. Fissazione dei tessuti
    1. Fissare i tessuti sezionanti per immersione in fresco 4% paraformaldeyde (PFA) in tampone fosfato (PB, pH 7,4, 4 C) per 3 h a temperatura ambiente (RT).
      1. Preparare 0,1 M PB sciogliendo 1,755 g di NaH2PO4H2O e 4.575 g di 52HPO4 in 450 mL di acqua distillata (dH2O), e regolare a un pH di 7,4 con la quantità necessaria di NaOH 1N.
      2. Preparare il 4% di PFA sciogliendo 4 g di PFA in 100 mL di 0,1 M PB (pH 7.4) per agitazione su una piastra di calore. Quando si raggiunge una temperatura di 60 gradi centigradi, aggiungere 2-4 gocce di NaOH 1N per ottenere una soluzione chiara. Sinistra PFA 4% a RT e controllare il pH . Regolare il pH a 7.4.
        NOTA: La fissazione dei tessuti per più di 4-6 h può portare a una sovrafissazione, che maschera gli antigeni, limitando il legame anticorpo-epitopo. Il tempo di fissazione dipende dalle dimensioni del tessuto.
  3. Incorporamento dei tessuti
    1. Sciacquare i tessuti 5x per 5 min ciascuno, per immersione in 0,1 M PB (pH 7.4).
    2. Diidratare i tessuti con successiva immersione nell'alcol 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min), e 100% (1 min).
    3. Chiarire i tessuti per immersione in 100% alcol:xylene (1:1) per 10 min, poi 2x in x in xilene per 5 min ciascuno.
    4. Infiltrare i tessuti con la cera di paraffina (56 gradi centigradi) due volte per 1 h ciascuno per immersione diretta in paraffina.
    5. Incorporare i tessuti in blocchi di paraffina a temperatura ambiente (RT) e conservarli in RT fino alla sezionamento.
  4. Taglio dei tessuti
    1. Tagliare i tessuti a sezioni coronali o sagittali con spessore di 8 m con un microtome, e raccogliere le sezioni in serie alternativa su vetrini di vetro adesivo sull'acqua e riscaldati a 38 gradi centigradi.
    2. Asciugare i vetrini con sezioni a 37 gradi durante la notte.
  5. Deparaffinazione e reidratazione delle sezioni tissutali
    1. Dewax le sezioni per immersione in xilene per 5 min seguita da immersione in xilene per 3 min.
    2. Reidratare le sezioni con diapositive successive immersione in alcool 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), quindi posizionare i vetrini in dH2O (5 min).
      NOTA: completamente decerare le sezioni prima di iniziare la reazione. Se le sezioni hanno ancora tracce di paraffina, eseguire un'ulteriore immersione in xilene per 5 minuti o più.
  6. Recupero dell'antigene
    1. Trattare le sezioni con tampone di citrato (0,01 M, pH 6.0) immergendo i vetrini nella soluzione e riscaldando le sezioni in un forno a microonde per 5 min al massimo della potenza.
    2. Lasciare raffreddare le sezioni.
    3. Ripetere il ciclo di 5 min nel forno a microonde a potenza massima per completare il recupero dell'antigene.
      1. Preparare il tampone di citrato (0,01 M, pH 6,0) sciogliendo 2,10 g di acido citrico in 100 mL di dH2O e 5,882 g di citrato di sodio in 200 mL di dH2O. Mix sodio citrato (0,01 M) con acido citrico (0,01 M) a un rapporto di 1:4 m. 6 utilizzando HCl 0.1N.
  7. Blocco endogeno perossidasi
    1. Delimitare l'area del tessuto sui vetrini con una penna resistente ai solventi.
    2. Risciacquare le sezioni 3 volte, 5 min ciascuna, con soluzione salina tris-buffered (TBS) (0,1 M, pH 7.3).
      1. Preparare 0,1 M TBS sciogliendo 12,1 g di base trizma e 9 g di NaCl in 950 mL di dH2O e regolare a pH 7.3 con HCl 0.1N.
    3. Bloccare l'attività endogena perossidasi per immersione diapositive in una soluzione di 0.75% H2O2 per 5 min a RT.
      1. Preparare la soluzione 0.75% H2O2 dissolvendo 5 mL del 30% H2O2 in 195 mL di dH2O.
        NOTA: gli enzimi nogeni possono reagire con reagenti IHC e produrre risultati falsi positivi. Inoltre, i tessuti altamente vascolarizzati esprimono molte perossidi endogene, che possono portare a intensi livelli di colorazione e di fondo non specifici. Il trattamento con 0.75% H2O2 spentosio perossidiosi e riduce significativamente lo sfondo non specifico.
  8. Blocco di prodotti non specifici bindi siti ng e permeabilizzazione dei tessuti
    1. Incubare le sezioni di tessuto con il buffer di blocco TBS/0.4% Triton (TBS-T), contenente l'antisiero primario (NRS), per 30 min a RT per bloccare i siti di legame non specifici.
      1. Preparare lo 0,4% Triton sciogliendo 0,4 mL di Triton X-100 in 100 mL di TBS.
      2. Preparare la soluzione TBS-T del buffer di blocco sciogliendo l'1% del siero normale in TBS contenente 0,4% Triton X-100 (1 mL di siero normale , 8,2 mL di TBS , 0,8 mL di 0,48 Triton X-100).
        NOTA: Selezionare la specie del siero animale a seconda dell'ospite dell'anticorpo secondario (ad esempio, quando si utilizza un anticorpo secondario anti-coniglio di capra, utilizzare il normale siero di capra).
  9. Incubazione dei tessuti con anticorpo primario
    1. Incubare le sezioni durante la notte in una scatola umida a RT con anticorpi primari diluiti in TBS-T. Macchiare le sezioni con il seguente anticorpo primario:
      1. Anticorpi di capra contro OX-2R diluito 1:200, che riconosce il terminale C della proteina.
      2. Anticorpi di capra contro OX-A diluito 1:200 [orexin-A (C-19)], che riconosce il terminale C della proteina.
        NOTA: Assicurarsi che l'anticorpo primario reagisca con la biomolecola di interesse. Definire con quale epitopo della biomolecola reagisce l'anticorpo primario utilizzando l'allineamento genico. Ad esempio, l'epitopo OX-A è stato mappato tra l'aa 50-100 dell'Uomo OX-A (O43612) mentre l'epitopo OX-2R è stato mappato vicino agli ultimi 50 aa al terminale C dell'uomo.
  10. Incubazione dei tessuti con anticorpo secondario
    1. Sciacquare le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M TBS (pH 7.3).
    2. Incubare le sezioni per 1,5 h a RT con anticorpo secondario biotinylato e immunoglobuina anti-capra del coniglio (H-L) coniugata con biotina, quindi diluire 1:100 in TBS-T.
      NOTA: Verificare e trovare le diverse diluizioni degli anticorpi primari e secondari per trovare la diluizione ottimale che consente la riduzione dello sfondo.
  11. Reazione di Peroxidase
    1. Sciacquare le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M TBS (pH 7.3).
    2. Incubare le sezioni con complesso avidino-biotina (ABC) per 1 h.
      1. Preparare la soluzione ABC aggiungendo due gocce di componente A seguite da due gocce del componente B in 5 mL di TBS.
    3. Sciacquare le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M TBS (pH 7.3).
    4. Trattare le sezioni con il substrato cromogeno 3,3'-diaminobenzidine-4 (DAB).
      1. Preparare la soluzione DAB aggiungendo una goccia (circa 30 ) di daB chromogen concentrato a 1 mL di DIluente DAB, e mescolare bene prima dell'uso.
        NOTA: Preparare la soluzione ABC almeno 30 min prima dell'uso e mantenere il complesso a 4 gradi centigradi fino all'uso per consentire un legame di avidina/biotina stabile. Preparare la soluzione di lavoro DAB fresca, applicare sulle sezioni di tessuto e sviluppare fino a quando il colore è appropriato. Quando la reazione cromogenica converte i siti dell'epitopo in un colore marrone e l'intensità del segnale è appropriata per l'imaging, procedere al passaggio successivo. La tempistica dello sviluppo DAB può variare da pochi secondi a 10 min. Per OX-A e OX-2R 1, 2 min è sufficiente. Gestire DAB con cura, in quanto è cancerogeno.
  12. Disidratazione e montaggio dei tessuti
    1. Sciacquare tutte le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M TBS (pH 7.3) per fermare la reazione DAB.
    2. Disidratare le sezioni da diapositive successive immersione in alcool 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Chiarire le fette mediante immersione 2x in xilene 10 min ciascuna.
    4. Montare le sezioni con DPX (dibutyl ftalate xylene) mountant per l'istologia, aggiungendo due gocce di supporti di montaggio alle diapositive e guarnire lentamente con i telllabbra.
      NOTA: Poiché l'immersione del tessuto in crescenti concentrazioni di alcol durante la disidratazione provoca la penetrazione di alcol del tessuto e la sostituzione dell'acqua con l'alcol, determinare un preciso tempo di disidratazione e non pereidratare i tessuti. Eseguire l'immersione nello xilene dopo la disidratazione per chiarire il tessuto e rimuovere eventuali eccessi o alcool rimanente.
  13. Controlli
    1. Ripetere le sezioni 1.1–1.12, omettendo l'anticorpo primario e/o sostituendo l'anticorpo primario o l'anticorpo secondario IgG da TBS (controlli negativi).
    2. Ripetere le sezioni 1.1–1.12 pre-assorbendo ogni anticorpo primario con un eccesso del peptide relativo (100 mg di peptide/1 mL di antisiero diluito).
    3. Ripetere le sezioni 1.1–1.12 utilizzando tessuti diversi come controllo positivo (ad esempio, tessuto del topo).
      NOTA: Preparare tutti i buffer freschi, poco prima di iniziare. Rimuovere con attenzione il liquido in eccesso ad ogni passo con una pipetta o carta filtrante intorno alle sezioni, mantenendo sempre le sezioni bagnate.
  14. Acquisizione e analisi delle immagini
    1. Acquisire immagini digitali sotto costante illuminazione luminosa e allo stesso ingrandimento utilizzando un microscopio dotato di una fotocamera digitale.
    2. Eseguire un'analisi semi-quantitativa dell'intensità della colorazione utilizzando il software di imaging (vedere Tabella dei materiali).
      1. Aprire le immagini acquisite, in formato .lif o .tiff, per valutare gli indici di positività OX-A o OX2-R.
      2. Selezionare il pulsante in Misura e fare clic su Manual Counting. Contare il numero di profili di celle colorate direttamente dallo schermo posizionando un segno sulle celle positive facendo clic con il mouse.
      3. Selezionare un'area di regione di interesse (ROI) (3 x 103 m2) per quantificare la densità dell'immunosegnale (densità ottica, OD).
      4. Determinare il pixel con l'intensità più alta (alto positivo) e l'intensità minima (negativa) all'interno dell'immagine analizzata per assegnare lo zero come valore dello sfondo (cioè una porzione di tessuto privo di cellule colorate).
      5. Valutare l'OD lavorando su una scala logaritmica di assorbimento. Nell'analisi digitale delle immagini, l'intensità dei pixel DAB varia dalla tonalità più scura (valore 0) alla tonalità più chiara (255 valore).
      6. Determinare OD tracciando un istogramma dei seguenti elementi: log10(255/I), dove "I" è il valore di intensità dei pixel dato dal programma e determinato sottraendo lo sfondo.
        NOTA: La reazione di immunoperossia permanente e stabile può essere analizzata al microscopio a campo luminoso in qualsiasi momento. Eseguire il conteggio delle celle etichettate su sezioni alternative per evitare il doppio conteggio della stessa cella da sezioni adiacenti.

2. Protocollo di immunofluorescenza

  1. Dissezione dei tessuti
    1. Sacrificare e sezionare gli animali come descritto nella sezione 1.1.
  2. Fissazione dei tessuti
    1. Fissare l'intestino e il cervello per immersione per 3 h in 4% PFA a 4 gradi centigradi.
      1. Preparare PB e il 4% PFA come nella sezione 1.2.1.
        NOTA: il tempo di fissazione dipende dalle dimensioni del tessuto. La fissazione dei tessuti per più di 4-6 h può portare a una sovrafissazione, che maschera gli antigeni e limita il legame anticorpo-epitopo.
  3. Incorporamento dei tessuti
    1. Sciacquare i tessuti 3x per 5 min ciascuno, con 0,1 M PB (pH 7.4).
    2. Per la crioprotezione, trasferire i tessuti al 20% di saccarosio in PB (0,1 M, pH 7,4) e conservare per una notte a 4 gradi centigradi. Quindi, trasferire i tessuti al 30% di saccarosio in 0,1 M PB (pH 7.4) e tenere per una notte supplementare a 4 gradi centigradi.
    3. Incorporare i tessuti in un blocco di composto di temperatura di taglio ottimale (OCT). Per fare questo, preparare una piccola dewar di azoto liquido, prendere foglio di alluminio, e tagliarlo a metà per creare una padella. La padella contenente i tessuti riempiti con il composto dello Strumento di personalizzazione di Office deve essere immersa nell'azoto liquido fino a quando il composto dello OCT non viene raffreddato. I tessuti congelati possono essere conservati a -80 gradi centigradi fino alla sezionamento.
  4. Taglio dei tessuti
    1. Trasferire i blocchi di tessuto congelato in un criostato a -20 gradi centigradi e tagliarli in sezioni coronali o sagittali di 10 m.
    2. Raccogliere i tessuti in sezioni seriali alternate su vetrini di vetro adesivi adatti per l'immunoistochimica e conservarli a -20 gradi centigradi fino all'uso.
      NOTA: Conservare i vetrini tra i -20 e i 4 gradi centigradi in una slide box scura o in un libro di diapositive.
  5. Blocco di siti di legame non specifici e permeabilizzazione dei tessuti
    1. Delimitare l'area del tessuto sul vetrino con una penna resistente al solvente.
    2. Risciacquare le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7.4).
    3. Incubare le sezioni con siero d'asino normale dell'1% sciolto nel buffer di permeabilizzazione PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) per 30 min a RT per permeabilizzare la membrana cellulare e bloccare i siti di legame non specifici.
      1. Preparare triton X-100 0,3% dissolvendo 0,3 mL di Triton X-100 in 100 mL di 0,1 M PB (pH 7.4).
      2. Preparare la soluzione di blocco sciogliendo 1% siero d'asino normale in PB contenente 0.3% TritonX-100.
        NOTA: Le specie animali del siero utilizzate nei buffer permeabilizzazione e bloccante dipendono dall'ospite dell'anticorpo secondario.
  6. Incubazione con mix di anticorpi primari
    1. Risciacquare le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7.4).
      1. Incubare le sezioni durante la notte in una scatola umida a RT con un mix di anticorpi primari diluiti in PB-T. Possono essere utilizzate le seguenti miscele di anticorpi primari: anticorpi di capra contro l'anticorpo OX-2R diluito 1:100/coniglio contro CB1R diluito 1:100, o anticorpo di capra contro OX-A diluito 1:100/anticorpo del coniglio contro CB1R diluito 1:100.
  7. Incubazione con mix di anticorpi secondari
    1. Risciacquare le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7.4).
    2. Incubare le sezioni per 2 h a RT con 1) un mix di anti-coniglio anti-coniglio anti-minare Alexa Fluor 488-coniugato anticorpo secondario e asino anti-capra Alexa Fluor 594-coniugato anticorpo secondario diluito 1:100 in PB-T; o 2) un mix di anticorpo secondario coniugato anticapra anti-capra d'asino e anticorpo secondario coniugato antichiave Alexa Fluor 594- coniugato diluito 1:100 in PB-T.
      NOTA: Utilizzare anticorpi secondari sviluppati nello stesso ospite animale. Il siero normale deve appartenere alla stessa specie dell'anticorpo secondario (ad esempio, utilizzare anticorpi secondari sviluppati in asino e un asino normale siero). Diluire gli anticorpi primari e secondari con tampone di blocco contenente il detersivo per aumentare la permeabilizzazione cellulare e ridurre lo sfondo.
  8. Montaggio dei tessuti
    1. Risciacquare le sezioni 3x per 5 min ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7.4).
    2. Controstain le sezioni con colorante nucleare DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) preparato sciogliendo 1,5 -L di DAPI (1 mg/mL) in 3 mL di PB.
    3. Diapositive Coverslip con supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali). Questo mezzo di montaggio acquoso stabilizza il campione di tessuto e macchie per l'uso a lungo termine. I campioni fluorescenti possono essere conservati al buio a 4 gradi centigradi. Per prolungare la vita dei fluorofori, utilizzare un mezzo di montaggio antifederale.
      NOTA: Scegliere un buon supporto di montaggio. Uno dei parametri più importanti degli agenti di montaggio è l'indice di rifrazione (nD), che dovrebbe essere di circa 1,5, l'indice di rifrazione del vetro. Il mezzo di montaggio utilizzato qui può essere utilizzato soprattutto con campioni preparati per determinazioni enzimatiche e lipidiche (cioè, campione che non deve essere disidratato con una serie ascendente di alcol).
  9. Controlli
    1. Ripetere le sezioni 2.1–2.8, omettendo l'anticorpo primario o secondario o sostituendo nel passaggio specifico l'antisera primario o secondario con PB (controllo negativo).
    2. Ripetere le sezioni 2.1–2.8, pre-assorbendo ogni anticorpo primario con un eccesso del peptide relativo (100 mg di peptide/1 mL di antisiero diluito).
    3. Ripetere le sezioni 2.1–2.8 su sezioni di cervello del topo (controllo positivo).
      NOTA: Preparare tutti i buffer freschi, poco prima di iniziare. Rimuovere l'eccesso di liquido con attenzione ad ogni passo con una pipetta o carta filtrante intorno alle sezioni, mantenendo sempre la sezione umida.
  10. Acquisizione di immagini
    1. Utilizzare un microscopio confocale dotato di uno stadio motorizzato x-y-z, fotocamera digitale e software di acquisizione e analisi delle immagini come NIS-Elements C per osservare e analizzare le sezioni immunostainte. Acquisire immagini digitali utilizzando gli obiettivi 5-20-40x.
    2. Prendere le immagini di ogni sezione a basso ingrandimento (10x o 20x obiettivo) in ciascuno dei canali disponibili per comporre un montaggio a basso ingrandimento, fornendo una panoramica dell'intera regione per facilitare la localizzazione e la documentazione di OX-2R/CB1R co-espressione anatomica. Normalizzare le immagini a fluorescenza al massimo contrasto e sovrapposizione prima dell'analisi.
    3. Raccogliere seriali stack di immagini in tutta l'area di interesse. Acquisire le immagini attraverso sei piani focali (passo z) con gradini focali di 1-1,8 m per coprire il volume del tessuto in cui la coespressione OX-2R/CB1R è visualizzata come puncta gialla. Per fare questa raccolta per ogni canale (rosso, verde, blu) separatamente, utilizzando un microscopio motorizzato a z.
    4. Utilizzare un software di deconvoluzione di imaging per deconvolve immagini mediante l'applicazione di dieci iterazioni e comprimere le immagini seriali dei piani in un'unica immagine di proiezione massima.
    5. Regolate le micrografie per ottenere luce e contrasto utilizzando Adobe Photoshop 6.01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      NOTA: Eseguire la fase di deconvoluzione durante l'osservazione per ridurre ulteriormente lo sfondo. Limitare l'esposizione della diapositiva alla luce per evitare il fotosbiancamento.
  11. Analisi delle immagini
    1. Eseguire l'analisi quantitativa della coespressione OX-2R/CB1R su sezioni alternate spesse 10 m (n - 5 animali per gruppo) coprendo tutte le regioni di interesse di ogni animale.
    2. Quantificare la coespressione OX-2R/CB1R come numero di puncta giallo positivo con un sistema semiautomatizzato di analisi delle immagini. Il software Imagins può fornire un livello di dettaglio più elevato, con dati quantitativi riguardanti le regioni di sovrapposizione tra diverse sonde fluorescenti.
    3. Quantificare il puncta utilizzando gli strumenti di soglia per l'intensità del segnale nei due canali. Aprire il file di immagini .liff, .tiff o .jpg e selezionare Immagine-Soglia. Selezionare Impostazione automatica o Metodo manuale e regolare Soglia fino a selezionare tutti i puncta macchiati. Analizzare la distribuzione delle intensità dei pixel in un'area dell'immagine che non contiene oggetti immunoetichettati per ottenere la soglia di sfondo. Determinare questo sfondo singolarmente per ogni immagine. Il programma rimuove quindi la soglia dello sfondo impostando la linea di base dell'intensità dei pixel sul valore dello sfondo.
    4. Selezionare Analizza-Misura e scegliere i parametri da misurare (intensità puncta-minimo, massimo e valori medi; numero/densità del puncta immunoetichettato).
    5. Contare il puncta giallo lungo il volume del tessuto in 4 pile per ogni sezione, utilizzando le pile immediatamente sopra o sotto al miglior piano di messa a fuoco. Escludere le regioni fuori fuoco dall'analisi.
      NOTA: Eseguire il conteggio delle celle etichettate su sezioni alternate per evitare il doppio conteggio delle stesse celle provenienti da sezioni adiacenti.

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Representative Results

I dati rappresentativi per la colorazione immunoperossia sono riportati nella figura 1 e nella figura 2. L'analisi immunoistochimica della distribuzione OX-A e OX-2R nell'intestino del pesce zebra adulto ha mostrato diversi siti di localizzazione di OX-A e OX-2R e il loro aumento nell'espressione nelle cellule intestinali del pesce zebra DIO. Una colorazione marrone intensa per OX-A è stata osservata nelle cellule dell'intestino mediale e anteriore (Figura 1A, A1). L'immunoespressione di OX-A ha dato segnali chiari nei diversi compartementi intestinali, diminuendo dalla parte anteriore verso l'intestino mediale (Figura 1B, B1). Il controllo negativo è stato utilizzato come riferimento per lo sfondo e per confermare la specificità del segnale OX-A (Figura 1E). L'esposizione prolungata al DAB cromogeno ha provocato l'aumento dell'intensità di fondo (Figura 1D). Risultati simili sono stati osservati per l'immunoespressione OX-2R nell'intestino del DIO e il controllo del pesce zebra dieta (Figura 2). Un aumento del segnale OX-A nel pesce zebra adulto DIO è stato accompagnato dalla sovraespressione di OX-2R in altri compartementi intestinali (Figura 2B, B1).

Utilizzando l'immunofluorescenza, sono stati confermati i dati ottenuti mediante analisi immunoperossidasi, alla base dell'aumento dell'espressione OX-A e OX-2R nell'intestino del pesce zebra DIO adulto rispetto al controllo (Figura 3). Inoltre, utilizzando la doppia immunoorescenza, è stato possibile ottenere informazioni sull'espressione del recettore endocannabinoide CB1R e sulla sua co-localizzazione con OX-A o OX-2R nell'intestino e nel cervello della dieta di controllo e del pesce zebra adulto DIO. Il vantaggio dell'immunofluorescenza è che produce un segnale più dettagliato con meno informazioni fornite sulla morfologia dei tessuti, rispetto alla tecnica dell'immunoperossia. Utilizzando il metodo dell'immunofluorescenza, in precedenza abbiamo determinato le interazioni anatomiche tra OX-2R e CB1R sia nell'intestino che nel cervello10.

L'analisi accurata delle immagini immunofluorescenti ha mostrato l'aumento della co-localizzazione OX-2R/CB1R nell'intestino del pesce zebra adulto DIO rispetto al pesce zebra della dieta di controllo (Figura 3B, C). Una situazione simile è stata osservata in diverse regioni del cervello, come il telencephalon dorsale, l'ipotalamo (zone laterali, ventrali e dorsali), il tectumo ottico, il toro lateralis e il nucleo diffuso del lobo inferiore (Figura 4). I controlli negativi (Figura 5A,B) e positivi (cervello del mouse) (Figura 5C) sono stati utilizzati come riferimenti per lo sfondo e per confermare la specificità dei segnali CB1R e OX-2R.

Inoltre, mediante doppia immunostainizzazione con OX-A/CB1R, è stato osservato nei neuroni orexinergici dell'ipotalamo che c'era un aumento della co-localizzazione accompagnato da un aumento del segnale fluorescente OX-A (Figura 6). Questi risultati mostrano come la doppia immunoorescenza possa aiutare a identificare l'espressione proteica fisiologicamente conservata, la co-localizzazione delle proteine bersaglio e la loro distribuzione e/o cambiamenti di espressione in diverse condizioni patologiche.

Figure 1
Figura 1: immunolocalizzazione di Orexin nell'intestino del DIO vs. .controllo dieta pesce zebra adulto. (A) OX-A immunoreattività nelle cellule dell'intestino mediale del controllo dieta zebrefish. (A1) OX-A immunoreattività nelle cellule dell'intestino mediale del pesce zebra DIO. (B) OX-A immunoreattività nelle cellule dell'intestino anteriore del controllo dieta zebrefish. (B1) Immunoreattività OX-A nelle cellule dell'intestino anteriore del pesce zebra DIO. (A1, B1) Un aumento delle cellule positive OX-A in diversi compartementi tissutali del mediale e dell'intestino anteriore del pesce zebra DIO. (C) OX-A immunoreattività nelle cellule dell'intestino anteriore del pesce zebra DIO. (D) reazione immunoperossidasi per OX-A dopo una prolungata esposizione al DAB. (E) Controllo negativo. Barra della scala: 50 m (A, A1, B, B1); 100 m (C, D, E). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'immunolocalizzazione del recettore Orexin 2 nell'intestino del DIO vs. (A) Immunoreattività OX-2R nelle cellule dell'intestino mediale del pesce zebra dieta di controllo. (A1) Immunoreattività OX-2R nelle cellule dell'intestino mediale del pesce zebra DIO. (B) Immunoreattività OX-2R nelle cellule dell'intestino anteriore del controllo dieta zebrefish. (B1) Immunoreattività OX-2R nelle cellule dell'intestino anteriore del pesce zebra DIO. (A1, B1) Un aumento delle cellule positive OX-2R in diversi compartementi tissutali dell'intestino mediale e anteriore del pesce zebra DIO. Barra della scala: 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Distribuzione di OX-A (verde)/CB1R (rosso) e OX-2R (rosso)/CB1R (verde) e loro co-localizzazione con OX-2R/CB1R (giallo) nell'intestino del diO vs. (A) Co-espressione OX-A/CB1R nell'intestino della dieta di controllo pesce zebra adulto. (B) OX-2R/CB1R co-espressione all'interno dell'intestino del controllo dieta zebrefish. (C) OX-2R/CB1R co-espressione all'interno dell'intestino del pesce zebra adulto DIO. Un aumento della co-localizzazione OX-2R/CB1R (punti gialli) nell'intestino del pesce zebra DIO. Barra della scala: 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Distribuzione di OX-2R (rosso) e CB1R (verde) e la loro co-localizzazione con OX-2R/CB1R (giallo) nelle sezioni coronali cerebrali del diO vs. (A) Co-espressione OX-2R/CB1R nel telencephalon del pesce zebra di dieta di controllo. (A1) Co-espressione OX-2R/CB1R nel telencephalon del pesce zebra DIO. (B) OX-2R/CB1R co-espressione all'interno della zona laterale, ventrale e dorsale dell'ipotalamo, del tectum ottico, del toro lateralis, del nucleo diffuso del lobo inferiore della dieta di controllo, oX-2R/CB1R all'interno del nodo laterale, ventrale e zone dorsali dell'ipotalamo, tectumo ottico, toro lateralis, e nucleo diffuso del lobo inferiore del pesce zebra DIO. (C) Ingrandimento più elevato del ventume ottico che mostra la co-espressione di OX-2R/CB1R (giallo) nel pesce zebra della dieta di controllo. (C1) Maggiore ingrandimento del tectum ottico che mostra la co-espressione di OX-2R/CB1R (giallo) nel pesce zebra DIO. (D) Particolare del tema ottico che mostra la distribuzione e la co-espressione di OX-2R/CB1R (giallo) nel pesce zebra DIO. DAPI (blu) è stato utilizzato per contrastare i nuclei. CP: nucleo talamico posteriore centrale; Dd: dorsale; Dc: centrale; Dl: laterale; Dm: mediale; Dp: parte posteriore del telecefalo dorsale; Hd: zona dorsale dell'ipotalamo periventricolare; Hv: zona ventrale dell'ipotalamo periventricolare; LH: parte laterale dell'ipotalamo; PGl: nuclei laterali e PGm: nuclei preglomerici mediali; Pg: zona grigia periventricolare del tectum ottico; TeO: tectum ottico; TL: toro longitudinalis; Vd: parte dorsale del telecefalo ventrale. Barra della scala: 50 m (A, A1, C, C1); 250 m (B e B1); 25 m (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Espressione e specificità delle proteine OX-2R e CB1R nel cervello adulto del pesce zebra e dell'ippocampo del topo. (A) Controllo negativo dell'OX-2R mediante pre-assorbimento con il peptide relativo. (B) Controllo negativo della CB1R mediante pre-assorbimento con il peptide relativo. (C) Controllo positivo dell'OX-2R/CB1R nell'ippocampo del mouse. Zona grigia periventricolare del tectum ottico; TeO: tectum ottico. Barra della scala: 100 m (A, B); 250 m (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Distribuzione di OX-A (verde) e CB1R (rosso) e loro co-localizzazione con OX-A/CB1R (giallo) nelle sezioni coronali ipotaliche del DIO vs dieta pesce zebra adulto. (A) Co-espressione OX-A/CB1R nell'ipotalamo del pesce zebra della dieta di controllo (A1)Ingrandimento superiore che mostra la co-espressione OX-A/CB1R all'interno dell'ipotalamo laterale. Dettaglio della co-espressione OX-A/CB1R che mostra una localizzazione adiacente putativa di OX-A/CB1R o di co-localizzazione e sovrapposizione di OX-A/CB1R nelle stesse celle. (B) Co-espressione OX-A/CB1R nell'Ipothalamus del pesce zebra DIO (B1)Ingrandimento più elevato che mostra l'aumento della co-espressione OX-A/CB1R all'interno dell'ipotalamo laterale. Dettaglio della co-espressione OX-A/CB1R che mostra una localizzazione adiacente putativa di OX-A/CB1R o di co-localizzazione e sovrapposizione di OX-A/CB1R nelle stesse celle. LH: parte laterale dell'ipotalamo. Barra della scala: 50 m (A, B); 25 m (A1, B1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Preparazione del campione

La preparazione del campione è il primo passaggio critico in IHC. Un protocollo affidabile consente la manutenzione della morfologia cellulare, dell'architettura dei tessuti e dell'antigenicità. Questo passaggio richiede la corretta raccolta dei tessuti, la fissazione e la sezionamento22,23. Lo scopo della fissazione è quello di preservare il tessuto e ridurre l'azione di enzimi tissutali o microrganismi. In particolare, la fase di fissazione conserva i componenti cellulari e le biomolecole, previene l'autolisi e lo spostamento dei costituenti cellulari (come antigeni ed enzimi), stabilizza i materiali cellulari contro gli effetti avversi delle seguenti procedure e facilita l'immunostaining4,7,24.

Prima della sezionamento, il tessuto viene preparato e conservato attraverso l'incorporamento della paraffina (metodo immunoperossidasi) o crioconservato (congelamento in criomedia, in più metodi di immunofluorescenza). Il metodo di conservazione è associato al tipo di fissazione7. Dopo la fissazione e la conservazione, i tessuti vengono tagliati da un microtoma se incorporati in paraffina, o da un criostato se incorporato in un criomediale. I tessuti sono tipicamente tagliati ad una gamma di spessore di 8-10 m e montati su vetrini. Per la colorazione immunoperossiase, il campione può richiedere ulteriori passaggi per smascherare gli epitopi per il legame degli anticorpi, compresa la deparaffinizzazione e l'antigene retrieveo25,26. Va tenuto presente che la sovrafissazione può causare il mascheramento dell'epito, mentre la sottofissazione può causare poco o nessun segnale positivo con una pesante colorazione del bordo.

Blocco e riduzione dello sfondo

Nel metodo dell'immunoperossiasi, l'alta affinità dell'avidina per la biotina è probabilmente responsabile della rapida produzione di colorazione di fondo. Inoltre, poiché la reazione avidina-biotina è irreversibile, lo sfondo non può essere rimosso18,27. Durante l'IHC, un alto background può anche essere prodotto da un legame non specifico alle biotine endogene dei tessuti. Le interazioni idrofobiche e ioniche (come quelle prodotte dal collagene e da altri tessuti connettivi come l'epitelio e l'adipociti), nonché l'attività endogena degli enzimi, sono le principali cause di colorazione di fondo. La biotina endogena o gli enzimi e il legame idrofobico devono essere ridotti al minimo prima della colorazione dell'anticorpo, che può essere ottenuta con l'aggiunta di un detergente, come Triton X-100, nei buffer di blocco28.

L'uso dello 0,3%-0,4% Triton X-100 nei buffer di blocco consente anche la permeabilizzazione completa degli anticorpi nelle sezioni dei tessuti. Inoltre, sebbene gli anticorpi siano preferibilmente specifici per un epitopo, è possibile un legame parziale ai siti su proteine non specifiche, che porta ad un'elevata colorazione di fondo29. Le associazioni non specifiche possono mascherare il segnale dell'antigene bersaglio30. Per ridurre la colorazione in background non specifica, i campioni devono essere incubati con un buffer che blocca i siti reattivi non specifici. I buffer di blocco comuni includono il siero normale o l'album in30siero bovino. La specie del siero di blocco deve essere la stessa dell'ospite dell'anticorpo secondario. Si raccomanda di determinare il miglior tempo di incubazione. La concentrazione del siero normale nel buffer di blocco è un'altra importante determinazione31. Inoltre, per eliminare la colorazione di fondo, è fondamentale utilizzare la diluizione ottimale degli anticorpi primari e secondari. Pertanto, il tempo di incubazione deve essere scelto con attenzione, oltre alla temperatura (cioè, aumentare il tempo se si esegue a 4 gradi centigradi, diminuire il tempo se a RT) e il sistema di rilevamento.

Scelta dell'anticorpale

La selezione degli anticorpi per la colorazione IHC è importante e può influenzare l'esito sperimentale32 . Per garantire che l'anticorpo risponda in modo appropriato, l'epitopo da esso riconosciuto deve essere considerato. Comprendere la proteina bersaglio e la sua funzione, la localizzazione dei tessuti e subcellulari e se subisce modifiche post-traduzionali può aiutare a determinare la scelta dell'anticorpo. Un altro passo importante è la prova di diverse concentrazioni di anticorpi primari/secondari per mantenere lo sfondo e l'aspecificità ad un livello minimo compatibile con un segnale specifico. Inoltre, è importante controllare la reattività delle specie per confermare la compatibilità degli anticorpi primari e secondari e la capacità dell'anticorpo primario di riconoscere il bersaglio dell'antigene nella sua conformazione nativa. Un altro passo importante per la scelta primaria degli anticorpi è l'allineamento genico. Questo assicura che l'anticorpo primario reagisca con la biomolecola di interesse e fornisce informazioni su quale epitopo è riconosciuto dall'anticorpo in uno specifico modello animale. L'allineamento genico offre anche la possibilità di scegliere anticorpi in grado di riconoscere gli epitopi conservati evolutivi.

Controlli

Per chiarire la specificità degli anticorpi, un aspetto importante è l'esecuzione dei controlli, che consente di rilevare una colorazione specifica. I controlli includono: i) un tessuto noto per esprimere l'antigene come un controllo positivo; ii) un tessuto noto per non esprimere l'antigene come controllo negativo; iii) l'omissione dell'anticorpo primario o l'assorbimento dell'anticorpo primario con un peptide specifico per confermare che l'anticorpo secondario non reagisce incrociata con altri componenti tissutali14,33.

Nelle tecniche IHC, diversi passaggi possono causare problemi prima di raggiungere la colorazione finale. La forte colorazione del background e la colorazione dell'antigene bersaglio non specifico possono essere causate rispettivamente da biotina endogena o da anticorpi primari/secondari e scarsa attività enzimatica o potenza dell'anticorpo primario. La colorazione di fondo e il legame non specifico possono essere prevenuti bloccando gli enzimi endogeni prima dell'incubazione con l'anticorpo primario. L'utilizzo del siero normale è il modo migliore per bloccare le interazioni non specifiche30. La scelta del buffer di blocco dipende dal metodo di rilevamento utilizzato. Inoltre, un tessuto noto per mancare l'espressione dell'antigene bersaglio come controllo negativo può agire come riferimento per determinare la quantità di colorazione di fondo34. La deposizione di segnale cromogenico o fluorescente nel controllo negativo conferma la presenza di macchie non specifiche. Inoltre, il blocco del tempo di blocco insufficiente porta ad uno sfondo elevato, mentre un blocco eccessivo porta ad un segnale basso35.

Nella colorazione immunoperossia, la presenza di perossidie endogene nel tessuto è un'altra causa di deposizione di sfondo marrone. Il trattamento con H2O2 prima dell'incubazione con l'anticorpo primario blocca la perossidasi endogena36,37. Al contrario, nell'immunofluorescenza, la fissazione svolge un ruolo chiave nella generazione di autofluorescenza. Per evitare l'autofluorescenza, il miglior metodo di fissazione, il tempo di fissazione e la preparazione dei tessuti devono essere scelti con attenzione. Un altro passo critico di IHC è la convalida dell'anticorpo primario. Un anticorpo è considerato valido se produce un modello di colorazione coerente e specifico in un particolare tessuto o componenti cellulari/subcellulari e se il pre-assorbimento dell'anticorpo primario con un peptide specifico non produce colorazione38. Nell'immunofluorescenza, l'associazione non specifica mostra un'intensità fluorescente simile sotto tre rilevatori di fluorescenza a colori, mentre il segnale è variabile poiché vengono utilizzati diversi anticorpi secondari coniugali fluorescenti. Questi aspetti della preparazione dei tessuti IHC e della colorazione degli anticorpi devono essere affrontati per superare i problemi di colorazione.

IHC, anche se una tecnica relativamente semplice, presenta alcune limitazioni e dipendono da molti fattori39. Uno dei punti cruciali è la fissazione formalina, che può alterare l'espressione delle proteine modificate post-traduzione. D'altra parte, i tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina possono essere conservati a lungo termine a temperatura ambiente, mentre i tessuti congelati possono essere conservati solo per un anno a -80 gradi centigradi. Inoltre, i tessuti congelati possono essere danneggiati dalla formazione di cristalli di ghiaccio, che possono influenzare i dettagli subcellulari alterando la colorazione IHC40,41. Per quanto riguarda i nostri studi, l'aspetto più difficile è stato trovare anticorpi primari specifici contro le molecole di pesce zebra. Anche se il pesce zebra è stato riconosciuto come un valido modello animale con un grado altamente conservato di struttura, sono stati sviluppati pochissimi anticorpi in grado di riconoscere specifiche proteine e altre molecole nel pesce zebra. Per superare questi limiti, è importante convalidare la specificità degli anticorpi mediante l'analisi del gonfio occidentale e l'allineamento genico.

Il crescente interesse per i metodi IHC ha portato allo sviluppo di immunostaining altamente specifici che possono aiutare gli studi investigativi42. IHC viene utilizzato con sempre maggiore frequenza per identificare la presenza di specifici marcatori molecolari e i loro cambiamenti attraverso diverse patologie. I due approcci qui illustrati, l'immunoperossiasi e l'immunofluorescenza, hanno rispettivi vantaggi e svantaggi43. Il tessuto incorporato nella paraffina, utilizzato nella tecnica dell'immunoperossidasi, può consentire un'alta risoluzione di cellule e tessuti e rivelare dettagli sulla distribuzione e la quantità di proteine bersaglio44,45. Tuttavia, i tessuti incorporati nella paraffina non sono adatti per l'immunofluorescenza, poiché la paraffina può mascherare l'antigenicità e portare a fluorescenza non specifica46. D'altra parte, la criosezione del tessuto fissato PFA conserva l'antigenicità endogena e porta a una diminuzione della fluorescenza non specifica. Anche se la qualità tecnica delle criosezioni è molto inferiore a quella del tessuto incorporato in paraffina, possono produrre risultati validi utilizzando la tecnica IHC47.

Inoltre, mentre l'incorporamento della paraffina conserva meglio i dettagli morfologici, la crioconservazione conserva meglio l'espressione degli enzimi e degli antigeni, portando a un immunostaining più dettagliato. La tecnica dell'immunofluorescenza permette anche la rilevazione contemporanea di due o tre diverse biomolecole, rivelando possibili interazioni, come illustrato nel nostro precedente lavoro per i sistemi orexin ed endocannabinoidi10. Tra le tecniche utilizzate per rilevare la distribuzione e i livelli di biomolecole specifiche, IHC consente non solo la determinazione dell'espressione morfologica specifica e la distribuzione di molecole e proteine, ma anche la possibilità di eseguire quantitativamente analisi.

Utilizzando l'immunofluorescenza, la codistribuzione e la coespressione delle biomolecole possono anche essere ulteriormente comprese, così come le possibili interazioni e i loro cambiamenti nei casi di diverse patologie48. La microscopia confocale, negli ultimi 20 anni, è stata spesso utilizzata per studiare la distribuzione cellulare e subcellulare di numerose proteine nel cervello dei mammiferi. La microscopia a fluorescenza consente anche la visualizzazione (utilizzando fluorofori o coloranti fluorescenti) di specifiche strutture di interesse, come proteine, organelli e altra materia biologica; tali segnali possono essere utilizzati in sistemi biologici fissi e viventi per immaginare strutture subcellulari specifiche49. La potenziale funzione modulatore delle biomolecole in specifici compartimenti cellulari può essere esplorata attraverso la visualizzazione dei loro modelli di espressione, mentre il ruolo della segnalazione delle proteine all'interno dei tessuti può essere scoperto attraverso la distribuzione neuroanatomica di espressione enzimatica metabolica o recettori.

Il lavoro tecnico presentato introduce approcci IHC, principalmente immunofluorescenza, allo studio di due sistemi altamente conservati, l'orexin e l'endocannabinoide, in un modello di pesce zebra adulto. In particolare, i metodi di immunofluorescenza possono essere utilizzati per determinare la distribuzione, la quantità relativa e le interazioni anatomiche di proteine specifiche nei tessuti bersaglio. La crioconservazione dei tessuti fissi PFA conserva meglio le proteine altamente sensibili suscettibili di un rapido deterioramento. Inoltre, la crioconservazione è pensata per preservare meglio l'antigene e l'antigenicità, e permette di studiare le proteine modificate post-traduzione e il DNA.

Anche se i tessuti congelati (rispetto alle sezioni incorporate in paraffina) sono più spessi, il che ostacola la capacità di osservare in dettaglio la morfologia dei tessuti, la microscopia confocale consente la visualizzazione dei campioni in dettaglio e migliora le capacità di imaging. Inoltre, l'immunofluorescenza può essere utilizzata per l'analisi quantitativa dell'intensità di colorazione, e l'analisi densitometrica del segnale fornisce dati quantitativi. Ciò consente di determinare le correlazioni dei livelli del segnale fluorocroromo con i livelli di espressione delle proteine esaminando le aree di co-localizzazione. Questo lavoro descrive e illustra i protocolli che possono essere utilizzati per studiare la conservazione evolutiva di importanti proteine nel pesce zebra adulto. L'uso dell'IHC, principalmente immunofluorescenza, nel pesce zebra adulto può aiutare a evidenziare l'utilità di questo modello animale nello studio dell'espressione morfologica e della distribuzione di biomolecole altamente conservate, oltre a rivelare possibili alterazioni attraverso diverse condizioni patologiche correlate con la fisiopatologia umana.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Università del Sannio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biochimica Numero 148 immunohistochimica immunoperossiasi recettore dell'orexina recettore endocannabinoide cervello di pesce zebra intestino di pesce zebra
Identificazione dei recettori Orexin ed Endocannabinoidi nei pesci zebra per adulti utilizzando i metodi di immunoperossiasi e immunofluorescenza
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