Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

Die Arzneimittelentwicklung ist ein teurer Prozess. Bevor eine einzige chemische Verbindung von der Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) zugelassen wird, werden mehrere tausend Verbindungen zu einem Preis von über einer Milliarde^Dollar1 gescreent. Während der präklinischen Entwicklung wird der größte Teil dieser Kosten für die^Tierversuche2 benötigt. Um die Kosten zu begrenzen, benötigen Forscher auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung alternative Modelle für das Sicherheitsscreening chemischer Verbindungen³. Daher wäre es in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung sehr vorteilhaft, eine Methode zu verwenden, die die Sicherheit und Toxizität der Verbindungen in einem geeigneten Modell schnell bewerten kann. Es gibt mehrere Protokolle, die für das Toxizitätsscreening von chemischen Verbindungen mit Tier- und Zellkulturmodellen verwendet wurden, aber es gibt kein einziges Protokoll, das validiert ist und häufig verwendet wird^4,5. Vorhandene Protokolle mit Zebrafischen variieren in der Länge und wurden von einzelnen Forschern verwendet, die die Toxizität nach ihrer Bequemlichkeit Anforderung 6^,7,8,9 , ^{10 , 11 , 12}.

In der jüngsten Vergangenheit hat sich der Zebrafisch als ein bequemes Modell für die Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen während der embryonalen Entwicklung^6,7herauskristallisiert. Der Zebrafisch hat viele eingebaute Vorteile für die Bewertung chemischer Verbindungen¹³. Selbst groß angelegte Experimente sind möglich, da ein Zebrafischweibchen Chargen von 200-300 Eiern legen kann, die sich ex vivoschnell entwickeln, bis zu einer Woche keine externe Fütterung benötigen und transparent sind. Die Verbindungen können direkt in das Wasser hinzugefügt werden, wo sie (je nach Art der Verbindung) durch die Chorion und nach dem Schlüpfen, durch die Haut, Kiemen und Mund von Larven diffundieren können. Die Experimente erfordern aufgrund der geringen Größe des Embryos keine großen Mengen chemischer Verbindungen^14. Die Entwicklung von Zebrafischembryonen drückt die meisten Proteine aus, die erforderlich sind, um das normale Entwicklungsergebnis zu erzielen. Daher ist ein Zebrafisch-Embryo ein empfindliches Modell, um zu beurteilen, ob ein potenzielles Medikament die Funktion eines Proteins oder Signalmoleküls stören kann, das entwicklungssignifikant ist. Die Organe der Zebrafische werden zwischen 2-5 dpf¹⁵funktionsfähig, und Verbindungen, die während dieser sensiblen Phase der embryonalen Entwicklung giftig sind, induzieren phänotychen defekte Zebrafischlarven. Diese phäotypischen Veränderungen lassen sich mit einem einfachen Mikroskop ohne invasive Techniken leicht erkennen¹¹. Zebrafisch-Embryonen werden in der toxikologischen Forschung aufgrund ihrer viel größeren biologischen Komplexität im Vergleich zum In-vitro-Arzneimittel-Screening mit Zellkulturmodellen^16,17weit verbreitet.  Als Wirbeltier ist die genetische und physiologische Zusammensetzung von Zebrafischen mit dem Menschen vergleichbar und daher sind die Toxizitäten chemischer Verbindungen zwischen Zebrafischen und Menschen ähnlich^{8,18,19, 20 , 21 , 22}. Zebrafisch ist somit ein wertvolles Instrument in der frühen Phase der Arzneimittelentdeckung zur Bewertung der Toxizität und Sicherheit der chemischen Verbindungen.

In diesem Artikel enthalten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Bewertung der Sicherheit und Toxizität von Kohlensäureanhydrase (CA)-Inhibitorverbindungen unter Verwendung von 1-5-Tage-Zebrafischembryonen (dpf) von einem einzigen Forscher. Das Protokoll beinhaltet die Exposition von Zebrafischembryonen gegenüber verschiedenen Konzentrationen chemischer Inhibitorverbindungen und die Untersuchung der Mortalität und der phänotypischen Veränderungen während der embryonalen Entwicklung. Am Ende der Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen wird die LC 50-Dosis der Chemikalie bestimmt. Das Verfahren ermöglicht es einem Individuum, effizientes Screening von 1-5 Testverbindungen durchzuführen und dauert etwa 8-10 h, abhängig von der Erfahrung der Person mit der Methode (Abbildung 1). Jeder der Schritte, die zur Beurteilung der Toxizität der Verbindungen erforderlich sind, ist in Abbildung 2dargestellt. Die Bewertung der Toxizität von CA-Inhibitoren erfordert 8 Tage und umfasst die Einrichtung von Paarungspaaren (Tag 1); Entnahme von Embryonen aus Zuchttanks, Reinigung und Übertragung in 28,5 °C Brutkasten (Tag 2); Verteilung der Embryonen in die Brunnen einer 24-Well-Platte und Zugabe von verdünnten CA-Hemmerverbindungen (Tag 3); phätagische Analyse und Bildgebung von Larven (Tag 4-8) und Bestimmung der LC_50-Dosis (Tag8).  Diese Methode ist schnell und effizient, erfordert eine kleine Menge der chemischen Verbindung und nur grundlegende Einrichtungen des Labors.

Die Zebrafisch-Kernanlage an der Universität Tampere verfügt über eine Betriebsgenehmigung des National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Alle Experimente mit Zebrafischembryonen wurden nach Angaben der Provinzregierung Ostfinnlands, sozial- und gesundheitspolitische Abteilung des Protokolls der RegionalService Unit von Tampere, LSLH-2007-7254/Ym-23, durchgeführt.

1. Einrichten von Übernacht-Zebrafisch-Mating Tanks

1. Platz 2-5 erwachsene männliche Zebrafische und 3-5 erwachsene weibliche Zebrafische in Paarungsbecken über Nacht. (Die Züchtung wird morgens durch einen automatischen Dunkel- und Lichtzyklus über Nacht induziert).
2. Richten Sie mehrere Kreuze ein, um genügend Embryonen für die Beurteilung der Toxizität von mehr als zwei chemischen Verbindungen zu erhalten. Für die Bewertung der Toxizität benötigt jede Konzentration mindestens 20 Embryonen²³.
3. Um den Umgang mit Stress für die Tiere zu vermeiden, lassen Sie die Tiere 2 Wochen ruhen, bevor Sie dieselben Individuen für die Zucht verwenden.

2. Sammlung von Embryonen und Vorbereitungsplatten für die Exposition gegenüber chemischen Verbindungen

1. Sammeln Sie die Embryonen am nächsten Tag vor Mittag mit einem Feinnetzsieb und übertragen Sie sie auf eine Petrischale mit E3-Embryomedium [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄und 0,1% w/v Methylenblau].
2. Entfernen Sie Denreste mit einer Pasteur-Kunststoffpipette (z. B. Lebensmittel und feste Abfälle). Untersuchen Sie jede Charge von Embryonen unter dem Stereomikroskop, um die unbefruchteten/toten Embryonen zu entfernen (identifiziert durch ihr undurchsichtiges Aussehen).
3. Bewahren Sie die Embryonen bei 28,5 °C in einem Inkubator auf. Untersuchen Sie die Embryonen am nächsten Morgen unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie alle ungesunden oder toten Embryonen. Ersetzen Sie auch das alte E3 Medium durch frisches E3 Medium.
   HINWEIS:Zebrafischembryonen werden unter Laborbedingungen immer bei 28,5 °C gehalten.
4. Übertragen Sie vorsichtig 1 Embryo in jeden Brunnen einer 24-Well-Platte, die genügend E3-Medium enthält, um die Embryonen zu bedecken.

3. Zubereitungen der Lagerlösung chemischer Verbindungen und Verteilung von verdünnten Verbindungen in die Brunnen

1. Nehmen Sie die Fläschchen mit Inhibitorverbindungen heraus, die bei 4 °C gespeichert sind.
   HINWEIS: Je nach Eigenschaften der Verbindung werden diese bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert.
2. Wiegen Sie die Verbindung(en) mit einem analytischen Gleichgewicht, das ein paar Milligramm (mg) der Verbindung genau wiegen kann.
3. Bereiten Sie für jede Verbindung mindestens 250 l (100 mM) Der Stammlösung in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. E3-Wasser oder Dimethylsulfoxid (DMSO) auf der Grundlage der Löslichkeitseigenschaften der Verbindungen vor.
   ANMERKUNG: Die oben genannten Schritte können einen Tag vor Beginn des Experiments zu einem günstigen Zeitpunkt durchgeführt und bei 4 °C gespeichert werden).
4. Machen Sie serielle Verdünnungen der Lagerlösungen (z. B. 10 m, 20 m, 50 m, 100 M, 150 M, 300 m und 500 m) mit E3-Wasser in 15 ml Zentrifugenrohren.
   ANMERKUNG: Die Konzentrationen und die Anzahl der seriellen Verdünnungen variieren je nach Toxizität von einer Verbindung zur anderen.
5. Entfernen Sie aus der 24 Brunnenplatte, die Embryonen enthält, E3-Wasser aus den Brunnen mit einer Pasteurpipette und einer 1 ml Pipette (mit 1 dpf-Embryonen) eine Reihe nach der anderen.
6. 1 ml jedes Verdünnungsverdünnungsguts in jedem Brunnen (von niedriger ergehend und in höhere Konzentration) in die Brunnen der 24-Well-Platte verteilen.
7. Richten Sie eine Kontrollgruppe aus derselben Charge von Embryonen ein, und fügen Sie die entsprechende Menge an Verdünnungsmittel hinzu.
8. 24-Well-Platten mit dem Namen und der Konzentration der Verbindung beschriften und die Platten bei 28,5 °C in einem Inkubator aufbewahren.

4. Phänotypische Analyse und Bildgebung der Embryonen mit einem Stereomikroskop

1. Untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereomikroskop auf Parameter 24 h nach Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen.
   1. Beachten Sie die Parameter wie Sterblichkeit, Schlüpfen, Herzschlag, Verwendung von Eigelbsack, Schwimmen Blase Entwicklung, Bewegung der Fische, Perikardödem, und Form des Körpers²³.
   2. Nehmen Sie die Larven, die jeder Konzentration der Verbindung ausgesetzt sind, und legen Sie sie seitlich in einer kleinen Petrischale, die 3% hochmolekulare Methylcellulose enthält, mit einer Metallsonde.
      ANMERKUNG: Die 3% Methylcellulose (hochmolekular mit) ist eine viskose Flüssigkeit, die für die Einbettung der Fische mit einer erforderlichen Ausrichtung für die mikroskopische Untersuchung benötigt wird. Zur Orientierung der Fische in dieser Flüssigkeit wird eine Metallsonde benötigt.
   3. Nehmen Sie die Bilder mit Stereomikroskop an einer Kamera befestigt. Speichern Sie die Bilder jeden Tag bis zum Ende des Experiments in einem separaten Ordner.
   4. Geben Sie alle Beobachtungen in einer Tabelle jeden Tag entweder in einer Onlinetabelle oder auf einem gedruckten Blatt ein.
   5. Wenn die Verbindungen neurotoxisch sind, können die 4 bis 5 dpf Larven veränderte Schwimmmuster zeigen, machen Sie eine Aufzeichnung solcher Veränderungen entweder durch die Aufnahme eines kurzen (30 s bis 1 min) Video der Larven, die abnormale Bewegungsmuster aufweisen.
   6. Beachten Sie nach 5 Tagen Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen die Konzentration, bei der die Hälfte der Embryonen stirbt, um die halbmaximale tödliche Konzentration 50 (LC₅₀) jeder Chemikalie zu berechnen.
      ANMERKUNG: Der LC₅₀ ist die Konzentration, bei der 50% der Embryonen am Ende von 5 Tagen der Exposition gegenüber einer chemischen Verbindung sterben. Verwenden Sie mindestens 20 Embryonen, um die Toxizität jeder Konzentration einer Verbindung zu testen²³.
   7. Konstruieren Sie eine Kurve für die Sterblichkeit von Embryonen für alle Konzentrationen mit einem geeigneten Programm.

Der entscheidende Teil der Bewertung der Toxizität ist die Prüfung verschiedener Konzentrationen einer oder mehrerer chemischer Verbindungen in einem einzigen Experiment. Wählen Sie zu Beginn die Verbindungen für die Bewertung der Toxizität, die Anzahl der zu testenden Konzentrationen für jede Verbindung aus, und erstellen Sie dementsprechend ein Diagramm (Abbildung 3). Wir haben für jede Verbindung eine eindeutige Farbe verwendet, um die Proben zu organisieren (Abbildung 3). Die Verwendung von lösungsmittelbeständigen Markern und Der Beschriftung an der Unterseite oder den Seiten der Platten ist wichtig, um eine verwechslung später zu vermeiden.  Wenn die Verbindungen phänotypische Defekte in den Larven induzieren, die unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen ausgesetzt sind, werden die Defekte alle 24 h über den Zeitraum von 1-5 dpf aufgezeichnet (Abbildung 4A,B,C,D). Die Embryonen, die mit einem bekannten CA-IX-Inhibitor in einer Konzentration von 500 m behandelt wurden, zeigten keine offensichtlichen phänotypischen Veränderungen in den 1-5 Tagen der Exposition gegenüber der chemischen Verbindung (Abbildung 4B). Abbildung 4C und Abbildung 4D zeigen die Embryonen, die mit A-CA-Inhibitoren behandelt wurden, die verschiedene phänotypische Defekte ungeschlüpfte Embryonen auch an Tag 3 (Pfeilkopf), gekrümmter Körperstruktur (Pfeil), ungenutztem Eigelbsack und Perikardödem (Pfeilkopf) induzierten. und Abwesenheit von Otolithsäcken in den Larven nach 5 Tagen nach der Behandlung mit chemischer Verbindung (Pfeil). In einer anderen Studie zeigen die mit CA-Hemmerbehandelten behandelten Embryonen (Abbildung 4E) das Fehlen von Otolithsäcken und Schwimmblase (Pfeilspitzen). In unserer Studie (Abbildung 4C,D) dokumentierten wir phänotypische Defekte (fragile Embryonen und Abwesenheit von Pigmentierung) auch nach Tag 1 der Exposition gegenüber CA-Hemmern. Die phänotypischen Analysen zeigten, dass einige der Inhibitorverbindungen tödlich sind und nicht als Arzneimittel für den menschlichen Gebrauch entwickelt werden können (Abbildung 4C, D und Tabelle 1).

Die Experimente identifizierten eine repräsentative Verbindung, die minimale oder keine phänotypischen Veränderungen während der embryonalen Entwicklung induzierte und eine hohe LC50-Dosis zeigte ( Abbildung5), was darauf hindeutet, dass die Verbindung für die weitere Charakterisierung und kann potenziell zu einem Arzneimittelkandidaten für den menschlichen Gebrauch entwickelt werden16. Ein Blick auf Standbilder von Larven, die der Verbindung ausgesetzt waren, zeigte keine phänotypischen Defekte (Abbildung 4B). Jedoch, die gleiche Verbindung wurde festgestellt, dass neurotoxisch und induzierte Ataxie in den Larven nach 5-Tage der Exposition gegenüber dem CA-Hemmer (Abbildung6). Dieser Phänotyp konnte nur durch direkte Beobachtung des Schwimmverhaltens der Zebrafischlarven unter dem Mikroskop nachgewiesen werden. Diese Studien legten nahe, dass die neuronale Entwicklung von Zebrafischlarven empfindlich auf die Verbindung16,17ist.

Abbildung 1: Zeit in Stunden, die für das schnelle Screening chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen erforderlich ist: In einer Reihe von Experimenten kann eine Person mit praktischer Erfahrung etwa 5 chemische Verbindungen (jede Verbindung, die mindestens 6 Verdünnungen erfordert) mit Zebrafischembryonen in 24-Well-Platten überprüfen. Insgesamt dauert es etwa 8-10 h vom Aufstellen von Kreuzen bis zur Durchführung LC50 Bestimmung über einen Zeitraum von 8 Tagen.

Abbildung 2: Diagramm, das den Abbau der Toxizitätsbewertung chemischer Verbindungen zeigt. Toxizitätsscreening von chemischen Verbindungen dauert 8 Tage und kann in fünf Schritte unterteilt werden. (Tag 1) Besteht aus der Einrichtung von Zebrafisch-Paarungspaaren in Tanks. (Tag 2) Beinhaltet das Sammeln von Embryonen aus den Paarungstanks in Petrischalen, gefolgt von der Aufbewahrung in einem 28,5 °C-Inkubator für die Nacht. (Tag 3) Untersuchung von Embryonen mit einem Stereomikroskop und Reinigung der Embryonen. Verteilung der Embryonen in 24-Well-Platten und Zugabe der Verdünnungen der Testverbindungen. (Tag 4-8) Phänotypische Analysen von Larven auf Entwicklungsdefekte. Am letzten Tag der Exposition gegenüber Verbindungen wurde eine Schwimmmusterstudie und LC 50-Bestimmung durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung von Experimenten, die an der Toxizitätsbewertung beteiligt sind. Die Toxizitätsbewertung besteht darin, tabellarische Diagramme mit Informationen über chemische Verbindungen, Verdünnungen der zu bewertenden Verbindungen und zu bewertende Parameter zu erstellen. Verdünnung von Stammlösungen auf die gewünschten Konzentrationen in 15 ml Zentrifugenrohren (verdünnung aus einem Rohr, das jeder Reihe der 24-Well-Platte zugesetzt wird). Eine 24-Well-Platte, die mit einem wasserfesten Marker mit dem Namen der Prüfverbindung, der Konzentration in jeder Reihe und dem Expositionsdatum gekennzeichnet ist. Untersuchung und Abbildung von Embryonen durch Übertragung der Larven auf eine kleine Petrischale mit 3% hochmolekularer Methylcellulose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiel für die phänotypische Analyse der Larven in den kontroll- und testcompoundbehandelten Gruppen. (A) Phenotypchenanalysen der Kontrollgruppenlarven, die nicht mit einer Verbindung behandelt wurden, zeigten keinen phänotypischen Defekt unter dem Mikroskop. (B) Larven, die mit einem 500-M-CA-Hemmer behandelt wurden (bekannter Inhibitor der Kohlensäureanhydrase IX zeigte keine beobachtbaren phänotypischen Defekte. (C, D) Die sich entwickelnden Larven, die mit dem Ca-Inhibitor mit Konzentrationen von 250 bzw. 125 M behandelt wurden. Die Verbindungen induzierten phänotypische Defekte wie gekrümmten Körper, Perikardödem und ungenutzten Dottersack (Pfeile und Pfeilspitzen). Die Panels A und B wurden von Aspatwar et al16geändert. Die Panels C, D und E zeigen bisher unveröffentlichte Bilder, die mit einem anderen Mikroskop gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Bestimmung der tödlichen Konzentration 50 (LC50) mit 1-5 dpf Zebrafischlarven. Die Toxizitätsbewertung mit Zebrafischembryonen ermöglicht es den Forschern, die minimale tödliche Konzentration der chemischen Verbindung am Ende des Experiments zu bestimmen.  Die LC 50-Konzentration der Verbindung (ein bekannter CA-IX-Hemmer) betrug 3,5 mM. Die hohe LC 50-Konzentration ermöglicht eine weitere Charakterisierung der Verbindung. Diese Zahl wurde von Aspatwar et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Ein Beispiel für die Analyse des Schwimmmusters sowohl in unbehandelten (A) als auch in behandelten (B) Larvengruppen. Die zebrafischlarven, die in Panel B mit einer 300-M-Testinhibitor-Verbindung (ein bekannter Inhibitor der menschlichen Kohlensäure-Anhydrase IX) behandelt wurden, zeigten ein abnormales (ataxic)-Bewegungsmuster (Pfeilspitzen), was darauf hindeutet, dass die Verbindung neurotoxizitätin den sich entwickelnden Embryonen induziert. . Die Pfeilspitzen zeigen auf die normale Krümmung des Schwanzes während des Schwimmens. In Panel A zeigen die Pfeile auf die normale Krümmung des Schwanzes während des Schwimmens. Diese Zahl wurde von Aspatwar et al.16geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Eine Zusammenfassung der Sicherheit und Toxizität der gesiescreenten Verbindungen. Das Toxizitätsbewertungsexperiment hilft dem Forscher, eine Schlussfolgerung über die Sicherheit der getesteten chemischen Verbindungen zu ziehen. Die LC 50-Konzentration ermöglicht die Definition einer sicheren Konzentration für die weitere Charakterisierung. Ein Forscher kann entscheiden, ob die Verbindung auch nach 24 h Exposition von Embryonen gegenüber der untersuchten Verbindung tödlich ist. In unserem Beispiel ist eine subtile Wirkung auf das Schwimmen aufgrund der Neurotoxizität die signifikante Information, die für die Einrichtung weiterer Experimente hilfreich ist. Dementsprechend konnten wir auf der Grundlage des Toxizitätsscreenings sichere Konzentrationen des CA-Inhibitors zur weiteren Charakterisierung in vivo24verwenden.

Die Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.