Method Article

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

DOI:

10.3791/59315

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August 25th, 2019

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1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital, 3Fimlab Ltd, Tampere University Hospital

In This Article

Summary

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Zebrafisch-Embryonen werden zur Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen verwendet. Sie entwickeln sich extern und reagieren empfindlich auf Chemikalien, was den Nachweis subtiler phäotypischer Veränderungen ermöglicht. Das Experiment benötigt nur eine geringe Menge an Verbindung, die direkt auf die Platte mit Embryonen zugesetzt wird, was das Testsystem effizient und kostengünstig macht.

Abstract

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Der Zebrafisch ist ein weit verbreiteter Wirbeltiermodellorganismus für die Krankheit und phänotypbasierte Arzneimittelentdeckung. Der Zebrafisch erzeugt viele Nachkommen, hat transparente Embryonen und eine schnelle äußere Entwicklung. Zebrafisch-Embryonen können daher auch für die schnelle Bewertung der Toxizität der Medikamente verwendet werden, die wertvoll sind und in kleinen Mengen erhältlich sind. In diesem Artikel wird ein Verfahren zum effizienten Screening der Toxizität chemischer Verbindungen mit 1-5-Tage-Embryonen nach der Befruchtung beschrieben. Die Embryonen werden durch Stereomikroskop überwacht, um die phänotypischen Defekte zu untersuchen, die durch die Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Verbindungen verursacht werden. Halbmaximale tödliche Konzentrationen (LC50) der Verbindungen werden ebenfalls bestimmt. Die vorliegende Studie erforderte 3-6 mg einer Inhibitorverbindung, und das ganze Experiment dauert etwa 8-10 h, um von einer Person in einem Labor mit grundlegenden Einrichtungen abgeschlossen werden. Das aktuelle Protokoll eignet sich zum Testen jeder Verbindung, um unerträgliche toxische oder zielferne Wirkungen der Verbindung in der frühen Phase der Arzneimittelentdeckung zu identifizieren und subtile toxische Wirkungen zu erkennen, die in der Zellkultur oder anderen Tiermodellen übersehen werden können. Die Methode reduziert Verfahrensverzögerungen und Kosten der Arzneimittelentwicklung.

Introduction

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Die Arzneimittelentwicklung ist ein teurer Prozess. Bevor eine einzige chemische Verbindung von der Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) zugelassen wird, werden mehrere tausend Verbindungen zu einem Preis von über einer MilliardeDollar1 gescreent. Während der präklinischen Entwicklung wird der größte Teil dieser Kosten für dieTierversuche2 benötigt. Um die Kosten zu begrenzen, benötigen Forscher auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung alternative Modelle für das Sicherheitsscreening chemischer Verbindungen3. Daher wäre es in der frühen Phase der Arz....

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Protocol

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Die Zebrafisch-Kernanlage an der Universität Tampere verfügt über eine Betriebsgenehmigung des National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Alle Experimente mit Zebrafischembryonen wurden nach Angaben der Provinzregierung Ostfinnlands, sozial- und gesundheitspolitische Abteilung des Protokolls der RegionalService Unit von Tampere, LSLH-2007-7254/Ym-23, durchgeführt.

1. Einrichten von Übernacht-Zebrafisch-Mating Tanks

  1. Platz 2-5 erwachsene männliche Zebrafische und 3-5 erwachsene weibliche Zebrafische in Paarungsbecken über Nacht. (Die Züchtung wird morgens durch einen automatischen Dunkel- und Lichtzyklus über Nacht....

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Results

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Der entscheidende Teil der Bewertung der Toxizität ist die Prüfung verschiedener Konzentrationen einer oder mehrerer chemischer Verbindungen in einem einzigen Experiment. Wählen Sie zu Beginn die Verbindungen für die Bewertung der Toxizität, die Anzahl der zu testenden Konzentrationen für jede Verbindung aus, und erstellen Sie dementsprechend ein Diagramm (Abbildung 3). Wir haben für jede Verbindung eine eindeutige Farbe verwendet, um die Proben zu organisier.......

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Discussion

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In-vitro-Toxizitätstests mit kultivierten Zellen können Überlebens- und morphologische Studien der Zellen erkennen, die begrenzte Informationen über die durch die Testverbindung induzierte Toxizität liefern. Der Vorteil des Toxizitätsscreenings chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen ist der schnelle Nachweis chemisch induzierter phänotischer Veränderungen bei einem ganzen Tier während der embryonalen Entwicklung in einem relevanten Modellorganismus. Ungefähr 70% der proteinkodierenden menschlichen Gene .......

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Disclosures

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Die Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.

Acknowledgements

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Die Arbeit wurde durch Stipendien der Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), der Finnischen Kulturstiftung (AA, MH), der Akademie Finnlands (SP, MP), der Orion Farmos Foundation (MH), der Tampere Tuberculosis Foundation (SP, MH und MP) und Der Jane and Aatos Erkko Foundation (SP und MP) unterstützt. ). Wir danken unseren italienischen und französischen Mitarbeitern, Prof. Supuran und Prof. Winum, für die Bereitstellung von Kohlensäure-Anhydrase-Inhibitoren für die Sicherheits- und Toxizitätsbewertung für Anti-TB- und Anti-Krebs-Medikamente-Entwicklungszwecke. Wir danken Aulikki Lehmus und Marianne Kuuslahti für die technische Unterstützung. Wir danken auch Leena Mäkinen....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24-Well-PlattenNuncThermo Scientific
Waage (Waage)KERNPLJ3000-2CM
Waage (Waage)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT. BakerRS421910024
ZerlegesondeThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, DeutschlandD4540
Falcon Röhrchen 15 mLGreiner bio-one188271
Hochmolekulare MethylcelluloseSigma Aldrich, DeutschlandM0262 
Brutkasten für ZebrafischlarvenTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Methyl BlueSigma Aldrich, Deutschland28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, DeutschlandM7506
MikrozentrifugenröhrchenStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemikalien27810.295
Paraffin Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteurpipette Sarstedt86.1171
PetrischaleThermo Scientific101R20 
PetriplattenSarstedt82.1473
Pipette (1 mL und 200 μ L)Thermo Scientific4641230N, 4641210N   
Platten 24-WellThermo Scientific142485
Steriomikroskop/KameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105
(1,5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB StämmeZIRK   ZL1 
Farbfläschchen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
  2. Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A.....

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Zebrafish EmbryosToxicity ScreeningLC50 DeterminationStereomicroscope AnalysisSerial DilutionPhenotypic DefectsEmbryo MediumChemical CompoundsDrug DiscoveryEmbryo Mortality

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