Summary
斑马鱼胚胎用于评估化合物的毒性。它们从外部发展，对化学品敏感，能够检测细微的型型变化。实验只需要少量的化合物，直接添加到含有胚胎的板中，使测试系统高效且经济高效。
Abstract
斑马鱼是一种广泛使用的脊椎动物模型生物体，用于疾病和表型药物发现。斑马鱼产生许多后代，具有透明的胚胎和快速的外部发育。因此，斑马鱼胚胎也可用于快速评估珍贵和小批量药物的毒性评估。本文介绍了一种利用1-5天受精后胚胎有效筛选化合物毒性的方法。胚胎通过立体显微镜进行监测，以调查因接触不同浓度化合物而导致的型板状缺陷。也确定了化合物的半最大致命浓度（LC50）。本研究需要3-6毫克的抑制剂化合物，整个实验大约需要8-10小时，由一个人在实验室有基本设施完成。目前的规程适用于测试任何化合物，以识别该化合物在药物发现的早期阶段的不可容忍的毒性或脱靶效应，并检测细胞培养或其他动物模型中可能遗漏的细微毒性影响。该方法减少了药物开发的程序性延迟和成本。
Introduction
药物开发是一个昂贵的过程。在单一化合物获得美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准之前，对数千种化合物进行筛选，费用超过10亿美元。在临床前开发期间，大部分费用是动物试验2需要的。为了限制成本，药物开发领域的研究人员需要替代模型来对化合物进行安全筛选3。因此，在药物开发的早期阶段，使用一种能以合适的模型快速评估化合物的安全性和毒性的方法是非常有益的。有几个协议已经用于涉及动物和细胞培养模型的化合物的毒性筛选，但没有一个协议被验证，并共同使用4，5。使用斑马鱼的现有协议长度不同，个别研究人员根据其便利性要求6、7、8、9评估毒性。10,11,12.
近段时间，斑马鱼已成为评估胚胎发育6、7号过程中化合物毒性的便捷模型。斑马鱼在评价化合物13方面有许多内在优势。即使是大规模的实验也是可以的，因为斑马鱼雌性可以产下200-300个卵子，这些卵子在外发育迅速，不需要外部喂养长达一周，而且透明。化合物可以直接添加到水中，在那里它们可以（取决于化合物的性质）通过幼虫扩散，孵化后，通过幼虫的皮肤，刺和嘴。由于胚胎体积小，实验不需要大量的化合物14。开发斑马鱼胚胎表达实现正常发育结果所需的大部分蛋白质。因此，斑马鱼胚胎是一个敏感的模型，用于评估潜在的药物是否会干扰具有发育意义的蛋白质或信号分子的功能。斑马鱼的器官在2-5 dpf15之间发挥作用，在这个胚胎发育的敏感时期有毒的化合物会导致斑马鱼幼虫的表型缺陷。这些型状变化可以很容易地检测使用简单的显微镜没有侵入性技术11。斑马鱼胚胎被广泛用于毒理学研究，因为它们的生物复杂性比使用细胞培养模型16、17的体外药物筛选要复杂得多。 作为一种脊椎动物，斑马鱼的遗传和生理组成与人类相当，因此斑马鱼和人类之间的化合物毒性相似。20,21,因此，斑马鱼是药物发现早期评估化合物毒性和安全性的宝贵工具。
在本文中，我们详细介绍了单个研究人员使用1-5天后受精（dpf）斑马鱼胚胎评估碳氢合酶（CA）抑制剂化合物的安全性和毒性的方法。该协议涉及将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的化学抑制剂化合物中，并研究胚胎发育过程中的死亡率和样型变化。在接触化合物结束时，确定该化学品的LC50剂量。该方法允许个人对1-5种测试化合物进行有效筛选，并根据需要使用该方法的人的经验需要8-10小时（图1）。图2概述了评估化合物毒性所需的每个步骤。CA抑制剂的毒性评估需要8天，包括建立交配对（第1天）;从繁殖罐中收集胚胎，清洗并转移到28.5°C培养箱（第2天）;将胚胎分配到24孔板的井中，并加入稀释的CA抑制剂化合物（第3天）;幼虫的型板分析和成像（第4-8天），以及LC50剂量（第8天）的测定。 该方法快速高效，需要少量的化合物和实验室的基本设施。
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Protocol
坦佩雷大学的斑马鱼核心设施拥有国家动物实验委员会（ESAVI/7975/04.10.05/2016）颁发的机构授权。所有使用斑马鱼胚胎的实验都按照东芬兰省政府、坦佩雷地区服务部社会和卫生部协议——LSLH-2007-7254/Ym-23进行。
1. 设置夜间斑马鱼交配罐
- 将2-5只成年雄性斑马鱼和3-5只成年雌性斑马鱼放入交配池过夜。（在早晨由自动黑暗和光循环诱导过夜）。
- 设置几个十字架，以获得足够的胚胎来评估两种以上化合物的毒性。为了评估毒性，每个浓度至少需要20个胚胎23个。
- 为了避免处理动物的压力，让动物休息2周，然后使用相同的个体进行繁殖。
2. 收集胚胎和准备板以接触化合物
- 收集胚胎，第二天中午前，使用细网滤网，并移植到含有E3胚胎培养基[5.0 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2， 0.33 mM MgSO4，和0.1% w/v甲基蓝] 。
- 使用塑料巴斯德移液器清除碎屑（例如食品和固体废物）。在立体显微镜下检查每批胚胎，以取出未受精/死亡的胚胎（由其不透明外观识别）。
- 将胚胎保持在28.5°C的培养箱中。第二天早上，在立体显微镜下检查胚胎，取出任何不健康或死亡的胚胎。此外，用新鲜的 E3 介质替换旧的 E3 介质。
注：斑马鱼胚胎在实验室条件下始终保持在28.5°C。 - 小心地将1个胚胎移植到含有足够E3介质的24孔板的每个孔中，以覆盖胚胎。
3. 化合物库存溶液的制剂和稀释化合物在井中的分布
- 拿出储存在4°C处的含有抑制剂化合物的瓶。
注：根据化合物的特性，这些储存在不同的温度下。 - 使用可精确称量几毫克（毫克）的分析平衡来称称化合物。
- 根据化合物的溶解度特性，在适当的溶剂中为每个化合物（例如E3水或二甲基硫酸盐（DMSO）制备至少250μL（100 mM）的库存溶液。
注：上述步骤可在实验开始前一天在方便的时候完成，并储存在4°C）。 - 在 15 mL 离心管中使用 E3 水对库存溶液进行连续稀释（例如，10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、300 μM 和 500 μM）。
注：连续稀释的浓度和数量因化合物的不同而不同，具体取决于其毒性水平。 - 从含有胚胎的24个孔板中取出E3水，使用巴斯德移液器和1mL移液器（包含1个dpf胚胎）一次一排。
- 将每口井中每口稀释剂的1 mL（从较低开始，移动到更高浓度）分配到24孔板的孔中。
- 从同一批胚胎中设置一个对照组，并添加相应数量的稀释剂。
- 将24孔板标上化合物的名称和浓度，并将板保持在28.5°C的培养箱中。
4. 使用立体显微镜对胚胎进行体形分析和成像
- 在接触化合物后24小时，在立体显微镜下检查胚胎的参数。
- 注意参数，如死亡率，孵化，心跳，使用蛋黄袋，游泳膀胱发展，鱼的运动，心包水肿，和身体的形状23。
- 将接触于化合物每种浓度的幼虫，用金属探针侧身放在含有3%高分子量甲基纤维素的小培养皿中。
注：3%甲基纤维素（高分子带）是嵌入鱼类所需的粘性液体，具有进行显微检查所需的方向。为了将鱼定向到这种液体中，需要一个金属探头。 - 使用连接到相机的立体显微镜拍摄图像。每天将图像保存在单独的文件夹中，直到实验结束。
- 每天在联机表中或打印的工作表中输入表中的所有观测值。
- 如果化合物是神经毒性的，4到5 dpf幼虫可能显示改变的游泳模式，通过捕捉显示异常运动模式的幼虫的短视频（30秒至1分钟）来记录这种变化。
- 接触化合物5天后，注意一半的胚胎死亡浓度，以计算每种化学品的半最大致命浓度50（LC50）。
注：LC50是50%的胚胎在接触化合物5天后死亡的浓度。使用至少20个胚胎来测试每个浓度化合物23的毒性。 - 使用合适的程序构建胚胎所有浓度的死亡率曲线。
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Representative Results
毒性评价的关键部分是在一个实验中测试一种或多种化合物的不同浓度。在开始时，选择用于评估毒性的化合物，测试每种化合物的浓度数量，并据此制作一个图表（图3）。我们为每个化合物使用独特的颜色来组织样品（图3）。使用耐溶剂标记和在板的底部或侧面的标签是重要的，以避免以后的混合。 如果化合物诱导接触不同浓度抑制剂的幼虫出现任何型型缺陷，则在1-5 dpf期间每24小时记录一次缺陷（图4A、B、C、D）。在500μM浓度下用已知CA IX抑制剂处理的胚胎在1-5天暴露于化合物时没有表现出任何明显的表型变化（图4B）。图 4C和图 4D显示了使用 β-CA 抑制剂治疗的胚胎，即使在第 3 天（箭头）、弯曲的身体结构（箭头）、未使用的蛋黄袋和心外水肿（箭头）时，也诱发各种表型缺陷未孵化的胚胎使用化合物（箭头）治疗后5天，幼虫体内无耳塞囊。在另一项研究中，使用CA抑制剂（图4E）治疗的胚胎显示，没有乳囊和游泳膀胱（箭头）。在我们的研究中，（图4C，D），我们记录了型型缺陷（脆弱的胚胎和缺乏色素沉着），即使在第一天暴露于CA抑制剂。表型分析表明，一些抑制剂化合物是致命的，不能作为人类使用的药物开发（图4C，D和表1）。
实验确定了在胚胎发育过程中引起最小或无表型变化的代表性化合物，并显示出高LC50剂量（图5），表明该化合物可以安全进行进一步表征和有可能发展成供人类使用的药物候选者16。查看暴露于化合物的幼虫的静止图像显示没有表型缺陷（图4B）。然而，在接触CA抑制剂5天后，发现同一化合物是神经毒性的，并诱发幼虫的失常症（图6）。这种表型只能通过直接观察显微镜下斑马鱼幼虫的游泳行为来检测。这些研究表明，斑马鱼幼虫的神经发育对化合物16、17敏感。
图1：使用斑马鱼胚胎快速筛选化合物所需的时间：在一组实验中，一个有实践经验的人可以使用斑马鱼胚胎在24孔板中筛选大约5种化合物（每种化合物至少需要6个稀释物）。总共需要8-10小时，从设置十字架到在8天内执行LC50测定。
图2：图表显示化合物毒性评价的细目。化合物的毒性筛选需要8天，可以分为五个步骤。（第1天）包括在水箱中设置斑马鱼交配对。（第2天）包括从交配罐中收集胚胎到培养皿中，然后将它们保存在28.5°C的培养箱中过夜。（第3天）使用立体显微镜检查胚胎并清洁胚胎。将胚胎分配到24孔板中，并加入试验化合物的稀释。（第4-8天）幼虫发育缺陷的质变分析。游泳模式研究和LC50测定是在接触化合物的最后一天进行的。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：毒性评价实验的原理图。毒性评估包括编制表格图，其中载有有关化合物、化合物稀释和要评估的参数的信息。使库存溶液稀释到15 mL离心管中所需浓度（从一根管中稀释到24孔板的每一行）。标有测试化合物名称、每行浓度和暴露日期的 24 孔板。通过将幼虫转移到含有3%高分子量甲基纤维素的小培养皿中，对胚胎进行检查和成像。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：对照和试验复合处理组幼虫的类容分析实例。（A） 未用任何化合物处理的对照组幼虫的表型分析显示，在显微镜下没有表型缺陷。（B） 用500μM CA抑制剂（已知碳氢化物九抑制剂IX处理的幼虫无可观察到的表型缺陷）。（C， D）使用β-CA抑制剂处理的发育中的幼虫，浓度分别为250μΩ和125μM。这些化合物诱发表型缺陷，如弯曲的身体、心包水肿和未使用的蛋黄囊（箭头和箭头）。小组A和B已由阿斯帕特瓦尔等人16修改。面板C，D和E显示以前未发表的图像，这是使用不同的显微镜获得。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5：使用1-5 dpf斑马鱼幼虫测定致命浓度50（LC50）。使用斑马鱼胚胎进行毒性评估，使研究人员在实验结束时确定该化合物的最低致命浓度。 该化合物的LC50浓度（一种已知的CA IX抑制剂）为3.5 mM。高LC50浓度允许进一步表征化合物。这个数字已由阿斯帕特瓦尔等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：未经处理的（A）和抑制剂处理（B）类幼虫的游泳模式分析示例。在B组用300μM试验抑制剂化合物（人类碳氢酶IX的已知抑制剂）处理的斑马鱼幼虫显示出异常（ataxic）运动模式（箭头），表明该化合物在发育中的胚胎中诱导神经毒性.箭头指向游泳期间尾部的正常曲率。在面板 A 中，箭头指向游泳期间尾部的正常曲率。这个数字已由阿斯帕特瓦尔等人16日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
| CA 抑制剂 | 毒性筛选 | LC50 | 体内 | 有毒卡利 | 参考 |
| 卡巴队友 | 24 | 所有 | 1a | 3b | 24， 未发布 |
| 香 豆 素 | 10 | 所有 | - | 2 | 发表 |
| 氮氧化物 | 2 | 所有 | 2 | 2c | 16 |
| 硫磺胺 | 5 | 所有 | - | 3 | 25 |
| 总 | 41 | 所有 | 3 | 10 | - |
| a在毒性筛选的基础上，在斑马鱼模型中，该抑制剂用于抑制海龙分枝杆菌。b致命抑制剂，c 神经毒性超过300μM浓度 | |||||
表1：筛选化合物的安全性和毒性摘要。毒性评价实验有助于研究者对被测化合物的安全性得出结论。LC50浓度允许定义安全浓度以进一步表征。研究人员可以决定，即使胚胎暴露在被调查的化合物中24小时后，该化合物是否致命。在我们的示例中，由于神经毒性对游泳的微妙影响是重要信息，这有助于建立进一步的实验。因此，根据毒性筛选，我们能够使用CA抑制剂的安全浓度在体内进一步表征24。
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Discussion
使用培养细胞进行体外毒性试验，可以检测细胞的生存和形态学研究，提供有关试验化合物引起的毒性的有限信息。利用斑马鱼胚胎对化合物进行毒性筛选的优点是，在相关模型生物体胚胎发育过程中，可快速检测整个动物的化学诱导型态变化。大约70%的蛋白质编码人类基因在斑马鱼基因组中具有正交对应物。控制信号转导和发育的遗传途径在人和斑马鱼26之间高度保存，因此，化合物很可能在人类身上产生类似的毒性作用。
斑马鱼处于毒理学研究的前沿，已经广泛用于检测水样中的毒素，研究环境毒素的作用机制及其对动物的影响。在本文中，我们展示了在药物发现的早期阶段使用开发斑马鱼胚胎来评估潜在化合物的毒性。我们的快速和多层面的毒性评估基于1）在胚胎期间生物体的表型变化（孵化、耳塞囊、心包水肿、蛋黄囊利用、诺索德发育、心跳、游泳膀胱发育、运动）在5天和2）确定致命浓度（LC50）期间的发展。合理的动手时间（8-10小时分8天）足以确定使用本程序的化合物的毒性状况。对于数量有限的新合成化合物，可以使用至少3mg的化合物来评估毒性。无需特殊设备。因此，这个程序是评估任何可能开发成供人类使用的药物的任何化合物的毒性影响的一种快速和低成本的方法。
这批胚胎的质量对实验结果有很大的影响。从繁殖罐收集后，卵子的质量（包括受精率）并不明显（0-4 hpf）。为了只获得正常发育的胚胎用于实验，在添加化合物之前，我们允许胚胎在从育种罐中收集后保持28.5°C24小时。24 hpf 后，任何死亡或看起来不健康的胚胎被丢弃。除此之外，建议在每个实验中采用一组模拟处理的胚胎，以进一步控制实验中使用的卵子的质量，并查看基线死亡率，以准确确定LC50。
还需要一个模拟处理组来控制所选择车辆的毒性。许多化学品不溶于水，DMSO 常被用作交付测试化合物的工具。DMSO通常被低层胚胎耐受良好（0.1%）浓度28.有时，即使DMSO中的化合物也不能完全溶于此，而且溶液呈多云，难以评估毒性。在这种情况下，使化合物的库存溶液完全溶于其性且清晰，加入0.1%的NaOH将解决问题。需要建立适当的对照组，以准确评估化合物的毒性。如果使用其他车辆，其固有的毒性可能会影响实验。
24孔板的每口井都含有1-10个胚胎，总体积为1 mL。如果测试化合物只能少量使用，则可能需要每口井最多使用 10 个胚胎来评估其毒性。强烈建议每口井只使用1个胚胎用于每口分析16、24、29。该板在28.5°C培养箱中储存5天。有时观察到大量蒸发，导致化合物在给定井16中的浓度发生显著变化。通过用石蜡薄膜从四面八方密封24孔板，将胚胎只放在中间的井中，并在边缘处填充其他水井，可以避免蒸发引起的问题。在我们早期的研究中，我们并没有观察到24孔板24、29的化学物质稀释剂有任何蒸发。此外，如果已知该化合物在环境温度下不稳定，则需要使用新鲜化合物的每日水变化，以取得可靠的结果。
在接触该化合物5天后，分析了斑马鱼幼虫的游泳模式。由于油井尺寸有限，含有5个dpf幼虫的24孔板的井不理想。因此，为了准确分析游泳模式，幼虫需要转移到含有50 m3水的培养皿中，并在分析前沉淀2分钟。在我们的研究中，只有两种抑制剂在筛选出的52种β-CA和β-CA抑制剂中表现出对游泳模式16的影响，根据我们的经验，该测试可以检测细微的变化，包括幼虫的轻度ataxic运动。
研究表明，目前方法的唯一限制是身体灵巧。这种担忧可以通过重复来克服，因为一个人的技能会随着实践的提高而提高。一旦获得专业知识，使用斑马鱼胚胎评估化合物是合乎道德的，简单，高效和翔实的。因此，我们期望，在药物开发的早期阶段，使用斑马鱼胚胎进行这种快速检测将成为体内毒性筛查的常用工具。
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Disclosures
提交人没有报告潜在的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了西格丽德·朱塞柳斯基金会（SP，MP）、芬兰文化基金会（AA、MH）、芬兰学院（SP、MP）、奥里翁·法莫斯基金会（MH）、坦佩雷结核病基金会（SP、MH和MP）以及简和阿托斯·埃尔科基金会（SP和MP）的赠款支持。).我们感谢我们的意大利和法国合作者苏普兰教授和Winum教授为抗结核和抗癌药物开发目的提供安全和毒性评估的碳氢化物抑制剂。我们感谢奥里基·莱赫努斯和玛丽安·库斯拉赫蒂的技术援助。我们还感谢利娜·梅基宁和汉娜莱娜·皮波在斑马鱼繁殖和胚胎收集方面的帮助。我们衷心感谢哈兰·巴克对手稿的批判性评价和有见地的评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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