Summary
Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.
Abstract
Le poisson zèbre est un organisme modèle vertébré largement utilisé pour la découverte de médicaments à base de phénotypes. Le poisson zèbre génère de nombreuses descendantes, a des embryons transparents et un développement externe rapide. Les embryons de poissons zèbres peuvent donc également être utilisés pour l'évaluation rapide de la toxicité des médicaments qui sont précieux et disponibles en petites quantités. Dans le présent article, une méthode pour le criblage efficace de la toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de 1-5 jours après la fertilisation est décrite. Les embryons sont surveillés par stéréomicroscope pour étudier les défauts phénotypiques causés par l'exposition à différentes concentrations de composés. Des concentrations létales semi-maximales (LC50) des composés sont également déterminées. La présente étude a exigé 3-6 mg d'un composé d'inhibiteur, et l'ensemble de l'expérience prend environ 8-10 h pour être accompli par un individu dans un laboratoire ayant des équipements de base. Le protocole actuel est approprié pour tester n'importe quel composé afin d'identifier les effets toxiques ou hors cible intolérables du composé dans la phase initiale de la découverte de médicaments et de détecter les effets toxiques subtils qui peuvent être manqués dans la culture cellulaire ou d'autres modèles animaux. La méthode réduit les retards procéduraux et les coûts de développement des médicaments.
Introduction
Le développement de médicaments est un processus coûteux. Avant qu'un seul composé chimique ne soit approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) et l'Agence européenne des médicaments (EMA), plusieurs milliers de composés sont examinés à un coût de plus d'un milliard de dollars1. Pendant le développement préclinique, la plus grande partie de ce coût est nécessaire pour l'expérimentation animale2. Pour limiter les coûts, les chercheurs dans le domaine du développement de médicaments ont besoin de modèles alternatifs pour le dépistage de l'innocuité des composés chimiques3. Par conséquent, dans la phase initiale du développement du médicament, il serait très bénéfique d'utiliser une méthode qui peut rapidement évaluer l'innocuité et la toxicité des composés dans un modèle approprié. Il existe plusieurs protocoles qui ont été utilisés pour le dépistage de la toxicité des composés chimiques impliquant des modèles de culture animale et cellulaire, mais il n'y a pas un seul protocole qui est validé et est en usage courant4,5. Les protocoles existants utilisant le poisson zèbre varient en longueur et ont été utilisés par des chercheurs individuels qui ont évalué la toxicité selon leur exigence de commodité6,7,8,9, 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12.
Dans un passé récent, le poisson zèbre est apparu comme un modèle pratique pour l'évaluation de la toxicité des composés chimiques au cours du développement embryonnaire6,7. Le poisson zèbre a de nombreux avantages intégrés pour l'évaluation des composés chimiques13. Même les expériences à grande échelle sont favorables, car une femelle poisson zèbre peut pondre des lots de 200-300 œufs, qui se développent rapidement ex vivo, n'ont pas besoin d'alimentation externe pour un pas jusqu'à une semaine et sont transparents. Les composés peuvent être ajoutés directement dans l'eau, où ils peuvent (selon la nature du composé) diffuser à travers le chorion, et après l'éclosion, à travers la peau, les branchies et la bouche des larves. Les expériences ne nécessitent pas de quantités abondantes de composés chimiques14 en raison de la petite taille de l'embryon. Le développement d'embryons de poisson zèbre exprime la plupart des protéines nécessaires pour atteindre les résultats normaux du développement. Par conséquent, un embryon de poisson zèbre est un modèle sensible pour évaluer si un médicament potentiel peut perturber la fonction d'une protéine ou d'une molécule de signalisation qui est significative sur le plan du développement. Les organes du poisson zèbre deviennent fonctionnels entre 2-5 dpf15, et les composés qui sont toxiques pendant cette période sensible de développement embryonnaire induisent des défauts phénotypiques chez les larves de poissons zèbres. Ces changements phénotypiques peuvent être facilement détectés à l'aide d'un simple microscope sans techniques invasives11. Les embryons de poissons zèbres sont largement utilisés dans la recherche toxicologique en raison de leur complexité biologique beaucoup plus grande par rapport au dépistage in vitro des médicaments à l'aide de modèles de culture cellulaire16,17. En tant que vertébré, la composition génétique et physiologique du poisson zèbre est comparable à l'homme et donc les toxicités des composés chimiques sont similaires entre le poisson zèbre et l'homme8,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22. Le poisson zèbre est donc un outil précieux dans la phase initiale de la découverte de médicaments pour l'évaluation de la toxicité et de la sécurité des composés chimiques.
Dans le présent article, nous fournissons une description détaillée de la méthode utilisée pour évaluer l'innocuité et la toxicité des composés inhibiteurs de l'anhydrase carbonique (CA) à l'aide d'embryons de poisson zèbre post-fertilisation (dpf) de 1 à 5 jours par un seul chercheur. Le protocole consiste à exposer les embryons de poissons zèbres à différentes concentrations de composés inhibiteurs chimiques et à étudier la mortalité et les changements phénotypiques au cours du développement embryonnaire. À la fin de l'exposition aux composés chimiques, la dose lc50 du produit chimique est déterminée. La méthode permet à une personne d'effectuer un dépistage efficace de 1-5 composés d'essai et prend environ 8-10 h en fonction de l'expérience de la personne avec la méthode (Figure 1). Chacune des étapes requises pour évaluer la toxicité des composés est décrite à la figure 2. L'évaluation de la toxicité des inhibiteurs de l'AC nécessite 8 jours, et comprend la mise en place de paires d'accouplement (jour 1); la collecte des embryons dans les réservoirs de reproduction, leur nettoyage et leur transfert dans un incubateur de 28,5 oC (jour 2); la distribution des embryons dans les puits d'une plaque de 24 puits et l'ajout de composés inhibiteurs dilués de l'AC (jour 3); l'analyse phénotypique et l'imagerie des larves (jour 4-8), et la détermination de la dose de LC50 (jour8). Cette méthode est rapide et efficace, nécessite une petite quantité du composé chimique et seulement des installations de base du laboratoire.
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Protocol
L'installation centrale de poisson zèbre de l'Université de Tampere dispose d'une autorisation d'établissement accordée par le National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.05/2016). Toutes les expériences utilisant des embryons de poissons zèbres ont été réalisées selon le gouvernement provincial de finlande orientale, le Département social et de la santé du protocole de l'Unité des services régionaux de Tampere - LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. Mise en place de réservoirs d'accouplement de poisson zèbre de nuit
- Placer 2-5 poissons zèbres mâles adultes et 3-5 poissons zèbres femelles adultes dans des réservoirs d'accouplement pendant la nuit. (La reproduction est induite le matin par cycle automatique sombre et léger pendant la nuit).
- Mettre en place plusieurs croisements pour obtenir suffisamment d'embryons pour évaluer la toxicité de plus de deux composés chimiques. Pour l'évaluation de la toxicité, chaque concentration a besoin d'un minimum de 20 embryons23.
- Pour éviter de manipuler le stress aux animaux, permettre aux animaux de se reposer pendant 2 semaines avant d'utiliser les mêmes individus pour la reproduction.
2. Collecte d'embryons et préparation de plaques pour l'exposition aux composés chimiques
- Recueillir les embryons, le lendemain avant midi, à l'aide d'une passoire à mailles fines et les transférer sur un plat Petri contenant un milieu embryonnaire E3 [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, et 0,1% w/v Methylène Blue].
- Enlever les débris à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique (p. ex., nourriture et déchets solides). Examiner chaque lot d'embryons sous le stéréomicroscope pour enlever les embryons non fécondés/morts (identifiés par leur apparence opaque).
- Conserver les embryons à 28,5 oC dans un incubateur. Examinez les embryons, le lendemain matin, sous un stéréomicroscope et enlevez tous les embryons malsains ou morts. Remplacez également l'ancien milieu E3 par un milieu E3 frais.
REMARQUE: Les embryons de poissons zèbres sont toujours maintenus à 28,5 oC en laboratoire. - Transférer soigneusement 1 embryon dans chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant suffisamment de milieu E3 pour couvrir les embryons.
3. Préparation de la solution courante de composés chimiques et distribution de composés dilués dans les puits
- Sortez les flacons contenant des composés inhibiteurs stockés à 4 oC.
REMARQUE: Selon les propriétés du composé, celles-ci sont stockées à des températures différentes. - Peser le composé à l'aide d'un équilibre analytique qui peut peser quelques milligrammes (mg) du composé avec précision.
- Préparer au moins 250 l (100 mm) de solution de bouillon pour chaque composé dans un solvant approprié (p. ex., eau E3 ou sulfoxure de diméthyle (DMSO), en fonction des propriétés de solubilité des composés.
REMARQUE: Les étapes ci-dessus peuvent être effectuées un jour avant le début de l'expérience à un moment opportun et stockées à 4 oC). - Effectuer des dilutions en série des solutions de stock (par exemple, 10 m, 20 M, 50 M, 100 M, 150 M, 300 M et 500 M) à l'aide d'eau E3 dans des tubes centrifugeurs de 15 ml.
REMARQUE: Les concentrations et le nombre de dilutions en série varient d'un composé à l'autre en fonction de leur niveau de toxicité. - Sur les 24 plaques de puits contenant des embryons, retirer l'eau E3 des puits à l'aide d'une pipette Pasteur et d'une pipette de 1 ml (contenant 1 embryon sp) une rangée à la fois.
- Distribuer 1 ml de chaque diluant dans chaque puits (à partir de plus bas et passer à une concentration plus élevée) dans les puits de 24 puits.
- Configurez un groupe témoin à partir du même lot d'embryons et ajoutez la quantité correspondante de diluant.
- Étiqueter les plaques de 24 puits avec le nom et la concentration du composé et les garder à 28,5 oC dans un incubateur.
4. Analyse phénotypique et imagerie des embryons à l'aide d'un stéréomicroscope
- Examiner les embryons sous un stéréomicroscope pour les paramètres 24 h après l'exposition aux composés chimiques.
- Notez les paramètres tels que la mortalité, l'éclosion, le rythme cardiaque, l'utilisation du sac jaune, le développement de la vessie natatoire, le mouvement du poisson, l'œdème péricardique, et la forme du corps23.
- Prenez les larves exposées à chaque concentration du composé et déposez-les latéralement dans un petit plat Petri contenant 3% de cellulose méthyle de poids moléculaire élevé à l'aide d'une sonde métallique.
REMARQUE: La cellulose méthyle de 3 % (avec un haut moléculaire) est un liquide visqueux nécessaire à l'intégration du poisson avec une orientation requise pour l'examen microscopique. Pour orienter le poisson dans ce liquide, une sonde métallique est nécessaire. - Prenez les images à l'aide d'un stéréomicroscope attaché à une caméra. Enregistrez les images dans un dossier séparé chaque jour jusqu'à la fin de l'expérience.
- Entrez toutes les observations dans une table chaque jour, soit dans une table en ligne ou sur une feuille imprimée.
- Si les composés sont neurotoxiques, les larves de 4 à 5 dpfs peuvent montrer un modèle de nage altéré, faire un enregistrement de ces changements soit en capturant une courte (30 s à 1 min) vidéo des larves présentant un modèle de mouvement anormal.
- Après 5 jours d'exposition aux composés chimiques, notez la concentration à laquelle la moitié des embryons meurent pour calculer la demi-concentration létale maximale 50 (LC50) de chaque produit chimique.
REMARQUE: Le LC50 est la concentration à laquelle 50% des embryons meurent à la fin de 5 jours d'exposition à un composé chimique. Utilisez un minimum de 20 embryons pour tester la toxicité de chaque concentration d'un composé23. - Construire une courbe pour la mortalité des embryons pour toutes les concentrations à l'aide d'un programme approprié.
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Representative Results
La partie essentielle de l'évaluation de la toxicité consiste à tester différentes concentrations d'un ou plusieurs composés chimiques dans une seule expérience. Au début, sélectionnez les composés pour l'évaluation de la toxicité, le nombre de concentrations à tester pour chaque composé, et par conséquent, faire un tableau (Figure 3). Nous avons utilisé une couleur unique pour chaque composé pour organiser les échantillons (Figure 3). L'utilisation d'un marqueur résistant aux solvants et l'étiquetage au fond ou sur les côtés des plaques est important pour éviter la confusion plus tard. Si les composés induisent des défauts phénotypiques chez les larves exposées à différentes concentrations d'inhibiteurs, les défauts sont enregistrés tous les 24 h sur la période de 1-5 dpf (Figure 4A, B,C,D). Les embryons traités avec un inhibiteur CA IX connu à une concentration de 500 M n'ont montré aucun changement phénotypique apparent dans les 1-5 jours d'exposition au composé chimique (Figure 4B). La figure 4C et la figure 4D montrent les embryons traités avec des inhibiteurs de l'AC qui ont induit divers défauts phénotypiques des embryons non éclos, même au jour 3 (tête de flèche), la structure incurvée du corps (flèche), le sac jaune inutilisé et l'œdème péricardique (tête de flèche) et l'absence de sacs d'otolithe chez les larves à 5 jours après le traitement avec un composé chimique (flèche). Dans une autre étude, les embryons traités par inhibiteur ca (Figure 4E) montrent l'absence de sacs d'otolithes et de vessie natatoire (têtes de flèche). Dans notre étude, (Figure 4C, D), nous avons documenté des défauts phénotypiques (embryons fragiles et absence de pigmentation) même après le premier jour de l'exposition aux inhibiteurs CA. Les analyses phénotypiques ont montré que certains des composés inhibiteurs sont mortels et ne peuvent pas être développés comme médicaments à usage humain (figure4C, D et tableau 1).
Les expériences ont identifié un composé représentatif qui a induit des changements phénotypiques minimes ou inouïes au cours du développement embryonnaire et a montré une dose élevée de LC50 (figure 5), suggérant que le composé est sans danger pour la caractérisation et peut être potentiellement développé en un candidat médicament pour l'usage humain16. En regardant des images fixes de larves exposées au composé, il n'y a pas eu de défauts phénotypiques (figure 4B). Cependant, le même composé s'est avéré neurotoxique et a induit l'ataxie chez les larves après 5 jours d'exposition à l'inhibiteur CA (Figure 6). Ce phénotype n'a pu être détecté qu'en observant directement le comportement de nage des larves de poissons zèbres au microscope. Ces études suggèrent que le développement neuronal des larves de poissons zèbres est sensible au composé16,17.
Figure 1 : Temps d'heures requis pour le dépistage rapide des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre : Dans un ensemble d'expériences, une personne ayant une expérience pratique peut dépister environ 5 composés chimiques (chaque composé nécessitant un minimum de 6 dilutions) à l'aide d'embryons de poissons zèbres dans des plaques de 24 puits. Au total, il faut environ 8-10 h de la mise en place de croix à l'exécution l'exécution de la détermination LC50 sur une période de 8 jours.
Figure 2 : Graphique montrant la ventilation de l'évaluation de la toxicité des composés chimiques. Le criblage de toxicité des composés chimiques exige 8 jours et peut être décomposé en cinq étapes. (Jour 1) Consiste à mettre en place des paires d'accouplement de poissons zèbres dans des réservoirs. (Jour 2) Il s'agit de recueillir des embryons des réservoirs d'accouplement dans des plats Petri, puis de les garder dans un incubateur de 28,5 oC pendant la nuit. (Jour 3) Examen des embryons à l'aide d'un stéréomicroscope et nettoyage des embryons. Distribution des embryons dans des plaques de 24 puits et ajout des dilutions des composés d'essai. (Jour 4-8) Analyses phénotypiques des larves pour les défauts développementaux. L'étude des modèles de nage et la détermination du LC50 ont été effectuées le dernier jour de l'exposition aux composés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Présentation schématique des expériences impliquées dans l'évaluation de la toxicité. L'évaluation de la toxicité consiste à préparer un tableau tabulé contenant de l'information sur les composés chimiques, les dilutions des composés et les paramètres à évaluer. Faire la dilution des solutions de stock aux concentrations souhaitées dans des tubes centrifugeuses de 15 ml (la dilution d'un tube à ajouter à chaque rangée de la plaque de 24 puits). Une plaque de 24 puits marquée d'un marqueur imperméable à l'eau avec le nom du composé d'essai, la concentration dans chaque rangée et la date d'exposition. Examen et imagerie des embryons en transférant les larves sur un petit plat Petri contenant 3% de cellulose méthyle de poids moléculaire élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Exemple d'analyse phénotypique des larves dans les groupes traités par composé témoin et testé. (A) Les analyses phénotypiques des larves du groupe témoin non traitées avec un composé n'ont montré aucun défaut phénotypique sous un microscope. (B) Les larves traitées avec un inhibiteur CA de 500 m (inhibiteur connu de l'anhydrase carbonique IX n'ont montré aucun défaut phénotypique observable. (C, D) Les larves en développement ont été traitées avec un inhibiteur de l'ACA avec des concentrations de 250 et 125 M respectivement. Les composés ont induit des défauts phénotypiques tels que le corps courbé, l'oedème péricardique, et le sac de jaune inutilisé (flèches et têtes de flèche). Les panneaux A et B ont été modifiés à partir d'Aspatwar et d'al16. Les panneaux C, D et E montrent des images inédites, qui ont été obtenues à l'aide d'un microscope différent. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Détermination de la concentration létale 50 (LC50) à l'aide de 1 à 5 larves de poissons zèbres. L'évaluation de la toxicité à l'aide d'embryons de poissons zèbres permet aux chercheurs de déterminer la concentration létale minimale du composé chimique à la fin de l'expérience. La concentration lc50 du composé (un inhibiteur caIX connu) était de 3,5 mM. La concentration élevée de LC50 permet une caractérisation plus poussée du composé. Ce chiffre a été modifié à partir d'Aspatwar et d'autres16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Exemple d'analyse des modèles de nage dans les groupes de larves non traités (A) et les inhibiteurs traités (B). Les larves de poissons zèbres traitées dans le panneau B avec un composé inhibiteur de l'essai de 300 M (un inhibiteur connu de l'anhydrase carbonique humaine IX) ont montré un modèle de mouvement anormal (ataxique) (têtes de flèche), ce qui suggère que le composé induit la neurotoxicité dans les embryons en développement . Les pointes de flèche pointent vers la courbure normale de la queue pendant la baignade. Dans le panneau A, les flèches pointent vers la courbure normale de la queue pendant la baignade. Ce chiffre a été modifié à partir d'Aspatwar et d'autres16. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Inhibiteur CA | Dépistage de la toxicité | LC50 | In vivo | CAI toxiques | référence |
| Carbamates | 24 | tout le | 1a | 3b | 24, Non publié |
| Coumarins (Coumarins) | 10 | tout le | - | 2 | inédit |
| Nitroimidazoles (Nitroimidazoles) | 2 | tout le | 2 | 2c | 16 |
| Sulfamides | 5 | tout le | - | 3 | 25 |
| total | 41 | tout le | 3 | 10 | - |
| a (en) Basé sur le criblage de toxicité, l'inhibiteur a été employé pour l'inhibition de Mycobacterium marinum dans le modèle de poisson zèbre. b (en) Inhibiteur mortel, cNeurotoxique au-dessus de 300 m de concentration | |||||
Tableau 1 : Un résumé de l'innocuité et de la toxicité des composés examinés. L'expérience d'évaluation de la toxicité aide le chercheur à tirer une conclusion sur l'innocuité des composés chimiques testés. La concentration lc50 permet de définir une concentration sûre pour une caractérisation ultérieure. Un chercheur peut décider si le composé est mortel même après 24 h d'exposition des embryons au composé sous enquête. Dans notre exemple, un effet subtil sur la natation due à la neurotoxicité est l'information significative, qui est utile pour mettre en place d'autres expériences. Par conséquent, sur la base du dépistage de la toxicité, nous avons pu utiliser des concentrations sûres de l'inhibiteur CA pour une caractérisation plus poussée in vivo24.
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Discussion
Le test de toxicité in vitro à l'aide de cellules cultivées peut détecter la survie et les études morphologiques des cellules fournissant des informations limitées sur la toxicité induite par le composé d'essai. L'avantage du criblage de toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de poisson zèbre est la détection rapide des changements phénotypiques induits chimiquement dans un animal entier pendant le développement embryonnaire dans un organisme modèle pertinent. Environ 70 % des gènes humains codant en protéines ont des contre-parties orthologs dans le génome du poisson zèbre25. Les voies génétiques contrôlant la transduction et le développement du signal sont fortement conservées entre l'homme et le poisson zèbre26, et, par conséquent, les composés chimiques sont susceptibles d'avoir des effets toxiques similaires chez l'homme25.
Les poissons zèbres sont à l'avant-garde de la recherche toxicologique et ont déjà été largement utilisés pour détecter les toxines dans les échantillons d'eau et d'étudier le mécanisme d'action des toxines environnementales et leurs effets sur l'animal27. Dans cet article, nous montrons l'utilisation des embryons de poisson zèbre en développement pour évaluer la toxicité des composés potentiels à la phase précoce de la découverte de médicaments. Notre évaluation rapide et multiforme de toxicité est basée sur 1) les changements dans le phénotype de l'organisme (écaillage, sacs d'otolithe, oedème péricardique, utilisation de sac de jaune, développement de notochord, battement de coeur, développement de la vessie natatoire, mouvement) pendant embryonnaire sur une période de 5 jours, et 2) la détermination de la concentration létale (LC50). Des heures raisonnables de travail pratique (8-10 h réparties sur 8 jours) sont suffisantes pour déterminer le profil de toxicité d'un composé à l'aide de cette procédure. Pour les composés nouvellement synthétisés qui sont disponibles en quantités limitées, la toxicité peut être évaluée à l'aide d'un minimum de 3 mg du composé. Aucun équipement spécial n'est requis. La procédure est, par conséquent, un moyen rapide et peu coûteux d'évaluer les effets toxiques de tout composé qui peut potentiellement être développé dans le médicament pour l'usage humain.
La qualité du lot d'embryons a un grand impact sur les résultats de l'expérience. La qualité des œufs (y compris le taux de fécondation) n'est pas évidente immédiatement après la collecte dans les réservoirs de reproduction (0-4 hpf). Pour n'obtenir que des embryons en développement normal pour les expériences, avant d'ajouter des composés, nous permettons aux embryons de rester à 28,5 oC pendant 24 h après la collecte dans les réservoirs de reproduction. Après 24 hpf, tous les embryons morts ou d'apparence malsaine sont jetés. En plus de cela, il est conseillé d'avoir un groupe d'embryons traités par une simulation dans chaque expérience pour mieux contrôler la qualité du lot d'ovules utilisés dans l'expérience ainsi que pour voir la mortalité de base pour déterminer avec précision LC50.
Un groupe traité par simulation est également nécessaire pour contrôler la toxicité du véhicule de choix. De nombreux produits chimiques sont insolubles dans l'eau et DMSO est souvent utilisé comme véhicule pour la livraison des composés d'essai. Le DMSO est généralement bien toléré par les embryons dans les concentrations28. Parfois, les composés ne sont pas complètement solubles, même dans DMSO et la solution semble trouble, ce qui rend difficile pour l'évaluation de la toxicité. Dans de tels cas, pour obtenir la solution de stock du composé complètement soluble et clair, l'ajout d'une baisse de 0,1% NaOH résoudra le problème. Des groupes témoins appropriés doivent être mis en place pour évaluer avec précision la toxicité du composé. Si d'autres véhicules sont utilisés, leur toxicité inhérente pourrait affecter l'expérience.
Chaque puits d'une plaque de 24 puits contient de 1 à 10 embryons immergés dans un volume total de 1 ml. Si le composé d'essai n'est disponible qu'en petites quantités, il peut être nécessaire d'utiliser jusqu'à 10 embryons par puits pour évaluer sa toxicité. Il est fortement recommandé que seulement 1 embryon par puits soit utilisé pour chaque analyse16,24,29. La plaque est stockée à un incubateur de 28,5 oC pendant 5 jours. Parfois, on observe une évaporation significative provoquant un changement marqué de la concentration du composé dans un puits donné16. En scellant les plaques de 24 puits avec des pellées de paraffine de tous les côtés, en plaçant les embryons uniquement dans les puits du milieu et en remplissant les autres puits le long des jantes avec de l'eau, les problèmes causés par l'évaporation peuvent être évités. Dans nos études antérieures, nous n'avons observé aucune évaporation des diluants des produits chimiques des plaques 24-puits24,29. En outre, si le composé en question est connu pour être instable sous les températures ambiantes, des changements quotidiens de l'eau avec composé frais seront nécessaires pour des résultats fiables.
Le modèle de nage des larves de poissons zèbres est analysé après les 5 jours d'exposition au composé. Les puits d'une plaque de 24 puits contenant 5 larves de dpf ne sont pas idéaux à cet effet en raison de la taille limitée du puits. Par conséquent, pour une analyse précise du modèle de nage, les larves doivent être transférées dans un plat Petri contenant 50 ml d'eau E3 et peuvent se contenter de 2 min avant l'analyse. Dans notre étude, seulement deux inhibiteurs ont montré l'effet sur le modèle de nage16 parmi les 52 inhibiteurs de ca-CA et de CA examinés pour sûreté et toxicité, basé sur notre expérience ce test peut détecter des changements subtils comprenant le mouvement doux d'ataxique des larves.
Cette étude a démontré que la seule limitation à la méthode actuelle est la dextérité physique. Cette préoccupation peut être surmontée par la répétition, comme l'habileté d'une personne s'améliore avec la pratique. Une fois l'expertise atteinte, l'évaluation des composés utilisant des embryons de poisson zèbre est éthique, facile, efficace et informative. Nous nous attendons donc à ce qu'un tel essai rapide utilisant des embryons de poisson zèbre devienne un outil populaire pour le dépistage de la toxicité in vivo dans la phase précoce du développement de médicaments.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts potentiel n'a été signalé par les auteurs.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Sigrid Juselius (SP, MP), de la Fondation culturelle finlandaise (AA, MH), de l'Académie de Finlande (SP, MP), de la Fondation Orion Farmos (MH), de la Tampere Tuberculosis Foundation (SP, MH et MP) et de la Fondation Jane et Aatos Erkko (SP et MP). ). Nous remercions nos collaborateurs italiens et Français, le professeur Supuran et le professeur Winum, d'avoir fourni des inhibiteurs de l'anhydrase carbonique pour l'évaluation de l'innocuité et de la toxicité à des fins de développement de médicaments antituberculeux et anticancéreux. Nous remercions Aulikki Lehmus et Marianne Kuuslahti pour l'assistance technique. Nous remercions également Leena M'kinen et Hannaleena Piippo pour leur aide dans l'élevage et la collecte d'embryons de poissons zèbres. Nous remercions sincèrement Harlan Barker pour l'évaluation critique du manuscrit et les commentaires perspicaces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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