Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

Summary

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Umwandlung von induzierten pluripotenten Stammzellen in motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen-oder Schädelidentität, indem es die Transkriptionsfaktoren von induzierbaren PiggyBac-Vektoren ausführt.

Abstract

Wir beschreiben hier eine Methode, um funktionelle Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erhalten. Die direkte Umwandlung in Motorneuron erfolgt durch die ektopische Expression alternativer Module von Transkriptionsfaktoren, nämlich Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) oder Ngn2, Isl1 und Phox2a (NIP). NIL und NIP geben jeweils die Identität des Wirbelsäulen-und Schädelmotors Neuron an. Unser Protokoll beginnt mit der Generierung von modifizierten iPSC-Leitungen, bei denen NIL oder NIP über einen PiggyBac-Transpospo-Vektor stabil in das Genom integriert sind. Die Expression der Transgene wird dann durch Doxycyclin induziert und führt in 5 Tagen zur Umwandlung von iPSCs in MN-Vorläufer. Die anschließende Reifung führt zu einer homogenen Population von Wirbelsäulen-oder Schädelmlassen. Unsere Methode hat gegenüber früheren Protokollen mehrere Vorteile: Sie ist extrem schnell und vereinfacht; Es erfordert keine Virusinfektion oder eine weitere MN-Isolierung; Es ermöglicht die Erzeugung von verschiedenen MN-Subpopulationen (Wirbelsäule und Schädelung) mit einem bemerkenswerten Reifungsgrad, wie die Fähigkeit zeigt, Züge von Aktionspotenzialen zu befeuern. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von motorischen Neuronen ohne Reinigung von gemischten Populationen gewonnen werden. Die iPSC-abgeleiteten Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen können für die In-vitro-Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose und anderer neurodegenerativer Erkrankungen des motorischen Neurons eingesetzt werden. Homogene motorische Neuronenpopulationen könnten eine wichtige Ressource für zelltypspezifische Arzneimittel-Screenings darstellen.

Introduction

Motor-Neuron (MN) Degeneration spielt eine ursächliche Rolle bei menschlichen Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und der Wirbelsäulenmuskulären Atrophie (SMA). Die Etablierung geeigneter In-vitro-Zellmodellsysteme, die die Komplexität des menschlichen MN rekapitulieren, ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Ausgeführte pluripotente Stammzellen (iPSCs), die mit bemerkenswerten Plurilinage-Differenzierungseigenschaften ausgestattet sind, stammen inzwischen von einer Reihe von Patienten, die von motorischen Neuronenkrankheiten 1^,2betroffen sind. Zusätzliche iPSC-Linien, die pathogene Mutationen im Zusammenhang mit MN-Erkrankungen tragen, wurden durch die Genbearbeitung erzeugt, angefangen von der Kontrolle "gesunder" pluripotenter Stammzellen 3. Diese Linien stellen nützliche Werkzeuge für die Modellierung von In-vitro-Krankheiten und das Arzneimittelscreening dar, vorausgesetzt, dass geeignete Methoden für die iPSC-Figierung in MNs zur Verfügung stehen. Die Begründung für die Entwicklung dieser Methode besteht darin, der an PN-Krankheiten interessierten wissenschaftlichen Gemeinschaft ein schnelles und effizientes Differenzierungsprotokoll zu bieten, das zu reifen funktionellen MNs führt. Der erste Vorteil dieser Methode ist der Zeitrahmen der Ausführung. Ein weiterer relevanter Punkt der Stärke ist die Beseitigung eines Reinigungsschrittes. Schließlich kann das Protokoll verwendet werden, um zwei verschiedene Populationen von motorischen Neuronen zu erzeugen.

Die Möglichkeit, verschiedene Subtypen von MNs zu erzeugen, ist besonders für die Modellierung von MN-Erkrankungen relevant. Nicht alle MN-Subtypen sind in ALS und SMA gleich anfällig und das Auftreten von Symptomen in verschiedenen Motoreinheiten beeinflusst die Prognose stark. Bei ALS führt der Wirbelsäuleneintritt mit Symptomen, die in der oberen und unteren Gliedmaßen beginnen, in etwa 3-5 Jahren 4 zum Tod^. Umgekehrt hat der Bulbar-Auftakt, beginnend mit der Degeneration der Schädelmähne, eine schlechteste Prognose. Darüber hinaus ist der Anteil des Bulbar-Ansatzes bei Patienten mit Mutationen in den RNA-bindenden Proteinen FUS und TDP-43 signifikant^höherals bei Personen mit SOD1-Mutationen 5. Fast die Gesamtheit alternativer MN-Differenzierungsprotokolle beruht auf der Aktivität der Retinosäure (RA), die der Differenzierung von iPSCs6,7,8^einenWirbelsäulencharakter verleiht. Dies schränkt die Möglichkeit ein, intrinsische Faktoren^zuuntersuchen, die in bestimmten PN-Subtypen 9^,10Schutz bieten könnten.

Im Einklang mit einer früheren Arbeit in der Maus embryonalen Stammzellen¹¹, Wir haben vor kurzem gezeigt, dass in menschlichen iPSCs ectopischen Ausdruck von Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) induziert eine Wirbelsäulen-MN-Identität, während Ngn2 und Isl1 plus Phox2a (NIP) angeben,kranial MNs 12. Deshalb haben wir ein effizientes Protokoll entwickelt, das zur Produktion von menschlichen MNs führt, die in einem 12-tägigen Turnaround mit funktionalen Eigenschaften ausgestattet sind. Ziel dieser Methode ist es, in kurzer Zeit und ohne Reinigungsbedarf (z.B. durch FACS) Zellpopulationen zu erhalten, die für MNs mit Wirbelsäulen-oder Schädelidentität hoch angereichert sind.

Protocol

1. Wartung menschlicher iPSCs

1. Zubereitung von matrix-beschichteten Platten
   1. Tauen Sie eine 5 mL Ampull-Ampull-Matrix (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 ° C auf. Die ursprünglichen Matrixbestände kommen in unterschiedlichen Lagerkonzentrationen und Aliquots werden nach dem auf dem Datenblatt angegebenen Verdünnungsfaktor hergestellt, der für das einzelne Los spezifisch ist. Es ist wichtig, die Ampullen und Rohre eiskalt zu halten, um ein vorzeitiges Gelalten der Matrix zu verhindern. Despense Matrix in Aliquots in vorgekühlten Kryotubes auf Eis. Ungenutzte Aliquots bei-20 ° C einfrieren.
   2. Legen Sie ein Aliquot auf Eis für etwa 2 h zu tauen.
   3. Das Aliquot der Matrix mit 20 ml kaltem DMEM/F12 in einem 50 mL konischen Rohr verdünnen.
   4. Gut verrühren und 1 mL verdünnte Matrix in 35 mm-Geschirr verteilen (Gegenwerte pro Oberfläche anderer Gerichte).
   5. Halten Sie die Schalen mit verdünnter Matrix für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um die Beschichtung zu ermöglichen.
      NOTE: Geschirr, die mit Parafilm versiegelt sind, kann bei 4 ° C bis zu 2 Wochen gelagert werden.
2. Vorbereitung der Bestandslösung (20 mL) und 1x funktionierende Aliquots des sanften Zelldissoziationsreagenzials (Siehe Materialtabelle).
   1. Pulver auf 10 mg/mL in PBS auflösen (Ca^{2 +}/mg² + free).
   2. Filter sterilisieren durch eine 0,22 μm Filtermembran.
   3. 20 Aliquots (je 1 ml) vorbereiten und bei-20 ° C lagern.
   4. Vor dem Gebrauch einen Aliquotot in PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} free) auf 1 mg/mL (1x funktionierende Aliquots) verdünnen.
      Hinweis: 1x funktionierende Aliquots können bei 4 ° C bis zu 2 Wochen gelagert werden.
3. Die Weitergabe menschlicher iPSCs.
   1. Vor dem Start: Bei 4 ° C gelagert, werden vorwärme Matrix-beschichtete Platten im Inkubator bei 37 ° C für 20-30 min gelagert. Bei Raumtemperatur ist die Menge des menschlichen iPSC-Mediums (siehe Materialtabelle) vorwarm. Der DMEM/F12 vorwarm.
   2. Aspirate Kultur Medium.
   3. IPSCs mit PBS abspülen (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} free).
   4. 1x schonende Dissoziationslösung (0,5 ml für eine 35-mm-Schale) hinzufügen. Inkubieren Sie bei 37 ° C, bis sich die Kanten der Kolonien von der Platte lösen, in der Regel 3-5 min.
   5. Aspirieren Sie die sanfte Dissoziationslösung, wobei man darauf achtet, die iPSC-Kolonien nicht zu trennen.
   6. Waschen Sie die Zellen mit DMEM/F12 (2 ml für eine 35-mm-Schale) und Aspirat darauf zu achten, die Zellen nicht zu lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
   7. Das menschliche iPSC-Medium (1 mL für eine 35 mm Schüssel) hinzufügen.
   8. Die Kolonien mit einem Zellheber sanft abschalten und auf ein 15 mL Rohr übertragen.
   9. Mit einem P1000-Pipettor 3-4 mal die Zellklumpen vorsichtig brechen.
   10. Aspirieren Sie den Supernatant von der matrix-beschichteten Platte (n).
   11. Saatgut die Zellen im entsprechenden Kulturvolumen des menschlichen iPSC Mediums. Das Split-Verhältnis kann von Linie zu Linie variieren und ist etwa 1:4-1:8. Wechseln Sie das Medium täglich.

2. Generation von NIL und NIP-iPSC Linien

1. Zelltransfektion.
   1. Spülen Sie die Zellen mit PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} kostenlos).
   2. Fügen Sie das Zelldissoziations-Reagenz hinzu (siehe Materialtabelle) (0,35 mL für eine 35-mm-Schale) und inkubieren Sie bei 37 ° C, bis einzelne Zellen getrennt sind (5-10 min).
   3. Sanft komplette Zelltrennung durch Pipettieren mit einem P1000-Pipettor 3-4 mal.
   4. Sammeln Sie in einem 15 mL-Rohr und fügen Sie PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} frei) zu 10 mL. Zählen Sie die Zellen.
   5. Pellet 10 6^Zellen und Wiedersehen in 100 μl von Buffer R (im Zell-Elektroporation-Kit enthalten, siehe Materialtabelle).
   6. Plasmid-DNA für die Transfektion hinzufügen: 4,5 μg umsetzbarer Vektor (epB-Bsd-TT-NIL oder epB-Bsd-TT-NIP12) und 0,5 μg des PiggyBac-Transposaals Plasmid 13.
   7. Transfekt mit dem Zellelektroporationssystem (siehe Materialtabelle) nach Herstellerangaben und wie bereits beschrieben 3 mit folgenden Parametern: 1.200 V Spannung, 30 ms Breite, 1 Puls. Die Zellen des menschlichen iPSC-Mediums werden mit 10 μM Y-27632 (ROCK-Inhibitor, siehe Materialtabelle) in einer 6-mm-matrix-beschichteten Schüssel ergänzt.
2. Selektion mit Antibiotika.
   1. Zwei Tage nach dem Transkriptions 5 μg/mL Blasticidin in das Kulturmedium geben.
   2. Die meisten der nicht transferierten Zellen werden innerhalb von 48 Stunden an Blasticidin-Selektion sterben. Halten Sie die Zellen in Blasticidin für mindestens 7-10 Tage, um die Zellen, die die Transgene nicht in das Genom integriert haben, zu konterkarieren.
   3. Halten Sie stüftige transflektierte Zellen als gemischte Population, die aus Zellen mit unterschiedlicher Anzahl von Transgenen und verschiedenen Integrationsstätten besteht, oder isolieren Sie einzelne Klone.
   4. Bereiten Sie ein zusätzliches Gericht vor, um die Transgene auf 1 μg/mL Doxycycline-Induktion durch RT-PCR mit transgenspezifischen Primern für Ngn2 (Forward: TATGCCACCTCACCTCCCCATAG) wirksam auszudrücken; Umgekehrt: GAAGGAGGAGGCGCGCGACT), wie bereits^beschrieben12.
   5. In dieser Phase werden die Vorräte der neuartigen NIL-und NIP-iPSC-Leitungen im Gefriermedium für menschliche iPSCs gefrieren (siehe Materialtabelle ).

3. Motor Neuron Differenzierung

1. Dissoziieren Sie die Zellen mit Zelldissoziationsreagenz, wie beschrieben (Schritte 2.1.1 .-2.1.3.). Sammeln Sie getrennte Zellen in einem 15 mL Rohr und verdünnen Sie mit 5 Volumina DMEM/F12. Die Zellen pumpen und im menschlichen iPSC-Medium wiederbeleben, das mit 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt wird. Zählen Sie die Zellen und Samen auf matrix-beschichtete Gerichte mit einer Dichte von 62.500Cells/2.
2. Am Tag danach ersetzen Sie das Medium durch DMEM/F12, ergänzt durch 1x stabile L-Glutamin-Analogie, 1x nicht-essentielle Aminosäure (NEAA) Zellkultur-Ergänzung und 0,5x Penicillin/Streptomycin, und die 1 μg/mL Doxycycline enthält. Dies gilt als Tag 0 der Differenzierung. Am ersten Tag das Medium und die Doxycycline erfrischen.
3. Wechseln Sie am 2. Tag das Medium auf Neurobasal/B27 (Neurobasal Medium ergänzt mit 1x B27, 1x stabiles L-Glutamin-Analogon, 1x NEAA und 0,5x Penicillin/Streptomycin), mit 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 und 1 μg/mL Doxycycline (siehe Materialtabelle) ). Erfrischen Sie das Medium und die Doxycycline täglich bis zum 5. Tag.
4. Tag 5: Zellen trennen sich mit Zelldissoziation Reagenz (Siehe Materialtabelle).
   1. Spülen Sie die Zellen mit PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} kostenlos).
   2. Die Zelldissoziation Reagenz (0,35 mL für eine 35-mm-Schale) dazugeben und bei 37 ° C inkubieren, bis sich der gesamte Zellmonolayer von der Schale trennt. Beachten Sie, dass einzelne Zellen während der Inkubation nicht getrennt werden.
   3. 1 ml DMEM/F12 hinzufügen und die Zellen in einem 15 mL Rohr sammeln.
   4. Sanft komplette Zelltrennung durch Pipettieren mit einem P1000-Pipettor 10-15 mal.
   5. Fügen Sie 4 ml DMEM/F12 hinzu und zählen Sie die Zellen.
   6. In diesem Stadium können Motorneuronenvorläufer im Zellgefrieren einfrieren (siehe Materialliste), nach Herstellerangaben.
   7. Pelletieren Sie die Zellen und wiederbeleben in Neuronal Medium (Neurobasal/B27 Medium mit 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF und 200 ng/mL L-Ascorbinsäure, siehe Tabelle von Material s) mit 10 μM ROCK-Inhibitor ergänzt.
   8. Die Zellen auf polyornithine/laminin-oder alternativ auf matrix-beschichteten Stützen bei der Dichte von 100.000 Cells/2. Verwenden Sie für die Immunfärbung die Kunststoffträger mit Polymer-Kokslip (siehe Materialtabelle).
5. An Tag 6 wechseln Sie das Medium mit frischem neuronalen Medium ohne ROCK-Inhibitor. An den nächsten Tagen alle 3 Tage die Hälfte des Mediums erfrischen. Das Kulturmedium muss sehr sorgfältig verändert werden, um eine Ablösung von der Oberfläche zu verhindern.

4. Immunfluoranalyse

1. Zellbefestigung. Spülen Sie die Zellen mit PBS (mit Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) und inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten in 4% Paraformaldehyd in PBS (mit Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) bei Raumtemperatur.
   CAUTION: Paraformaldehyd ist giftig und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und behandeln Sie unter einer chemischen Rauchhaube.
2. Durchlässigkeit mit PBS (mit Ca^{2 +}/Mg^{2 +}), die 0,1% Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur enthält.
3. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur in Antikörper-Sperrlösung (ABS: 3% BSA in PBS mit Ca^{2 +}/Mg^{2 +}).
4. Inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur mit primären Antikörpern in ABS: Anti-TTUJ1 (1:1000; Kaninchen) und Anti-Oct4 (1:200; Maus) oder Anti-CHAT (Anti-Choline Acetyltransferase; 1:150; Ziege). Siehe Materialtabelle.
5. 45 Minuten bei Raumtemperatur mit entsprechendem Esel-Sekundie-Antikörper-Paar in ABS inkubieren: Anti-Maus Alexa Fluor 647 (1:250), Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 (1:250) und Anti-Ziege Alexa Fluor 488 (1:250). Siehe Materialtabelle.
6. Inkubieren Sie in 0,4 μg/mL DAPI für 5 min bei Raumtemperatur, um Kerne zu kennzeichnen.
7. Montieren Sie die Zellen mit Mounting Medium (siehe Materialtabelle) für die Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop.

5. Funktionelle Charakterisierung über Patch-Klamperaufnahmen

1. Bereiten Sie die HEPES-ausgleichbare externe Lösung (NES) wie folgt vor: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl_,2 mM CaCl 2,2, 2 mM MgCl_2,10mM HEPES und 10 mM Glukose. Stellen Sie die Osmolarität zwischen 290-300 m-und. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 mit 1N NaOH ein und speichern Sie die Lösung bei 4 ° C.
2. Die interne Lösung vorbereiten: 140 mM K-Gluconat, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA_,2 mM MgCl 2,10 mM HEPES, 2 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP. Stellen Sie den pH-Wert mit 1M KOH auf 7,3 ein und überprüfen Sie, ob die Osmolarität auf rund 290 m angesetzt ist. Die Lösung bei-20 ° C in kleinen Aliquots einfrieren.
3. Bevor die Experimente durchgeführt werden, die NES-Lösung in einem Wasserbad auf etwa 28-30 ° C vorwärmen.
4. Ziehen Sie einige Borosilikat-Mikropipetten (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) mit einem Spitzwiderstand: 5-6 M-und mit der intrazellulären Lösung füllen, bevor sie in den Pipette-Halter eingebaut wird.
   NOTE: Denken Sie daran, die Silberdrähte der Aufzeichnungselektrode und der Referenzelektrode in Bleichmittel für mindestens 30 Minuten zu chlorid zu chlorid, um eine gleichmäßige Schicht von AgCl auf der Drahtoberfläche zu bilden.
5. Die Petrischale in die Aufnahmekammer geben und die Kammer mit der NES-Lösung bei 1-2 mL/min ablegen. Lassen Sie den Fluss durch eine Inline-Heizung bei einer Temperatur von 30 ° C gesetzt, um die Lösung warm zu halten.
6. Platzieren Sie die elektrophysiologische Aufnahmekammer unter ein aufrechtes Mikroskop. Mit dem Patch-Klemmverstärker Membranströme aufzeichnen und Daten mit einer entsprechenden Software erfassen.
7. Öffnen Sie die Verstärker-Steuerungssoftware und setzen Sie die Signalgewinne auf den Wert 1 und den Bessel-Filter auf 10 kHz. Stellen Sie sicher, dass der Bessel-Filter 2,5-mal niedriger ist als die Abtastfrequenz.
8. Stellen Sie die Versuchsprotokolle für Spannungs-und Stromklemmversuche in der Aufnahmesoftware ein.
9. In der Protokolleinstellung ticken Sie den episodischen Stimulationsmodus an und setzen die Sampling-Frequenz auf 25 kHz. Dann bewegen Sie sich auf die Wellenform und geben Sie die Spannung oder Stromschritt Amplitude und-länge als folgt.
10. Für die spannungsverschlachten Natriumströme verwenden Sie 15 Spannungsschritte (jeweils 50 ms Dauer) von-100 mV bis + 40 mV (10 mV-Zuwachs). Führen Sie das Protokoll aus, nachdem Sie der gepatchten Zelle ein Haltepotenzial von-60 mV durch den Verstärker auferlegt haben. In ähnlicher Weise werden die spannungsgezeichneten Kalienströme durch Spannungsschritte (je 250 ms Dauer) von-30 mV bis + 50 mV (10 mV-Zuwachs) hervorgerufen, die die aufgezeichnete Zelle auf-40 mV halten.
11. Für die Untersuchung der Brenneigenschaften von iPSC-abgeleiteten Schädel-und WirbelsäulenmNs, Klemmzellen, im Stromklemmmodus, bei einem Membranpotenzial von-70 mV und Verwendung von 4 Strompulsen (je 1) von zunehmender Amplitude (von + 20 pA bis + 80 pA; 20 pA-Zuwachs).
12. Erwerben Sie für jede Zelle spannungsaktivierte Ströme, evozierte Brennaktivität und drei passive Eigenschaften wie Ganzzellen-Kapazität (Cm), Zellmembranwiderstand (Rm) und Resting Membran-Potential (RMP).

Results

Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode ist in Abbildung1 dargestellt. Die menschlichen iPSCs (WT^Iline 3) wurden mit epB-Bsd-TT-NIL oder epB-Bsd-TT-NIP transferiert, wodurch bei der Blasticidin-Auswahl stabile und induzierbare Zelllinien¹²erzeugt wurden, im Folgenden iPSC-NIL und iPSC-NIP genannt. Für die Expression des Pluripotenzmarkers OCT4 und des panneuronalen Markers TUJ1 wurden unterschiedliche Zellen charakterisiert. ...

Discussion

Dieses Protokoll ermöglicht es, menschliche iPSCs dank der ektopischen Expression von linearpezifischen Transkriptionsfaktoren effizient in Wirbelsäulen-und Schädelmotorneuronen umzuwandeln. Diese Transgene sind durch Doxycyclin induzierbar und dank eines Transpokortvektors auf Sparkug stabil in das Genom integriert. In einer gemischten Population wird ein oder mehrere Exemplare des Huckepitschwein-Vektors nach dem Zufallsprinzip in das Genom einzelner Zellen integriert, was das Risiko von Veränderungen der Genomintegrit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Reagenz zur Zelldissoziation
Anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Cholin-Acetyltransferase. Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. RRID: AB_2079751; Chargennummer: 2971003
Anti-Ziegen-Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Sekundärantikörper zur Verwendung für Immonofluoreszenz-Assays. RRID: AB_2534102; Chargennummer: 1915848
Anti-Maus Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Sekundärantikörper zur Verwendung von Immonofluoreszenz-Assays. RRID: AB_162542; Losnummer: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. RRID: AB_398736; Chargennummer: 5233722
Anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. Chargennummer: E0117
Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594	Immunologische Wissenschaften	IS-20152-1	Sekundärantikörper für Immonofluoreszenz-Assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primärer Antikörper, der in Immunfärbeassays verwendet wird. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel für die Erhaltung neuronaler Zellen
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Zellgefriermedium, hier für Motoneuronen-Vorläuferzellen
verwendet BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic
Factor Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nukleosid-Antibiotikum, das die Proteinsynthese in Prokaryoten und Eukaryoten hemmt
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Rinderserumalbumin. Blockierungsmittel zur Verhinderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern in Immunfärbeassays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
Clampex 10 Software	Molecular Devices	Clampex 10	Membranstromaufzeichnungssystem
Corning Matrigel hESC-qualifizierte Matrix	Corning	354277	Rekonstituiertes Basalmembranpräparat aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkom. Wird zur Adhäsion von iPS-Zellen auf Kunststoff- und Glasträgern verwendet
CRYOSTEM ACF GEFRIERMEDIEN	Biological Industries	05-710-1E	Gefriermedium für humane iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
DAPI-Pulver Roche		10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindol. Fluoreszierender Farbstoff, der an Adenin bindet– thyminreiche Regionen in der DNA, die für die Zellkernfärbung in Immonofluoreszenz-Assays verwendet werden
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma-Sekretase-Inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagenz für die schonende Dissoziation humaner iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basalmedium für Zellkultur
Doxycyclin	Sigma-Aldrich	D9891-1G& nbsp;	Wird verwendet, um die Expression von Transgenen aus epB-BSD-TT-NIL- und epB-BSD-TT-NIP-Vektoren zu induzieren
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Kommerzielles humanes iPSC-Linie
E.Z.N.A Gesamt-RNA-Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit für die vollständige Extraktion von RNA aus kultivierten eukaryotischen Zellen
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomale hiPSC-Linie	Thermo Fisher Scientific	A18945	Kommerzielle humane iPSC-Linie
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Eine Alternative zu L-Glutamin mit erhöhter Stabilität. Verbessert die Zellgesundheit.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
iScript Reverse Transcription Supermix für RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit für die Genexpressionsanalyse mittels real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Gebrauchsfertiger Reaktions-Mastermix, optimiert für die farbstoffbasierte quantitative PCR (qPCR) auf jedem real-time PCR-Gerät
K-Gluconat	Sigma-Aldrich	G4500	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
L-Ascorbinsäure	LKT Laboratories	A7210	Wird in Zellkulturen als Antioxidans verwendet
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
Konfokales Laserscanning-Mikroskop	Olympus	iX83 FluoView1200	Konfokalmikroskop für die Aufnahme von Immunfärbebildern
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Chemikalien für elektrophysiologische
Lösungen MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
Einbettmedium	Ibidi	50001	Einbettlösung für konfokale Mikroskopie und Immunfluoreszenz-Assays
Multiclamp-Patch-Clamp-Verstärker	Molecular Devices	700B	Membranstrom-Aufzeichnungssystem
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	Chemikalien für elektrophysiologische Lösungen
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	nicht-essentielle Aminosäuren. Wird als Ergänzung für Zellkulturmedium verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen.
Neon 100 μ L Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell Elektroporationskit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell Elektroporationssystem
Neurobasales Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basalmedium für die langfristige Erhaltung und Reifung neuronaler Zellpopulationen ohne die Notwendigkeit einer Astrozyten-Feeder-Schicht
NutriStem-XF/FF	Biologische Industrie	05-100-1A	Humanes iPSC-Kulturmedium
Paraformaldehyd	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften 157-8	Wird für die Zellfixierung in Immunfärbeassays
verwendet PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung, mit Calcium, mit Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ frei	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung, ohne Calcium, ohne
Magnesium Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin-Lösung zur Verhinderung einer Zellkulturkontamination durch Bakterien.
Poly-Ornithin	Sigma-Aldrich	P4957	Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selektiver Inhibitor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylenglykol,  t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol  tert-Octylphenylether. Wird für die Zellpermeabilisierung in Immunfärbeassays verwendet
Aufrechtes Mikroskop	Olympus	BX51VI	Mikroskop für elektrophysiologische Aufzeichnungen, ausgestattet mit CoolSnap Myo Kamera
Y-27632  (ROCK-Hemmer)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Zellpermeabler selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, Coiled-Coil enthaltenden Proteinkinase (ROCK). Erhöht das iPSC-Überleben
μ-Folie 8 Well	Ibidi	80826	Unterstützung für high– Endmikroskopische Analyse von fixierten Zellen