In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Xenograft- und orthotopische Mausmodelle der menschlichen Schilddrüsentumorigenese als Plattform, um mikroRNA-basierte Inhibitorbehandlungen zu testen. Dieser Ansatz ist ideal, um die Funktion nicht-kodierender RNAs und ihr Potenzial als neue therapeutische Ziele zu untersuchen.

Zusammenfassung

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression durch ihre Fähigkeit, mRNA zu destabilisieren und die Translation von Ziel-mRNAs zu hemmen. Eine ständig wachsende Anzahl von Studien hat miRNAs als potenzielle Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose sowie als therapeutische Ziele identifiziert, was der Krebsbewertung und -behandlung eine zusätzliche Dimension hinzufügt. Im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs resultiert die Tumorgenese nicht nur aus Mutationen in wichtigen Genen, sondern auch aus der Überexpression vieler miRNAs. Dementsprechend entwickelt sich die Rolle von miRNAs bei der Kontrolle der Schilddrüsen-Genexpression als wichtiger Mechanismus bei Krebs. Hierbei stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirkung der miRNA-Hemmer-Verabreichung als therapeutische Modalität bei Schilddrüsenkrebs mit menschlichen Tumor-Xenograft- und orthotopischen Mausmodellen zu untersuchen. Nach der Entwicklung stabiler Schilddrüsentumorzellen, die GFP und Luziferase exezieren, werden Zellen in nackte Mäuse injiziert, um Tumore zu entwickeln, denen Biolumineszenz folgen kann. Die In-vivo-Hemmung einer miRNA kann das Tumorwachstum reduzieren und miRNA-Genziele hochregulieren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Bedeutung einer bestimmten miRNA in vivo zu bewerten, zusätzlich zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele.

Einleitung

Schilddrüsenkrebs ist eine endokrine Malignität mit zunehmender Inzidenz, obwohl sie im Allgemeinen ein gutes Ergebnis hat¹. Dennoch entwickeln einige Patienten aggressive Formen der Krankheit, die nicht behandelbar sind und die molekularen Grundlagen sind schlecht verstanden².

miRNAs sind 22-Nukleotid-lange nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression in vielen Geweben regulieren, typischerweise durch Basispaarbindung an die 3' untranslationale Region (3'UTR) von Target Messenger RNAs (mRNAs), die mRNA-Abbau oder translationale Repression auslösen ^{3 ,}

Protokoll

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Gemeinschaftsrecht (86/609/EWG) und dem spanischen Gesetz (R.D. 1201/2005) mit Zustimmung der Ethikkommission des Consejo Superior de Investigaciones Cientéficas (CSIC, Spanien) durchgeführt.

1. Flankenimpfung von Zellen und intratumorale AntagomiR-Behandlung

1. Zellvorbereitung
   1. Entwickeln Sie eine Cal62-Humanschilddrüsenkrebs-Zelllinie (KRAS^G12R und p53^{A161D-Mutationen),} um ein transgenes Konstrukt zu überprimieren, das GFP und Luziferase konstitutiv ausdrückt (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Wählen Sie die transgenen Zellen nach Antibiotikar....

Ergebnisse

Wir verwendeten zwei verschiedene Mäusemodelle, um zu bestimmen, ob die Neutralisation einer miRNA das Tumorwachstum unterdrücken könnte. Dementsprechend wurden die menschlichen Tumorschild-Cal62-luc-Zellen subkutan in die Flanken von Nacktmäusen injiziert, um ein Xenographenmodell zu erzeugen. Nach zwei Wochen wurden Tumore festgestellt und konnten mit Sätteln gemessen werden. Zu diesem Zeitpunkt wurden Mäuse intratumoral mit dem miR-146b-Hemmer injiziert, oder eine entsprechende Kontrolle, und das Tumorvolumen wurde fü.......

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung der In-vivo-Funktion einer miRNA, um ihre Rolle bei der Tumorinitiierung und -progression und ihr Potenzial als therapeutisches Ziel bei Schilddrüsenkrebs besser zu verstehen. Die hier beschriebenen Tumor-Xenograft-Modelle basieren auf der Verwendung von Zellen, die durch ihr Biolumineszenzsignal verfolgt werden können, was die Messung des Tumorwachstums in vivo unter dem Einfluss einer Behandlung ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Verwendung einer miRNA.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AntagomiR: mirVana miRNA-Inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basal Membran Matrix: Matrigel Basalmembranmatrix Hochkonzentriertes	Corning	#354248
DICER Antikörper	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo Verabreichungsreagenz: Invivofectamine 3.0 Reagenz	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo Bildgebungssoftware: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative Kontrolle: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA Antikörper	Abcam	ab92552	WB: 1/2.000
PTEN Antikörper	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1.000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salz Biolumineszierendes Substrat	PerkinElmer	122799	verdünnt in PBS