Methodenartikel

Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen

DOI:

10.3791/59325

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20. August 2019

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1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung vor, um die Endothelzellen der Mausaorta direkt zu beobachten. Diese Technik ist nützlich, wenn der zelluläre und molekulare Phänotyp von Endothelzellen in verschiedenen Strömungsmustern und bei der Entwicklung von Arteriosklerose untersucht wird.

Zusammenfassung

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Aberrante Veränderungen des endotheliaalen Phänotyps und der Morphologie gelten als Erste in der Pathogenese der Arteriosklerose. Die direkte Beobachtung des intakten Endothels liefert wertvolle Informationen zum Verständnis der zellulären und molekularen Ereignisse in den dysfunktionalen Endothelzellen. Hier beschreiben wir eine modifizierte En-Face-Immunfluoreszenz-Färbungstechnik, die es Wissenschaftlern ermöglicht, klare Bilder der intakten endotheliaalen Oberfläche zu erhalten und die Molekülexpressionsmuster vor Ort zu analysieren. Die Methode ist einfach und zuverlässig für die Beobachtung der gesamten endotheliale Monolayer an verschiedenen Stellen der Aorta. Diese Technik kann ein vielversprechendes Werkzeug sein, um die Pathophysiologie der Arteriosklerose zu verstehen, besonders in einem frühen Stadium.

Einleitung

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Die frühen Veränderungen in der Vaskulatur initiieren vor allem das Endothel, das als selektive Barriere zwischen Blut und Gefäßwand mit seinen interzellulären engen Kreuzungskomplexen1fungiert. Erhebliche Beweise deuten auf eine entscheidende Rolle für die mechanischen Auswirkungen des Blutflusses bei der Modulation der Endothelfunktion2hin. Fluidscherspannung, eine Reibungskraft, die durch den Blutfluss erzeugt wird, formt die Endothelzellmorphologie und -funktion differenziell, abhängig von den spezifischen Strömungsparadigmen an verschiedenen Gefäßstellen2,3.....

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit experimentellen Protokollen durchgeführt, die vom Committee on Animal Resources der Shanghai Jiao Tong University genehmigt wurden.

1. Perfusion der Maus aorta

  1. Kurz gesagt, anästhet 12 Wochen alte C57BL/6 Mäuse mit intraperitonealen Injektionen von Natriumpentobarbital (50 mg/kg Körpergewicht). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, indem Sie den Schwanz sanft kneifen.
    HINWEIS: Wenn keine Bewegung beobachtet wird, ist das Tier ausreichend beästhetisiert, um die Experimente zu starten.
  2. Verkleben Sie die Pfoten der Maus mit Klebebändern auf einen Stapel Papiertücher.
    3. ....

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Ergebnisse

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Eine 12 Wochen alte C57BL/6-Maus wurde eingeschläfert und mit normaler Saline mit 40 Einheiten/ml Heparin durchsetzt und dann 4% Paraformaldehyd vorgechillt. Die Mausaorta wurde unter einem Sezierendes Mikroskop (Abbildung 1) ausgesetzt, seziert und längs aufgeschnitten (Abbildung 2). Die Immunfluoreszenzfärbung der vaskulären Endothelzellen wurde wie in Abbildung 3 und Tabelle 1darg.......

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Diskussion

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Das Endothel ist zahlreichen proatherogen Faktoren ausgesetzt, einschließlich Lipiden, Entzündungsmediatoren und Flüssigkeitsscherspannung1,11,12. Die direkte Beobachtung von Endothelzellen vor Ort bietet die besonderen Vorteile, Veränderungen in der Zellmorphologie, interzellulären Knoten und Molekülexpressionsmustern als Reaktion auf die Verletzungsreize zu analysieren.

Frühere Studien haben zwei ve.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81670451, 81770430), dem Shanghai Rising-Star Program (Grant No. 17QA1403000) und dem Science Technology Committee der Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antifading-EindeckmittelServicebioG1401
Zarte PinzetteRWD Life ScienceF11001-11
Zarte SchereRWD Life ScienceS12003-09
PräparierzangeRWD Life ScienceF12005-10
Mciro FederschereRWD Life ScienceS11001-08
Polyoxyethylenoctylphenylether (Triton X-100)AmrescoM143
Polysorbat 20 (Tween 20)Amresco0777
VCAM-1 AntikörperAbcamab134047
VE-Cadherin AntikörperBD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 markiert Anti-Kaninchen IgGInvitrogenA-31572
Alexa Fluor 488 markiert Anti-Ratten-IgGInvitrogenA-21208
Laser-Scanning-Mikroskop Carl Zeiss

Referenzen

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  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and ....

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Schlagwörter

AortendissektionKonfokalmikroskopieVCAM 1 ExpressionVE Cadherin MarkerFl ssigkeitsscherstressDAPI Gegenf rbungEndothelmorphologieAtheroskleroseforschung

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