Methodenartikel

Eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum und das Überleben in kultivierten Säugetierzellen bei niedrigem bis moderatem Durchsatz beeinflussen

DOI:

10.3791/59333

⸱

22. September 2019

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), Neurotherapeutic Development Unit (NTDU), National Institutes of Health (NIH)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es ist oft notwendig, die potenzielle Zytotoxizität einer Reihe von Verbindungen auf kultivierten Zellen zu bewerten. Hier beschreiben wir eine Strategie, um auf toxische Verbindungen zuverlässig im 96-Well-Format zu überprüfen.

Zusammenfassung

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Zytotoxizität ist ein kritischer Parameter, der quantifiziert werden muss, wenn Medikamente untersucht werden, die therapeutische Vorteile haben können. Aus diesem Grund, viele Arzneimittel-Screening-Assays nutzen Zytotoxizität als eine der kritischen Eigenschaften für einzelne Verbindungen profiliert werden. Zellen in kultur sind ein nützliches Modell, um die Zytotoxizität zu bewerten, bevor sie vielversprechende Bleiverbindungen in teureren und arbeitsintensiveren Tiermodellen weiterverfolgen. Wir beschreiben eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum in einer tdTomato-exemitzenten menschlichen neuronalen Stammzellenlinie (NSC) beeinflussen. Die Strategie verwendet zwei ergänzende Assays, um die Zellzahl zu bewerten. Ein Assay funktioniert über die Reduktion von 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazan als Proxy für die Zellzahl und der andere zählt direkt die tdTomato-exemitten NSCs. Die beiden Assays können gleichzeitig in einem einzigen Experiment durchgeführt werden und sind nicht arbeitsintensiv, schnell und kostengünstig. Die in dieser Demonstration beschriebene Strategie testete 57 Verbindungen in einem explorativen Primärbildschirm auf Toxizität in einem 96-Well-Plattenformat. Drei der Treffer wurden weiter in einer Sechs-Punkt-Dosis-Antwort mit dem gleichen Assay-Setup wie der primäre Bildschirm charakterisiert. Neben der hervorragenden Bestätigung der Toxizität kann der Vergleich der Ergebnisse der beiden Assays auch bei der Identifizierung von Verbindungen, die andere Aspekte des Zellwachstums beeinflussen, wirksam sein.

Einleitung

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Eines der wichtigsten Merkmale, die für eine chemische Verbindung mit therapeutischem Potenzial bestimmt werden müssen, ist ihre Toxizität für tierische Zellen. Diese Eigenschaft wird bestimmen, ob ein Medikament ein guter Kandidat für eine umfassendere Studie ist. In den meisten Fällen werden Verbindungen mit minimaler Toxizität gesucht, aber es gibt Situationen, in denen eine Verbindung mit der Fähigkeit, bestimmte Zelltypen abzutöten, von Interesse ist, z. B. antitumorgene Medikamente. Obwohl ganze Tiere die besten Modellsysteme sind, um die systemische Toxizität zu bestimmen, sind die Damit verbundenen Kosten und Arbeitsstoffe unerschwinglich, wenn mehr als ein paar Verbindungen getestet werden müssen. Als solche Säugetierzellkultur wird in der Regel als die effizienteste Alternativeverwendet 1,2. Kleine bis mittlere Durchsatz-Drogen-Screens sind eine wichtige Modalität, durch die Toxizität in der Zellkultur beurteilt werden kann. Diese Bildschirme können verwendet werden, um annotierte Bibliotheken abzuhören, die auf einzelne Signalwege abzielen. Das allgemeine Format eines solchen Bildschirms besteht darin, zunächst alle Verbindungen in der Bibliothek in einer Einzeldosis (in der Regel 10 M) in einem explorativen primären Toxizitätsbildschirm zu testen und dann einen tiefen Sekundärdosis-Reaktionsbildschirm durchzuführen, um die Toxizität vollständig zu charakterisieren. Profil der Treffer vom primären Bildschirm. Die Methoden zur Umsetzung dieser Strategie werden hier beschrieben und bieten eine schnelle, effiziente und kostengünstige Möglichkeit, toxische Verbindungen zu identifizieren und zu charakterisieren.

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um die Zytotoxizität kleiner Verbindungen und Nanomaterial in Säugetierzellen3,4zu bewerten. Es sollte beachtet werden, dass bestimmte Materialien mit dem Test interagieren können, der irreführende Ergebnisse liefert, und solche Wechselwirkungen sollten bei der Charakterisierung von Treffern von Toxizitätsbildschirmen getestet werden4. Zytotoxizitäts-Assays umfassen Trypanblau-Ausschluss5, Lactat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest6, Alamar blue assay7, calcien acetoxymethyl ester (AM)8, und der ATP-Assay9. Alle diese Assays messen verschiedene Aspekte des Zellstoffwechsels, die als Proxy für die Zellzahl dienen können. Während alle Vorteile bieten, Tetrazoliumsalz-basierte Assays wie 3-(4,5-Dimethylthizol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-Tetrazolium-5-carboxyaniliid Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzoldisulfonat (WST-1)10,11 bieten eine gute Genauigkeit und Benutzerfreundlichkeit bei niedrigen Kosten. MTT, das in dieser Demonstration verwendet wird, wird durch eine mitochondriale Reduktase auf ein unlösliches Formazan reduziert, und die Rate dieser Umwandlung korreliert stark mit der Zellzahl. Dieser Assay wurde routinemäßig sowohl in kleinem Maßstab als auch für Screening-Bibliotheken mit bis zu 2.000 Verbindungen12verwendet. Die direkte Zählung von Zellen durch einen markierten Marker bietet eine weitere Methode zur Bewertung der Zellzahl, und im Gegensatz zum MTT-Assay kann es zusätzliche Informationen über die Dynamik des Zellwachstums liefern. Mehrere öffentlich verfügbare Algorithmen stehen zur Verfügung, um automatisierte Zellzählanalysen durchzuführen, und es gibt auch proprietäre Algorithmen, die Teil von Softwarepaketen für Imaging-Reader13,14sind. In dieser Methodenbeschreibung dient eine menschliche neuronale Stammzelllinie (NSC), die genetisch so bearbeitet wurde, dass tdTomato15 konstitutiv ausdrückt, als Testlinie, um die Ergebnisse der zellulären Lebensfähigkeit zwischen einem MTT-Assay und einer automatisierten Zellzählung zu vergleichen. Test in einem Sieb zur Beurteilung der Toxizität von 57 Prüfverbindungen. Obwohl das primäre Ziel dieser Strategie war, toxische Verbindungen zu identifizieren und zu charakterisieren, hat es den zusätzlichen Vorteil der potenziell identifizierenwachstumshemmenden und wachstumsfördernden Verbindungen und bietet somit eine wirksame Methode zur Identifizierung von Medikamenten die das zelluläre Wachstum modulieren können.

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Protokoll

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1. NSC-Kultur

HINWEIS: Die Manipulation einer menschlichen NSC-Linie wird unten beschrieben, aber jede Zelllinie kann für dieses Protokoll verwendet werden. Die gesamte Zellkulturarbeit wird in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt.

  1. Beschichten Sie eine 96-Well-Platte mit Kellermembran/extrazellulärer Matrix (ECM).
    1. Thaw aliquot von ECM (Tabelle der Materialien), die Befestigung von NSC erleichtern wird, auf Eis. ECM auf die entsprechende Konzentration (in der Regel 1:100) in 10 ml Basismedium(Materialtabelle)verdünnen und je 60 Innenbrunnen einer 96-Well-Platte 50 l pro Brunnen hinzufügen (Abbildung 1). Verwenden Sie nur die inneren 60 Brunnen, um Artefakte zu vermeiden, die sich aus dem Kanteneffekt 16 ergebenkönnen.
    2. Lassen Sie die Platte mindestens 30 min bei Raumtemperatur oder in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5%CO2)sitzen.
  2. Dissoziieren und Platten neuronalen Stammzellen.
    HINWEIS: Zellen für die Verwendung bei dieser Methode sollten in einem T75-Kolben auf mindestens 80 % Zusammenfluss angebaut werden.
    1. Kulturzellen in einem T75-Kolben in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 in NSC-Medium, das aus Basismedium, B27, nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM Glutamin und 10 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGFb oder FGF2) besteht.
    2. Entfernen Sie Zellen aus dem Inkubator, sobald sie 80% Zusammenfluss erreichen und aspirieren Sie NSC-Medium. Fügen Sie eine angemessene Menge an Zelldissoziationsreagenz (3 ml für einen T75-Kolben; Materialtabelle) und inkubieren Sie für 5 min im Inkubator.
    3. Nach der Inkubation 7 ml NSC-Medium in den T75-Kolben und die Pipette geben, um sicherzustellen, dass sich alle Zellen lösen. Übertragen Sie die dissoziierte Zelllösung für 5 min auf ein 15 ml-Rohr und eine Zentrifuge bei 200 x g.
    4. Nach der Zentrifugation, entfernen Überstand aus dem Rohr und resuspendieren Zellen in 10 ml NSC Medium und zählen Zellen.
    5. Stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 200.000 Zellen/ml mit NSC-Medium um. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vollständig resuspendiert werden, um eine homogene Beschichtung in Brunnen zu erhalten.
    6. Platte 100 l des Zellgemisches (20.000 Zellen) in den 60 Innenbrunnen von drei 96-Well-Platten, die gemäß Abschnitt 1.1 beschichtet wurden. Verwenden Sie sechs der acht Schlitze eines 8-Kanal-Mehrkanal-Pipettors, um Zellen Spaltenfürs zu plattieren.
    7. Fügen Sie 100 L Basismedium oder NSC-Medium zu allen Brunnen ohne Zellen hinzu, um die potenzielle Verdunstung aus äußersten Brunnen zu minimieren.
    8. Unter einem Zellkulturmikroskop untersuchen Sie visuell mindestens 10 Brunnen auf jeder der drei 96-Well-Platten, um zu bestätigen, dass die Zellen mit der erwarteten Dichte gesät sind. Gehen Sie nicht mit dem Test fort, wenn Zellen mit einer dichte zu spärlichen oder dichten Dichte plattiert sind.

2. Behandlung von Zellen mit Verbindungen

HINWEIS: Die in dieser Demonstration getestete hausgemachte Bibliothek enthält Verbindungen, die flügellose/integrierte (Wnt), Retinsäure, transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGF-B) und schallige Igel-Signalwege sowie eine Vielzahl von Tyrosin-Kiinasen modulieren.

  1. Explorativer Primärbildschirm für Toxizität/Zellnummer
    1. Aliquot 50 x 100 ml bis zu 57 Prüfverbindungen (Zusatztabelle 1) bei einer Konzentration von 10 mM in 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) in den Innenraum 60 Brunnen einer U-Boden-, V-Boden- oder Rundboden-96-Wellplatte mit drei DMSO-Bohrungen als Steuerung (siehe Abbildung 1 für eine Plattenkarte). Dies dient als Master-Compound-Platte mit 25 l Verbindung, die eingefroren und mehrmals aufgetaut werden kann.
      HINWEIS: Flachbodenplatten sollten nicht verwendet werden, da es schwieriger sein wird, kleine Mengen von Verbindungen von ihnen mit einem Tisch-Top-Pipettor zu saugen.
    2. Entfernen Sie Zellkulturplatten aus dem Inkubator 16-24 h nach dem Aufteilen, wie in Abschnitt 1 beschrieben, und aspirieren Sie NSC-Mittelspalte für Spalte mit einem 8-Kanal-Multi-Well-Pipettor mit nur sechs der acht Multi-Well-Steckplätze. Fügen Sie in jeder der drei Replikationsplatten 95 L frisches NSC-Medium zu Zellen hinzu und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator, bis Schritt 2.1.4 unten abgeschlossen ist.
    3. Fügen Sie 49 L NSC-Medium zu jedem der Inneren 60 Brunnen einer leeren U-Boden, V-Boden oder rund-Boden 96-Well-Platte mit einem 8-Kanal Multi-Well Pipettor. Entsiegeln Sie die Master-Compound-Platte und verwenden Sie einen Tisch-Top-Pipettor oder ein gleichwertiges Instrument, um Pipette 1 'L der Verbindung von der Master-Platte in die 49 l NSC Medium in jedem der inneren 60 Brunnen.
    4. Mischen Sie die verdünnte Verbindung 3x mit dem Tisch-Top-Pipettor.
    5. Entfernen Sie die drei 96-Well-Platten von NSCs aus dem Inkubator, Pipette 15 l jeder verdünnten Verbindung mit dem Tisch-Top-Pipettor und geben Sie eine 5 -L Aliquot der Verbindung in jede der drei Platten.
      ANMERKUNG: Diese 1:20 Verdünnung der Verbindung in die Zellen in Kombination mit der anfänglichen Verdünnung von 1:50 in Schritt 2.1.3 ergibt eine Verdünnung von 1:1000, so dass die Endkonzentration der Verbindungen auf den NSCs 10 m bei einer DMSO-Konzentration von 0,1% und die endgültige Konzentration für die DMSO-Kontrollen 0,1%.
    6. Inkubieren Sie Zellen mit Verbindung für 72 h und fahren Sie mit Zytotoxizitätstests fort. Kürzere Intervalle können verwendet werden, aber eine 72-stündige Inkubationszeit sollte die potenziellen zytotoxischen Wirkungen getesteter Verbindungen maximieren.
  2. Dosis-Antwort-Assay
    HINWEIS: Die Einrichtung für den 96-Well, der für die Dosis-Wirkung verwendet wird, ist in Abbildung 2dargestellt.
    1. Verwenden Sie Spalte 2 für sechs DMSO-Kontrollreplikationen und Test-Triplicate von bis zu drei verschiedenen Verbindungen bei zweifachen seriellen Verdünnungen bei sechs Dosen ab einer hohen Dosis von 10 M.
    2. Verdünnen Sie 4 l DMSO oder Testverbindung in DMSO in 196 l NSC-Medium in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie der Bohrsäule von B2-G2 und 50 l Testverbindungen 25 l DMSO mit den drei getesteten Verbindungen in 10 mM-Triplicaten in den Reihen B3-B5, B6-B8 und B9-B11 in die Reihe.
    3. Pipette 25 l NSC-Medium bis zu den restlichen leeren Säulen im Innenbereich der 96-Well-Platte. Entfernen Sie 25 l Verbindung aus den Brunnen B3-B11 mit einem Mehrkanalpipettor, fügen Sie zu den Bohrungen C3-C11, und mischen Sie mindestens fünf Mal. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Reihen, um Triplicate bei zweifachen Verdünnungen für insgesamt sechs Dosen für jede der Verbindungen zu erzeugen.
    4. Generieren Sie NSCs für die Dosisantwort genau wie für den primären Bildschirm in Abschnitt 2.1 beschrieben. Die Verbindungen für die Dosisreaktion werden den Zellen genau wie in den Schritten 2.1.5 und 2.1.6 beschrieben zugegeben und inkubiert.
      HINWEIS: Drei biologische Repliken des Dosisreaktionsassays werden durchgeführt, indem der Assay auf den NSCs an verschiedenen Stellen an verschiedenen Tagen wiederholt wird.

3. Bildzellen auf einem Plattenleser

  1. Nachdem Zellen mit Verbindungen für die zugeteilte Zeit inkubiert wurden, bilden Bildzellen auf einem Plattenleser, um die Vorbehandlungszellzahl pro Brunnen zu bestimmen.
    HINWEIS: Anweisungen für bildgebende Zellen sind leserspezifisch, verfolgen aber im Allgemeinen eine ähnliche Strategie. Die nachstehenden Anweisungen gelten für den in dieser Demo verwendeten Leser (Materialtabelle).
  2. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie in den Plattenleser. Öffnen Sie die Imager-Software, um Protokoll- und Experimentierdateien für die Studie einzurichten. Wechseln Sie zum manuellen Imager-Modus im Task-Manager und klicken Sie auf Jetzt erfassen....
  3. Wählen Sie 96-Well-Platte als Gefäßtyp, wählen Sie 10x für die Vergrößerung und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) 531 und 593 für die Abbildung tdTomato. Wählen Sie einen Brunnen aus, und klicken Sie dann auf Autofokus, um das Bild zu fokussieren, und auf Auto Expose für die richtige Belichtungszeit. Passen Sie den Fokus und die Belichtung bei Bedarf manuell an.
  4. Sobald der richtige Fokus und die Belichtung erreicht wurden, klicken Sie auf das Kamerasymbol, um das Bild aufzunehmen. Klicken Sie dann auf PROCESS/ANALZYE oben, um mit dem Erstellen des Protokolls fortzufahren, und wählen Sie die Registerkarte ANALYSIS aus.
  5. Klicken Sie in ADD ANALYSIS STEP rechts neben dem Bild auf Zellzellanalyse und klicken Sie auf START. Das Bild zeigt hervorgehobene Zellen an, um jede einzelne Zelle anzuzeigen. Die Auswahl Optionen kann angeklickt werden, um Parameter zu ändern, um Zellen basierend auf dem Fluoreszenzschwellenwert oder der Zellengröße besser auszuwählen. Wenn der Imager die Zellen richtig zählt, klicken Sie unten auf dem Bildschirm auf ADD STEP.
  6. Klicken Sie auf das Symbol oben auf dem Bildschirm, um Experimente aus dem Bildsatzzu erstellen, wodurch ein Fenster mit dem Experiment geöffnet wird. Nach dem Öffnen klicken Sie auf Prozedur unter der Registerkarte Protokoll und im neuen Fenster, das die Option Lesenöffnet, klicken Sie dann im neuen Fenster auf die vollständige Platte, um nur die 60 Bohrungen auszuwählen, die die Zellen enthalten (B2... G11). Klicken Sie auf OK, um Änderungen zu speichern, und klicken Sie dann im Prozedurfenster auf OK.
  7. Die Platte kann nun durch dieses Protokoll abgebildet und die experimentelle Datei gespeichert werden. Klicken Sie auf das Wiedergabesymbol, um die Platte auszuführen. Sobald die erste Platte abgebildet ist, stellen Sie die beiden anderen Platten ab. Laden Sie nach Abschluss der Abbildung die Zellenzähldaten zur Analyse in eine Kalkulationstabelle herunter. Nehmen Sie alle Bilder mit 10-facher Vergrößerung auf.

4. Terminal MTT Zytotoxizität Assay

HINWEIS: Beginnen Sie den MTT-Test innerhalb von zwei Stunden nach Abschluss der tdTomato-Bildgebung.

  1. Machen Sie eine 5 mg/ml MTT-Stammlösung, indem Sie 25 mg MTT auswiegen und in 5 ml NSC-Medium wieder aufhängen. Wirbel die Lösung, bis es keine sichtbaren Ausscheidungen von MTT, die mehrere Minuten dauern kann.
  2. Entfernen Sie Zellkulturplatten aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium Zellkultur. Verdünnen Sie MTT 1:10 im Zellkulturmedium und fügen Sie jedem Bohrkörper der Zellen 100 l MTT hinzu.
  3. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C für 2 h. Ein purpurner Niederschlag sollte in etwa im Verhältnis zur Anzahl der Zellen im Brunnen sichtbar sein. Entweder die MTT-Lösung von Platten absaugen oder die Platte schnell umkehren, um die Lösung aus der Platte zu streichen.
  4. Fügen Sie jedem Brunnen 50 l mit 100 % DMSO hinzu und schütteln Sie Platten bei Raumtemperatur für 10 min bei 400 Rpross. Lesen Sie die Absorption jedes Bohrguts bei 595 nm in einem Plattenleser und exportieren Sie Daten zur Analyse in eine Kalkulationstabelle.

5. Datenanalyse

  1. Führen Sie eine Analyse der Anzahl und Absorption von tdTomato-Zellen mit entsprechender Software (kommerzielle Kalkulationstabelle, R) durch. Berechnen Sie Durchschnittswerte für die Absorption oder Zellanzahl der drei DMSO-Replikationen auf jeder Platte für Normalisierungszwecke, dividieren Sie dann den Wert für die Zellzahl oder Absorption für jeden Brunnen auf der Platte durch diesen Durchschnitt und konvertieren Sie in einen Prozentsatz. Dies ergibt die normalisierte Zellzahl oder Absorption relativ zur DMSO-Steuerung für jede Platte.
  2. Berechnen Sie den mittleren normalisierten Wert oder die Absorption und Standardabweichung für Repliziieren von Bohrungen auf den drei Platten.
    HINWEIS: An dieser Stelle sollte es vier verschiedene Sätze normalisierter Werte geben: einen für jede der Platten und einen Mittelwert für die drei Replikationsplatten.
  3. Seien Sie konservativ und verwenden Sie einen normalisierten Wert bei oder unter 25 % für den Durchschnitt über die drei Replikationsplatten, um eine Verbindung als toxisch zu klassifizieren. Auch, weil nur eine einzige Behandlung pro Verbindung auf jeder Platte durchgeführt wird, nur Etikettenverbindungen, die unter diesen Schwellenwert auf allen drei replizieren Platten als toxisch. Untersuchen Sie fluoreszierende Bilder aller Verbindungen, die diese Analyse als toxisch filtert, um die Toxizität visuell zu bestätigen.
    ANMERKUNG: Die Identifizierung von Verbindungen mit einer wachstumshemmenden oder wachstumsfördernden Wirkung ist schwieriger in einem explorativen Test dieser Art zu beurteilen, da auf jeder Platte keine Wiederholungen zu verzeichnen sind. Jedoch, Das Folgende ist eine schnelle Möglichkeit, Verbindungen zu identifizieren, die entweder verlangsamen oder zelluläres Wachstum zu verbessern.
  4. Berechnen Sie die Standardabweichung für die drei replizierenden DMSO-Steuerelemente auf jeder Platte, und filtern Sie dann nach Verbindungen, deren Durchschnittswerte mindestens zwei Standardabweichungen über oder unter der DMSO-Steuerung aufweisen. Verbindungen, die aus diesem Filter auf jeder der drei Platten fallen, können eine weitere Untersuchung rechtfertigen.
  5. Verwenden Sie die gleiche Analysestrategie für die Dosisreaktion wie der primäre Toxizitätsbildschirm. Berechnen Sie die Durchschnittswerte für die DMSO-Steuerelemente für jede biologische Replikation und verwenden Sie diese Werte, um die prozentualen Absorptionszellen oder prozentuale Absorptionen für jede Kombination aus Verbindung/Dosis zu normalisieren. Berechnen Sie die Mittelwerte und den Standardfehler der Mittelwerte für alle Kombinationen zwischen Verbindung und Dosis für die drei biologischen Replikationen.
  6. Transformieren Sie die Konzentration in ihren Log-Wert, erzeugen Sie eine Dosis-Antwort-Kurve für das Konzentrationsprotokoll im Vergleich zur normalisierten Lebensfähigkeit und passen Sie die Kurve mit einer nichtlinearen Regressionsanalyse an (die Analyse kann in R oder verschiedenen kommerziellen statistischen Pakete). Berechnen Sie die tödliche Dosis 50 (oder in diesem Fall technisch die lebensfähige Dosis 50) oder die Konzentration der Verbindung, die zu einer 50%igen Toxizität aus der Gleichung dieser Kurve führt. Viele Softwarepakete berechnen diese Zahl automatisch.

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Ergebnisse

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Die automatisierten Zellzähldaten identifizierten elf Verbindungen mit weniger als 25 % Lebensfähigkeit bei normalisierter DMSO-Kontrolle, während die MTT-Daten dieselben Verbindungen sowie zwei zusätzliche Verbindungen identifizierten(Tabelle 1 und Tabelle 2, schattiert rot). Die beiden Verbindungen, die nur im MTT-Assay (Wells F3 und G10) als toxisch eingestuft wurden, hatten 31 % bzw. 39 %, die Anzahl der tdTomato-positiven Zellen als Kontroll- und Rangreihenfolge waren die nächsten b...

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Diskussion

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Das primäre Ziel dieses Artikels war es, eine Strategie zu beschreiben, die Verbindungen, die das Zellwachstum beeinflussen, effizient und kostengünstig in einem Screening mit niedrigem bis moderatem Durchsatz identifizieren könnte. Zwei orthogonale Techniken wurden verwendet, um die Zellzahl zu bewerten, um das Vertrauen in die Schlussfolgerungen zu erhöhen und zusätzliche Erkenntnisse zu bieten, die nicht verfügbar wären, wenn nur ein einziger Test verwendet würde. Einer der Assays verwendete einen fluoreszierenden Zel...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom NINDS Intramural Research Program unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B-27 (50X)ThermoFisher Scientific17504001Mediumkomponente für neurale Stammzellen.   
TischpipettierungSorenson Bioscience73990Bietet die Möglichkeit, die Verbindungsbibliothek in einem Schuss in eine 96-Well-Platte zu pipettieren.
BioLite 96 Well MultidishThermo Scientific130188Jede 96-Well-Zellkulturplatte funktioniert.  Diese nutzen wir in unserer Arbeit.
ZellkulturmikroskopNikonEclipse TS100Visuelle Inspektion der Zellen, um die richtige Dichte zu gewährleisten.
Cytation 5/ Imaging ReaderBioTekCYT3MFVWird für die Zellbildgebung und Absorptionsmessungen verwendet.
DMSOFisher Scientific610420010Lösungsmittel für Verbindungen, die im Sieb verwendet werden. Löst MTT-Ausfällungen auf, um Absorptionsmessungen zu erleichtern.
FGF-basicPeprotech100-18BMediumkomponente für neurale Stammzellen.  
GelTrexThermoFisher ScientificA1413202Basalmembran-Matrix für neurale Stammzellen. Ermöglicht das Anheften von Zellen an Zellkulturplatten.
Gen5 3.04BioTekAnalysesoftware zur Bestimmung der Zellzahl für tdTomato-exprimierende Zellen.
GlutaminThermoFisher Scientific25030081Mittlere Komponente der neuralen Stammzelle.  
Microtest U-BottomBecton Dickinson3077Lagerung von Substanzbibliotheken.
MTTThermoFisher ScientificM6494Aktives Assay-Reagenz zur Bestimmung der zellulären Lebensfähigkeit.
Mehrkanal-PippetteRaininE8-1200Säulenweise Zugabe von Zellkulturmedium, MTT oder DMSO.
Neurobasales MediumThermoFisher Scientific21103049Basismedium für neuronale Stammzellen.
RFP-FilterwürfelBioTek1225103Filter in Cytation 5 zur Abbildung von tdTomato-exprimierenden Zellen.
TrypLEThermoFisher Scientific12605036Reagenz zur Zelldissoziation.

Referenzen

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ZellwachstumsassayZytotoxit ts ScreeningMTT AssaytdTomato Imagingneurale StammzellenWirkstoff ScreeningDosis Wirkungs BeziehungZellz hlungDMSO BehandlungPlattenleseger t

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