HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Huacheng Luo; Amin Sobh; Christopher  D. Vulpe; Edmond Brewer; Sinisa Dovat; Yi Qiu; Suming Huang

doi:10.3791/59382

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Methodenartikel

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

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DOI:

10.3791/59382

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31. März 2019

Huacheng Luo¹ , Amin Sobh² , Christopher D. Vulpe² , Edmond Brewer¹ , Sinisa Dovat¹ , Yi Qiu³ , Suming Huang¹

¹Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, ²Department of Physiological Sciences, University of Florida, ³Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

Zusammenfassung

CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)-vermittelten stabile topologisch Domänen zuordnen (TADs) spielen eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die im benachbarten TADs befinden. CTCF spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des räumlichen und zeitlichen Ausdrucks der HOX -Gene, die embryonale Entwicklung, Körper Musterung, Blutbildung und Leukemogenesis zu steuern. Es bleibt jedoch weitgehend unbekannt, ob und wie HOX Loci verbundenen CTCF Grenzen Chromatin Organisation und HOX -gen-Expression zu regulieren. In dem aktuellen Protokoll hat eine spezifische SgRNA gepoolte Bibliothek gezielt alle CTCF Bindungsstellen in den HOXA/B/C/D -Loci generiert, um die Auswirkungen der Störung CTCF-assoziierten Chromatin Grenzen auf TAD Bildung und HOX -gen untersuchen Ausdruck. Durch CRISPR-Cas9 wurde genetisches Screening, die CTCF Bindungsstelle befindet sich zwischen HOXA7/HOXA9 -Gene (CBS7/9) als kritische Regulator des onkogenen Chromatin Domäne sowie als wichtig für die Aufrechterhaltung der ektopische HOX -Gen identifiziert Expressionsmuster in neu geordnet, MLL akute myeloische Leukämie (AML). Also, diese SgRNA Bibliothek screening-Ansatz bietet neue Einblicke in CTCF vermittelte Genom-Organisation in spezifischen Gen-Loci und auch die Grundlage für die funktionelle Charakterisierung der kommentierten genetische regulatorischen Elemente, beide Codierung und Forensisches, während normale biologische Prozesse in der Post-humanen Genom-Projekt-Ära.

Einleitung

Neuere Genom Interaktion Studien gezeigt, dass die menschliche Genom Formen topologisch verknüpfen Domänen (TADs) stabil, die in Zelle Arten und Arten konserviert sind. Die Organisation des Genoms in separaten Domänen erleichtert und schränkt die Wechselwirkungen zwischen regulatorische Elemente (z. B. Geschmacksverstärker und Promotoren). CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF) bindet an TAD Grenzen und spielt eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die in benachbarten TADs¹befinden. Genom breite CTCF binden von Daten ergaben jedoch, dass obwohl CTCF meist mit der gleichen DNA-Standorten in verschiedenen Zelltypen intera....