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HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

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DOI:

10.3791/59382

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31. März 2019

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1Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Physiological Sciences, University of Florida, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

Zusammenfassung

CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)-vermittelten stabile topologisch Domänen zuordnen (TADs) spielen eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die im benachbarten TADs befinden. CTCF spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des räumlichen und zeitlichen Ausdrucks der HOX -Gene, die embryonale Entwicklung, Körper Musterung, Blutbildung und Leukemogenesis zu steuern. Es bleibt jedoch weitgehend unbekannt, ob und wie HOX Loci verbundenen CTCF Grenzen Chromatin Organisation und HOX -gen-Expression zu regulieren. In dem aktuellen Protokoll hat eine spezifische SgRNA gepoolte Bibliothek gezielt alle CTCF Bindungsstellen in den HOXA/B/C/D -Loci generiert, um die Auswirkungen der Störung CTCF-assoziierten Chromatin Grenzen auf TAD Bildung und HOX -gen untersuchen Ausdruck. Durch CRISPR-Cas9 wurde genetisches Screening, die CTCF Bindungsstelle befindet sich zwischen HOXA7/HOXA9 -Gene (CBS7/9) als kritische Regulator des onkogenen Chromatin Domäne sowie als wichtig für die Aufrechterhaltung der ektopische HOX -Gen identifiziert Expressionsmuster in neu geordnet, MLL akute myeloische Leukämie (AML). Also, diese SgRNA Bibliothek screening-Ansatz bietet neue Einblicke in CTCF vermittelte Genom-Organisation in spezifischen Gen-Loci und auch die Grundlage für die funktionelle Charakterisierung der kommentierten genetische regulatorischen Elemente, beide Codierung und Forensisches, während normale biologische Prozesse in der Post-humanen Genom-Projekt-Ära.

Einleitung

Neuere Genom Interaktion Studien gezeigt, dass die menschliche Genom Formen topologisch verknüpfen Domänen (TADs) stabil, die in Zelle Arten und Arten konserviert sind. Die Organisation des Genoms in separaten Domänen erleichtert und schränkt die Wechselwirkungen zwischen regulatorische Elemente (z. B. Geschmacksverstärker und Promotoren). CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF) bindet an TAD Grenzen und spielt eine entscheidende Rolle in einschränkende Interaktionen von DNA-Elemente, die in benachbarten TADs1befinden. Genom breite CTCF binden von Daten ergaben jedoch, dass obwohl CTCF meist mit der gleichen DNA-Standorten in verschiedenen Zelltypen interagiert, es oft als Chromatin Barriere an einem bestimmten Standort in einer Zelle Art aber nicht in das andere dient, was darauf hindeutet, dass CTCF Funktionen zusammen mit den anderen Aktivitäten bei der Bildung von Chromatin Grenzen2. Unbekannt geblieben ist, ob der Randelemente (CTCF-Bindungsstellen) direkt auf die biologische Funktion von CTCF verknüpft sind, und wie diese Links auftreten. Daher vermuten wir, dass bestimmte CTCF Bindungsstellen im Genom direkt die Bildung von TADs regulieren und Promotor/Enhancer Interaktionen innerhalb dieser Domänen oder zwischen benachbarten Domänen zu kontrollieren. Die Vollendung von Mensch und Maus Genom-Sequenzierung Projekte und späteren epigenetischen Analysen haben neue molekulare und genetische Signaturen des Genoms aufgedeckt. Die Rolle der Signaturen/Anpassungen in der Genregulation und zelluläre Funktion sowie ihre molekulare Mechanismen müssen jedoch noch nicht vollständig verstanden werden.

Mehrere Linien des Beweises unterstützen, dass CTCF-vermittelten TADs funktionale Chromatin Domänen3,4,5darstellen. Obwohl CTCF meist mit der gleichen DNA-Standorten in verschiedenen Zelltypen interagiert, zufolge Genom breite CTCF ChIP-Seq-Daten CTCF fungiert oft als Chromatin Barriere in einer Zelle Art aber nicht in die anderen2. CTCF spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von Vermittlung Genom Organisation4,6,7. Störung der CTCF Grenzen beeinträchtigt Enhancer/Promotor Interaktionen und Genexpression, was zu Entwicklungsstörungen Blockade. Dies deutet darauf hin, dass CTCF TADs vermittelt nicht nur strukturelle Komponenten, sondern auch regulatorische Einheiten für richtige Enhancer Aktion und gen Transkription5,8,9erforderlich sind.

HOX -Gene spielen eine kritische Rolle während der Embryonalentwicklung und sie sind zeitlich und räumlich eingeschränkt ihre Expressionsmuster. HOXA -Locus bildet zwei stabile TADs Front- und Seitenzahnbereich Gene durch eine CTCF-assoziierten Randelement in Zellkulturen und IMR90 Zellen1zu trennen. Die jüngsten Berichte zeigten, dass HoxBlinc, ein HoxB Locus verbunden LncRNA, die Bildung von CTCF vermittelt TADs und Enhancer/Promotor Interaktionen in den HOXB Locus gerichtet. Dies führt zu anterioren HOXB Genaktivierung bei ESC Engagement und Differenzierung10. Darüber hinaus an bestimmte gen-Loci einschließlich der HOXA -Lokus, Änderung der CTCF TAD Domänen geändert Linie spezifisches Gen Expressionsprofile vermittelt und wurde im Zusammenhang mit der Entwicklung der Krankheit Staaten11,12. Der Beweis stützt eine primäre Funktion für CTCF Gentranskription koordinieren und Bestimmung der Zelle Identität durch die Organisation des Genoms in Funktionsbereiche.

Trotz seiner Rolle in der embryonalen Entwicklung, während der Hämatopoese regulieren HOX -Gene hämatopoetischen Stammzellen und Vorläuferzellen (HS/PC) Zellfunktion. Dies geschieht durch die Förderung des Gleichgewichts zwischen Proliferation und Differenzierung10,13,14,15. Der Ausdruck der HOX -Gene ist streng reguliert, während die Spezifikation und die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen mit höchsten Ausdruck in HS / Stk. HOX -gen-Expression sinkt allmählich während der Reifung, mit den niedrigsten Stand Auftritt unterschieden hämatopoetischen Zellen16. HOX -gen Dysregulation ist eine dominante Mechanismus der leukämischen Transformation durch Dysregulating Selbsterneuerung und Differenzierung Eigenschaften der HS/PCs zu leukämischen Transformation17,18. Der Mechanismus der Einführung und Aufrechterhaltung von Normal vs. onkogenen Expressionsmuster der HOX -Gene sowie damit verbundenen Regulationsnetzwerke bleibt jedoch unklar.

CRISPR-Cas9-SgRNA-Bibliothek-Screening wurde weithin verwendet, um Protein-kodierenden Gene19 als auch als nicht-kodierenden Gene, z. B. LncRNA20 und MiRNA21 in verschiedenen Arten zu verhören. Die Kosten die CRISPR-Cas9-SgRNA-Bibliothek verwenden, um neue genomische Ziele identifizieren bleibt jedoch hoch, da Hochdurchsatz-Genoms oft angewendet wird, um zu überprüfen, die SgRNA-Bibliothek-Screening. Unsere SgRNA screening-System konzentriert sich auf die spezifischen Genom-Loci und wertet das targeting SgRNAs durch One-Step RT-PCR nach der Marker-gen-Expression, z. B. HOXA9. Darüber hinaus kann Sanger-Sequenzierung bestätigt, dass die SgRNA in das Genom und Indel Mutationen integriert wurde erkannt werden, um die SgRNA Ausrichtung der Website zu identifizieren. Durch die Loci-spezifische CRISPR-Cas9 genetisches Screening, wurde die CBS7/9-Chromatin-Grenze als kritische Regulator für onkogenen Chromatin Domäne Aufbau und Pflege von ektopische HOX gen Expressionsmuster in AML Pathogenese identifiziert 12. die Methode kann weit angewendet werden, um nicht nur spezifische Funktion von CTCF Grenze in der Embryonalentwicklung, Blutbildung, Leukemogenesis, aber auch CTCF Grenze als mögliche therapeutische Ziele für künftige epigenetische Therapie zu identifizieren.

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Protokoll

(1) CTCF SgRNALibrary Design mit einem Online-Tool

  1. Entwerfen Sie die SgRNA targeting CTCF Bindungsstellen in den menschlichen HOX -Loci mit der genetischen Störung Plattform (GPP) Designer-Tool (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  2. Insgesamt 1.070 SgRNAs bestehend aus SgRNAs, die Ausrichtung auf 303 zufällige Gene targeting, 60 Positivkontrollen, 500 non-Human-targeting Kontrollen und 207 CTCF Elemente oder LncRNA gezielt Gene (Abbildung 1, Tabelle 1) zu synthetisieren. Jedes targeting DNA-Element richtet sich von 5 bis 10 verschiedene SgRNAs.

2. SgRNA Bibliothek Klonen

  1. Klonen Sie die synthetisierte Oligonukleotide in den CRISPR Lentivirale Rückgrat Vektor (lentiCRISPRv2).
    1. Den LentiCRISPRv2-Vektor mit BsmBI Restriktionsenzym bei 37 ° C für 2 h zu verdauen.
    2. Achten Sie auf das Vorhandensein von größeren Band (etwa 12.873 bp) auf das Gel nach BsmBI Verdauung, und reinigen Sie es mit dem Gel Extraction Kit.
      Hinweis: Eine 2 kb kleine Ausgleichsstück ist auch auf das Gel nach der Verdauung, aber dies sollte ignoriert werden.
    3. Verbinden die synthetisierte Oligonukleotide und verdaut LentiCRISPR Vektor mit 150 ng von LentiCRISPR DNA, 1 µL 10 µM Oligos, 2 µL 10 x T4 Ligase Puffer, 1 µL T4-Ligase, verdaut und sie dann über Nacht bei 16 ° C inkubieren.
  2. Elektro-kompetente Zellen zur Verstärkung verwandeln Sie die Lentivirale CRISPR/SgRNA Bibliothek.
    1. Vorbereiten der Electroporator bei 1,8 kV, 200 Ω und 25 µF. Dann die Erholung SOC Medien in einem 37 ° C Wasserbad Vorwärmen und LB Ampicillin Antibiotika Platten bei 37 ° c Vorwärmen
    2. Tauen Sie die kompetenten Zellen für 10 min auf Eis.
    3. Bereiten Sie 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren und 1 mm Elektroporation Küvetten auf Eis.
    4. Mischen Sie 1 µL einer 10 ng/µL Bibliothek Plasmid DNA in 25 µL kompetente Zellen in einem 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen und vorsichtig mischen durch Streichen der Boden des Röhrchens ein paar Mal manuell.
    5. Sobald die Küvette kalt genug ist, übertragen Sie die DNA/zuständige Zelle Mischung darauf. Tippen Sie zweimal auf die Arbeitsplatte und wischen Sie jeder Wassertropfen von der Außenseite der Küvette mit einem Papiertuch ab. Dann legen Sie die Küvette in die Elektroporation-Modul und drücken Sie Puls.
    6. Sofort fügen Sie 975 µL 37 ° C vorgewärmte SOC Medien hinzu. Mix von oben und unten pipettieren und Übertragung auf eine 15 mL-Tube.
    7. Drehen und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
    8. Verdünnen Sie 100 µL Zellen in 900 µL SOC-Medien zu und 100 µL auf ein LB Ampicillin Antibiotika Nährbodenplatte. Über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  3. Extrahieren Sie das Plasmid DNA aus den kombinierten Kolonien mit einer Maxi-Prep-Spalte als detaillierte im Protokoll des Herstellers.
    1. Kratzen die Kolonien von der LB-Agar-Platte und eine Starterkultur von 2 mL LB Ampicillin antibiotisches Medium zu impfen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit kräftig schütteln (~ 200 X g).
    2. Verdünnen Sie die Vorspeise Kultur 1: 500 in 100 mL LB Ampicillin-Medium und Inkubation bei 37 ° C für 12-16 Uhr mit kräftig schütteln (~ 200 X g).
    3. Ernte der Bakterienzelle Pellet durch Zentrifugation bei 6.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
    4. Wieder aussetzen der bakteriellen Pellets in 10 mL Suspension Puffer.
    5. Lyse der suspendierte Pellet mit 10 mL des Puffers lyse und kräftig invertieren 4-6 Mal. Inkubieren Sie die lysate für 5 min bei Raumtemperatur.
    6. Neutralisieren Sie die lysate mit 10 mL gekühlten Neutralisation Puffer. Durch die Rohre invertieren sanft 4-6 Mal mischen und 20 min auf Eis inkubieren.
    7. Spin-down bei 13.500 X g für 30 min bei 4 ° C. Zeitnah übertragen des Überstands mit dem Plasmid DNA zu einem neuen Schlauch.
    8. Wiederholen Sie Schritt 2.3.7 und übertragen Sie den Überstand mit dem Plasmid DNA zu einem neuen Schlauch sofort.
    9. Equilibrate der Spalte durch die Anwendung 10 mL Gleichgewichtherstellung Puffer und lassen Sie die Spalte leer durch Schwerkraft.
    10. Die Spalte überstand hinzu und lassen Sie ihn das Harz durch Schwerkraft eingeben.
    11. Waschen Sie die Spalte mit 2 x 30 mL Waschpuffer.
    12. Eluieren Sie die DNA mit 15 mL der Elution Buffer.
    13. Die DNA mit 10,5 mL Isopropanol Raumtemperatur an der eluierten DNA auszufällen. Mix und Spin sofort bei 15.000 X g für 30 min bei 4 ° C, und den Überstand vorsichtig abgießen.
    14. Das DNA-Pellet mit 5 mL 70 % Ethanol, Zentrifuge DNA-Pellet bei 15.000 X g für 10 min waschen und entsorgen des klare Überstands.
    15. Wiederholen Sie Schritt zwei weitere Male 2.5.14.
    16. Zentrifugieren Sie DNA-Pellet bei 15.000 X g für 10 min und dekantieren Sie sanft des Überstands ohne zu stören das DNA-Pellet.
    17. Das Pellet für 5-10 min an der Luft trocknen, und die DNA in eine gewünschte Lautstärke des Puffers (TE-Puffer, pH 8.0) auflösen.

(3) die hohe Titer SgRNA Bibliothek Lentivirus Generation

  1. Handy-Vorbereitung: Kultur-HEK293T Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % (Vol/Vol) fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % (Vol/Vol) Penicillin-Streptomycin (PS) Antibiotikum in t-25 Flaschen ergänzt. Legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
  2. Lentivirus Paket: Co transfect HEK293T Zellen mit 20 µg des gereinigten Bibliothek Vektoren aus Schritt 2, 15 µg des Plasmids Paket (psPAX2) und 10 µg des Plasmids Umschlag (pMD2.G) für 48 h vor der Ernte der Viren.
  3. Virus-Sammlung: nach 48 h, Collectthe Virus überstand und das Virus durch einen 0,45 µm eiweißarme Bindung PVDF Membran überstand zu filtern.
  4. Viruskonzentration: den Lentivirale überstand 50-fold mithilfe des Konzentrators zu konzentrieren und testen Sie das Virus MOI in Schritt 5.
  5. Virus-Lagerung: aliquoten konzentrierten Viren und Shop in einem-80 ° C Gefrierschrank.

(4) optimierte Puromycin Konzentration

  1. Leukämie-Zellkultur: Kultur MOLM13 AML Zellen RPMI 1640 mit 10 % (Vol/Vol) fetalen bovine Serum (FBS) und 1 x Antibiotika Penicillin-Streptomycin (PS) in einem T-125 Kolben ergänzt. Legen Sie sie in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
    Hinweis: Zellen werden in der Regel jeden 4-5-d ein Split-Verhältnis von 1:4 oder 1:6, niemals zu Zellen zu erreichen, dass mehr als 70 % Konfluenz übergeben.
  2. MOLM13 Zellen in einem 12-Well-Platte mit einer Dichte von 1,0 x 104 Zellen/mL, bei einem Gesamtvolumen von 2 mL pro Bohrloch (2,0 x 104 Zellen) eingerichtet.
  3. Zeitverlauf Assay: Behandlung von MOLM13 Zellen mit Puromycin für 7 Tage in steigenden Konzentrationen (0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL und 2,0 µg/mL)
    1. Richten Sie MOLM13 Zellen ohne Puromycin Behandlung am Tag 0 und 3 replizieren Brunnen ohne Puromycin Behandlung als Kontrolle von Tag 0, Tag 7 eingerichtet.
    2. Behandeln Sie MOLM13 Zellen mit 0,1 µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1,0 µg/mL und 2,0 µg/mL, mit jeder Versuchsbedingung mit 3 replizieren Brunnen separat.
    3. Zählen Sie live Cell Verhältnis zu und machen Sie eine überleben Kurve von Tag 0, Tag 7, enthält alle Bedingungen.
  4. Überleben-Kurve: beflecken Zellen mit Trypan blau und Graf Lebensfähigkeit täglich um das Überleben-Kurven für jede Puromycin Konzentration zu erhalten.
  5. Optimierung der minimalen Puromycin Konzentration: bestimmen die minimale Puromycin Konzentration durch Trypan blau Färbung, in welche alle MOLM13 Zellen werden zwischen 5-7 Tagen getötet.

5. die Titration der Lentivirale Bibliothek in MOLM13 Leukämie-Zellen

  1. AML Zellen Vorbereitung: sammeln MOLM13 AML Zellen mit dem Transduktion Medium (RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % PS und 8,0 µg/mL Auftragsmedium) bei einer Dichte von 1,5 x 106 Zellen /mL.
  2. Legen Sie MOLM13 Zellen in der 12-Well-Platte mit 1,5 x 106 Zellen in jede Vertiefung.
  3. Die Lentivirus Auftauen: Entfernen Sie die konzentrierte Lentivirus von-80 ° C Gefrierschrank und auf Eis auftauen.
  4. Mix MOLM13 Zellen mit eine andere Dosis von der konzentrierten Lentivirus in separaten Brunnen, einschließlich 0, 1, 2,5, 5, 7,5 und 10 µL (insgesamt 6 Gruppen).
  5. Sofort Zentrifugieren Sie diese Mischungen bei 1.000 X g 2 h bei 33 ° C und übertragen Sie 12-Well-Platten wieder in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 4 h zu.
  6. Nach 4 h spin-down der infizierten Zellen bei 400 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
  7. Sanft Aspirieren des Überstands ohne zu stören das Pellet Zelle wieder aussetzen der transduced Zellen mit frischen Medien (RPMI 1640, 10 % FBS und 1 % PS), und übertragen Sie sie auf t-25 Fläschchen und Inkubation bei 37 ° C für 48 h ohne Puromycin.
  8. Diese Zellen aufgeteilt nach 48 h, 2 Flaschen (2 Gruppen): eine experimentelle Gruppe für 5 Tage mit 1 µg/mL Puromycin behandelt und eine Kontrollgruppe ohne Puromycin Behandlung für 5 Tage.
  9. Puromycin Auswahl für 5 Tage mit 1 µg/mL Puromycin gemäß Schritt 4 durchführen Sie, bis alle nicht ausgestrahlt Kontrollzellen tot sind. Austausch für frische Medien alle 2 Tage.
  10. Messen Sie die optimierte MOI-Wert für die Transduktion dividiert die Anzahl der lebenden Zellen mit Puromycin mit der Anzahl der Zellen ohne Puromycin Behandlung behandelt.

(6) Transduktion der gepoolten CRISPR-Cas9 KO-Bibliothek

  1. Transduktion mit Lentivirus: 1,5 x 106 MOLM13 Zellen mit 0,3 MOI SgRNA gebündelt Lentivirus im Medium zu infizieren (RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % PS und 8 µg/mL Auftragsmedium) in 6-Well-Platte und die Zellen ohne die Lentivirus Infektion als ein Steuerelement verwenden.
  2. Sofort Zentrifugieren Sie 6-Well-Platte bei 1.000 X g 2 h bei 33 ° C, Spinfect der Zellen und übertragen Sie die Platten wieder in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 4 h zu.
  3. Spin-down der infizierten Zellen bei 400 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
  4. Sanft Aspirieren überstand ohne zu stören das Pellet Zelle wieder aussetzen der transduced Zellen mit frischen Medien (RPMI 1640, 10 % FBS und 1 % PS), und übertragen Sie sie auf t-25 Fläschchen und Inkubation bei 37 ° C für 48 h ohne Puromycin.
  5. Nach 48 h behandeln Sie Zellen mit 1 µg/mL Puromycin für 5 Tage. Nach 2 Tagen für frische Medien austauschen und eine optimale Zelldichte bleiben.
  6. Samen des einzigen Klons in 96-Well-Platten mit der Begrenzung der Verdünnung Methoden und inkubieren Sie diese einzelnen Klone bei 37 ° C und 5 % CO2. Kultur sie für 3-4 Wochen.
  7. Nach eine einzelne Zelle in einer Bevölkerung wächst, übertragen Sie die Hälfte der Zellen in 24-Well-Platten für weitere Kultur unter Puromycin Auswahl und überprüfen Sie diese Klone im nächsten Schritt. Halten Sie den Rest der Zellen.

(7) Screening der gepoolten CRISPR-Cas9 KO-Bibliothek mit One-Step RT-qPCR

  1. Bestimmen Sie die Wirksamkeit der SgRNA integrierte Klon Abschirmung durch Auswertung des Ausdrucks des Markergens HOXA9 mit einen Schritt Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR One-Step).
    Hinweis: HOXA9 hoch in MOLM13 AML Zellen in Leukemogenesis22,23ausgedrückt.
  2. Anzahl der SgRNA integrierten MOLM13 Zelle und Transfer 1 x 10-4 -Zellen pro Bohrloch zu einer 96-Well-PCR-Platte.
  3. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1.000 X g für 5 min und dann gründlich entfernen und entsorgen des Überstands mit einer Pipettieren ohne zu stören die Zelle Pellet.
  4. Zellen mit 125 µL PBS-Puffer waschen und das Rohr auf 1.000 X g für 5 min zentrifugieren. Dann entfernen Sie 120 µL des Überstands mit einer Pipette und behalten Sie ca. 5 µL PBS in jede Vertiefung zu.
  5. Fügen Sie in jede Vertiefung 50 µL der Zelle Lysis-master-Mix mit 48 µL der Zelle Lysis Puffer, 1 µL Proteinase K-Lösung (10 mg/mL) und 1 µL DNase-Lösung (1 mg/mL). Dann Pipettieren rauf und runter 5 Mal die Zelle Pellet wieder auszusetzen.
  6. Die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 5 min bei 37 ° C inkubieren und dann 75 ° C für 5 Minuten.
  7. Speichern Sie die Zelle lysate bei-80 ° C Gefrierschrank.
  8. Die Vorbereitung der OneStep RT-qPCR Reaktion: tauen die einstufige Reaktion Mischung und andere Reaktionskomponenten bis 4 ° C. Dann spin-down kurz zu Lösungen am Ende der Rohre zu sammeln, und auf Eis ohne Licht. Mischen und vorsichtig drehen.
  9. Die PCR-Brunnen mit dem RT-qPCR-Reaktion-Mix, einschließlich 1 µL das Markergen forward Primer 1 µL Zelle lysate hinzufügen (300 nM) und reverse Primer (300 nM), 0,125 µL Reverse Transkriptase (10 U/µL) und 5 µL einstufige Reaktion Mix (2 X).
  10. Brunnen mit optisch transparente Folie, und sanft Wirbel zu versiegeln und die Reaktionskomponenten mischen.
  11. Ein Real-Time PCR Instrument der 96-Well-PCR-Platte auflegen.
  12. Ausführen der reversen Transkription Reaktion für 10 min bei 50 ° C, gefolgt von Polymerase Inaktivierung und DNA Denaturierung für 1 min bei 95 ° C.
  13. RT-PCR mit 40 Zyklen der PCR-Reaktion führen: Denaturierung für 15 s bei 95 ° C, Glühen/Erweiterung und Platte Fluoreszenz Lektüre für 20 s bei 60 ° C, und dann Schmelze Kurvenanalyse bei 65-95 ° C über 0,5 ° C Schritten bei 2-5 s/Schritt.
  14. Hochreguliert, herunterreguliert und keine Änderungsgruppen nach Ausdruck Niveau des HOXA9 -Gens im Vergleich zu kontrollieren, separat aufgestellt. Verwenden Sie β-Aktin -gen als ein Zimmermädchen-gen-Steuerelement.

8. Überprüfung der integrierten SgRNAs Positive Klone durch Genotypisierung und Sanger Sequenz

  1. Überprüfen Sie die HOXA9 verringerte sich Ausdruck Klone durch Sanger-Sequenzierung und PCR mit 50-100 ng MOLM13 Genom DNA, 5 µL Polymerase Reaktion Puffer (10 X), 1 µL forward Primer (10 µM) durchzuführen (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) und 1 µL reverse Grundierung (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), 1 Einheit Polymerase (5 U /µL). Durchführung die PCR-Reaktion mit der anfänglichen Denaturierung bei 94 ° C für 30 s und dann weitere Denaturierung bei 94 ° C für 20 s, Glühen bei 56 ° C für 20 s, Erweiterung bei 68 ° C für 20 s (insgesamt 30 Zyklen), letzte Erweiterung bei 68 ° C für 10 min. , und dann bei 4 ° c halten
  2. Extrahieren und die PCR-Produkte (Größe 285 bp) mit einem PCR-Reinigung-Kit zu reinigen.
  3. Verbinden Sie die gereinigten PCR-Produkte in den T-Vektor mit 2 µL T4 Ligatur-Puffer (10 X), 50 ng T Vektor-DNA (50 ng/µL), 25 ng gereinigt PCR DNA (285 bp), 1 µL T4 Ligase (3 Einheiten/µL) und Ort der Ligatur mischen in einem Inkubator bei 16 ° C über Nacht.
  4. Die Ligatur-Mischung in DH5α zuständigen Zelle übertragen, wachsen auf einer LB Ampicillin antibiotische Agar-Platte und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
  5. Wählen Sie die einzelnen Klone von der LB-Platte und überprüfen sie durch Genotypisierung und Sanger Sequenzierung.

9. Nachweis von SgRNAs induzierte Indel Mutation von Nuklease Verdauung Assay

  1. Erkennen Sie, dass der SgRNA integrierten einzigen Klon Indel Preise durch eine Nuklease-Test-Assay induziert.
  2. Bereiten Sie separat PCR Amplifikate mit 50-100 ng Indel Mutant (Test) und Wildtyp (WT, Referenz) DNA als PCR-Vorlage, 5 µL Polymerase-Reaktion-Puffer (10 X), 1 µL dNTP (10mM), 1 Einheit Polymerase (5 U/µL), 1 µL forward Primer (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3 "), und 1 µ L reverse Primer (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3 "). Die PCR-Reaktion erfolgte mit anfänglichen Denaturierung bei 98 ° C für 30 s, und dann Denaturierung bei 98 ° C für 20 s, Glühen bei 56 ° C für 20 s, Erweiterung bei 72 ° C für 30 s (insgesamt 30 Zyklen) und letzte Erweiterung bei 72 ° C für 10 min. , und bei 4 ° c halten
  3. Richten Sie die Heteroduplex-Mischung-Gruppe mit 200 ng "Reference" (20 ng/µL) und 200 ng "Test" (20 ng/µL) PCR Amplifikate in 0,2 mL PCR-Tube und Homoduplex Mischung Gruppe mit nur 400 ng "Reference" PCR Amplifikate als Kontrolle.
  4. Inkubieren Sie separat die Heteroduplex-Homoduplex-Mischung bei 95 ° C für 5 min in einem 1 L Becher mit 800 mL Wasser gefüllt und dann abkühlen langsam auf Raumtemperatur zu tempern und Heteroduplex oder Homoduplexes bilden.
  5. Separat Digest 400 ng der geglühten Heteroduplex und Homoduplex Mischung mit 1 µL Indel Mutation Erkennung Nuklease (2,5 U/µL) und 2 µL Nuklease Reaktion Puffer (10 X) bei 42 ° C für 60 Minuten.
  6. Analysieren der verdauten Proben mit Agarose-Gelelektrophorese, Heteroduplex Mischung DNA sollte in kleine Fragmente (70-250 bp) und die Homoduplex DNA schneiden (320 bp) sollte nicht geschnitten werden.

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Ergebnisse

CRISPR-Cas9-Technologie ist eine leistungsfähige Recherche-Tool für funktionelle Genomforschung Studien. Es ist schnell ersetzt konventionelle gen Bearbeitung Techniken und hohem Nutzwert für genomweite und individuelle gen ausgerichtete Anwendungen hat. Hier enthält die erste individuell geklonte Loci-spezifische CRISPR-Cas9 angeordneten SgRNA Bibliothek 1.070 SgRNAs bestehend aus SgRNAs, die Ausrichtung auf 303 zufällige Gene targeting, 60 Positivkontrollen, 500 non-Human-targeting Kont...

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Diskussion

Protein-kodierenden gen bezogene SgRNA Bibliotheken in einem funktionalen Screeningsystem zur Identifizierung von Genen und Netzwerke zur Regelung bestimmter Zellfunktionen durch SgRNA Bereicherung24,25,26 angewendet wurden ,27,28. Mehrere nicht-kodierende Region bezogene SgRNA Bibliotheken zeigten sich auch in Gen-spezifischen funktionalen Bildschirme für di...

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Offenlegungen

Wir haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Danksagungen

Die Autoren danken auch Nicholas Cesari für das Manuskript zu bearbeiten. Die Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health (s.h., R01DK110108, R01CA204044).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Lipofectamine 3000 ReagenzThermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113802
Stbl3 ZellenLife Technologies 
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 Ligase  New England Biolabs  M0202S
QIAquick Gel-Extrakt-KitQIAGEN28706
QIAuick PCR-AufreinigungskitQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR®   Grünes One-Step KitBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco' s modifizierter Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Fötales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicillin/Streptomycin/L-GlutaminLife Technologies 
Lenti-X Konzentrator Clontech631232
Trypanblau-LösungThermo Fisher Scientific15250061
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