Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in zellulären Prozessen spielt und durch Deubiquitination eng koordiniert wird. Defekte in beiden Reaktionen liegen den menschlichen Pathologien zugrunde. Wir bieten Protokolle zur Durchführung von Ubiquitination und Deubiquitination Reaktion in vitro mit gereinigten Komponenten.
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Methodenartikel
In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ubiquitination ist eine post-translationale Modifikation, die eine wichtige Rolle in verschiedenen Signalwegen spielt und insbesondere an der Koordination von Chromatinfunktion und DNA-assoziierten Prozessen beteiligt ist. Diese Modifikation beinhaltet eine sequenzielle Wirkung mehrerer Enzyme, einschließlich E1-Ubiquitin-aktivierend, E2-Ubiquitin-konjugating und E3-Ubiquitin-Ligase und wird durch Deubiquitinasen (DUBs) umgekehrt. Ubiquitination induziert Abbau von Proteinen oder Veränderung der Proteinfunktion einschließlich Modulation der enzymatischen Aktivität, Protein-Protein-Interaktion und subzelluläre Lokalisierung. Ein entscheidender Schritt beim Nachweis der Proteinubiquitination oder Deubiquitination ist die Durchführung von In-vitro-Reaktionen mit gereinigten Komponenten. Effektive Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen könnten stark durch die verschiedenen verwendeten Komponenten, Enzym-Co-Faktoren, Pufferbedingungen und die Art des Substrats beeinflusst werden. Hier bieten wir Schritt-für-Schritt-Protokolle zur Durchführung von Ubiquitinations- und Deubiquitinationsreaktionen. Wir veranschaulichen diese Reaktionen mit minimalen Komponenten der Maus Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1 und RING1B, einer E3-Ubiquitinligase, die Denton H2A auf Lysin 119 monoubiquitiniert. Die Deubiquitination von nukleosomaler H2A erfolgt mit einem minimalen Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) Komplex, der durch die menschliche Deubiquitinase BAP1 und die DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) Domäne seines Co-Faktors ASXL2 gebildet wird. Diese Ubiquitination/Deubiquitination Assays können im Kontext entweder rekombinanter Nukleosomen durchgeführt werden, die mit bakteriellen gereinigten Proteinen oder einheimischen Nukleosomen, die aus Säugetierzellen gereinigt werden, rekonstituiert wurden. Wir weisen auf die Feinheiten hin, die einen erheblichen Einfluss auf diese Reaktionen haben können, und schlagen vor, dass die allgemeinen Prinzipien dieser Protokolle rasch an andere E3-Ubiquitinligasen und Deubiquitinasen angepasst werden können.
Einleitung
Ubiquitination ist eine der am besten erhaltenen post-translationalen Modifikationen und ist entscheidend für eine Vielzahl von Organismen, einschließlich Hefe, Pflanzen und Wirbeltiere. Ubiquitination besteht aus der kovalenten Anhaftung von Ubiquitin, einem hochkonservierten 76-Aminosäure-Polypeptid, an Zielproteinen und erfolgt in drei aufeinanderfolgenden Schritten mit drei Enzymen, d.h. E1-aktivierend, E2-konjugierend und E3-Ligase1, 2,3. Diese posttranslationale Modifikation spielt eine zentrale Rolle in einem breiten Spektrum biologischer Prozesse. Tatsächlich bilden ....
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Protokoll
1. GSH-Agarose Affinitätsreinigung des GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3 Ubiquitin Ligase Complex
- Verwenden Sie das PGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1 (1 -109aa) Bakterienexpressionkonstrukt, um BL21 (DE3) Bakterien zu transformieren (siehe Tabelle der Materialien)23. Dieses Konstrukt ermöglicht die Expression der murinen RING1B-Domäne 1-159, die mit der BMI1-Domäne 1-109 mit GST-Tag im pGEX-6P-2-Backbone verschmolzen wird.
- Führen Sie eine Nacht-Starterkultur durch Impfung von RIL-Bakterien, die GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1 -109 aa) in 20 ml LB-Brühenmedium in Gegenwart von 100 g/ml Ampicillin und 50 g....
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Ergebnisse
GST-BMI1- und RING1B-Proteine sind gut in Bakterien produziert und können leicht in der löslichen Fraktion extrahiert werden. Abbildung 1A zeigt eine Coomassie-Blaufärbung für eine typische Reinigung des GST-BMI1-RING1B-Komplexes. Die Bänder GST-BMI1 und RING1B wandern mit dem erwarteten Molekulargewicht von 45 kDa bzw. 13 kDa. Insbesondere der E3-Ligase-Komplex ist sehr homogen mit sehr niedrigen Konzentrationen von Bakterienproteinen Verunreinigungen und/od.......
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Diskussion
Es gibt mehrere Vorteile der Etablierung robuster In-vitro-Ubiquitination und Deubiquitination Assays für Proteine von Interesse. Diese Assays können verwendet werden, um: (i) optimale Bedingungen zu schaffen und minimale Anforderungen für diese Reaktionen zu definieren, (ii) enzymatische kinetische und biochemische Konstanten zu bestimmen, (iii) die Rolle von Kofaktoren oder Inhibitoren zu definieren, die diese Reaktionen beeinflussen können, (iv) Identifizierung von Wechselwirkungsschnittstellen, (v) Untersuchung der A.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Wir danken Diana Adjaoud für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) und Genome Canada (2016-2019) an E.B.A. E.B.A. unterstützt, der ein leitender Wissenschaftler des Fonds de la Recherche du Québec-Santé (FRQ-S) ist. L.M und N.S.K. haben ein Promotionsstipendium der FRQ-S. H.B. erhielt ein Promotionsstipendium des Ministeriums für Hochschulbildung und der wissenschaftlichen Forschung Tunesiens und der Cole Foundation.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Amylose Agarose-Kügelchen | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfilter 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-Agarose-Kügelchen | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-Protease-Cocktail | Sigma-Aldrich | ||
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL Bakterien | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Leere Chromatographiesäule | Biorad | #731-1550 | |
| Flaggenpeptid | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-Agarosekügelchen | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Mikrokokken-Nuklease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA Agarose-Kügelchen | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-Methylmaleimid (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Porenspritzenfilter 0,45 μ m | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimin (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) | Addgen | #63139 | |
| Ub aktivierendes Enzym (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
Referenzen
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
