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Methodenartikel

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

10.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/59414

⸱

24. April 2019

 , 
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Zusammenfassung

Aktuelle Methoden routinemäßig verwendet, um mRNA in Eizellen und Embryonen zu quantifizieren sind digitale Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (dPCR), quantitative, Real-Time RT-PCR (RT-qPCR) und RNA Sequenzierung. Wenn diese Techniken durchgeführt werden, mit einer einzigen Eizelle oder Embryo sind niedrig-Kopie mRNAs nicht zuverlässig erkannt. Um dieses Problem zu überwinden, können Eizellen oder Embryonen für die Analyse zusammengefasst werden; Allerdings führt dies oft zu hohe Variabilität unter den Proben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) mit verzweigten DNA-Chemie. Diese Technik identifiziert das räumliche Muster der mRNAs in einzelnen Zellen. Wenn die Technik mit dem Ort zu finden und Tracking-Computer-Software gekoppelt ist, kann die Fülle der mRNAs in der Zelle auch quantifiziert werden. Mit dieser Technik gibt es geringere Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe und weniger Eizellen und Embryonen sind erforderlich, um signifikante Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen erkennen. Handelsübliche verzweigte DNA SM-Fisch-Kits zur Erkennung von mRNAs in geschnittenen Gewebe oder adhärente Zellen auf Folien optimiert worden. Jedoch Eizellen haften nicht effektiv auf Folien und einige Reagenzien im Kit waren zu hart, was zu Eizelle Lyse. Um diese Zerstörung zu verhindern, wurden einige Modifikationen an das Fisch-Kit vorgenommen. Insbesondere ersetzt Eizelle Permeabilisierung und waschen Puffer für die Immunfluoreszenz von Eizellen und Embryonen entwickelt die proprietäre Puffer. Die Permeabilisierung, Waschungen und Inkubationen mit Sonden und Verstärker wurden in 6-Well Platten durchgeführt und Eizellen wurden auf Folien am Ende des Protokolls mit Montage Media platziert. Diese Änderungen konnten die Einschränkungen des kommerziell erhältlichen Kit, insbesondere die Eizelle Lyse zu überwinden. Um präzise und reproduzierbar mRNAs in einzelnen Eizellen zählen, wurde Computer-Software verwendet. Dieses Protokoll ist zusammen, eine Alternative zur PCR und Sequenzierung den Ausdruck der spezifischen Transkripte in Einzelzellen zu vergleichen.

Einleitung

Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde der Goldstandard für die mRNA Quantifizierung. Derzeit werden zwei Assays, digitale PCR (dPCR)1 und quantitative, real Time PCR (qPCR)2 verwendet. Die zwei PCR-Techniken hat dPCR höhere Empfindlichkeit als qPCR darauf hindeutet, dass es verwendet werden, könnte um mRNA Fülle in einzelnen Zellen zu messen. Aber in unseren Händen produziert dPCR Analyse der niedrigen Fülle mRNAs in Pools von 5 bis 10 Eizellen pro jede experimentelle Probe Daten mit geringen Reproduzierbarkeit und hohe Variation3. Dies ist wahrscheinlich auf die experimentellen Fehler in Verbindung mit RNA-Extraktion und reversen Transkription Effizienz. RNA-Sequenzierung wurde auch mit einem einzigen Mausklick und menschliche Eizellen4,5durchgeführt. Diese Technik erfordert cDNA Verstärkung für die Bibliothek-Generation, die wahrscheinlich erhöht die Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erforderlichen Schritte. Darüber hinaus können niedrige Fülle Protokolle nicht nachweisbar sein. Obwohl Sequenzierung Preise ab den letzten Jahren gestiegen sind, kann es noch unerschwinglich wegen der hohen Kosten der Bioinformatik Analysen sein. Zu guter Letzt ist mRNA Lokalisierung ein dynamischer Prozess mit räumlichen Veränderungen zur Protein-Funktion6. Daher setzen wir um eine Technik zu verabschieden, die genaue und reproduzierbare quantitative Maßnahmen und Lokalisierung der einzelnen mRNAs in einzelne Eizellen produzieren würde.

Verzweigte DNA gekoppelt mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung verstärkt Fluoreszenzsignal eher als verstärkendes RNA/DNA ermöglicht Nachweis von einzelnen mRNAs in einzelnen Zellen 7,8,9. Der Test erfolgt durch eine Reihe von Hybridisierung, Amplifikation (mit verzweigten DNA) und Fluoreszenz Kennzeichnung Schritte um die Fluoreszenz-Signal7verstärken. Das Verfahren beginnt mit der Bindung von 18 - 25 Base Oligonukleotid-Sonde-Paare, die einen spezifischen mRNA3,8,10ergänzen. Fünfzehn bis zwanzig Sonde Paare eignen sich für jedes Protokoll Gewährleistung Spezifität für das Ziel-Transkript. Die mRNA-spezifische Hybridisierung folgt Vorverstärker und Endstufe Sonden, die eine verzweigte Konfiguration bilden. Ungefähr binden 400 Label Fluorophore an jeden Verstärker, was zu einem 8000-fold Anstieg in Fluoreszenz ermöglicht die Erkennung von einzelnen mRNAs (Abbildung 1)11.

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Abbildung 1: Schematische des SM-Fisch Protokolls. Sequenzieller Hybridisierung von Transkript Sonde, verzweigte DNA-Verstärker und Fluorophor, ein Ziel-mRNA gezeigt wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Frühere Studien mit Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SM-Fisch) lokalisiert β-Aktin mRNAs in einzelnen Neuronen12 und humanes Papillomavirus DNA bei Gebärmutterhalskrebs Zell-Linien7. Die Computersoftware, die Stelle zu finden und Tracking-Programm identifiziert einzelne punktförmige Fluoreszenzsignal und wurde erfolgreich verwendet, um die Anzahl der in jeder Zelle3,13mRNAs zu quantifizieren.

Basierend auf den Ergebnissen der mRNA-Erkennung in Neuronen12vermutet wir, dass SM-Fisch ein nützliches Instrument zur Abschrift Ebenen in murinen Eizellen und Embryonen einschließlich niedrige Fülle mRNAs quantitate beweisen würde. Aber die Technik ist optimiert für die Verwendung mit festen adhärente Zellen und Formaldehyd fixiert Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten (FFPE). Eizellen können nicht zu einer Folie haften, auch wenn sie mit Poly-L-Lysin beschichtet sind. Darüber hinaus sind sie empfindlicher als Körperzellen und Gewebeschnitte was in Zelle Lysis, wenn einige der proprietären Puffer in kommerziell erhältlichen Kits3ausgesetzt. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurden Eizellen behoben und manuell zwischen Tropfen der Puffer übertragen. Darüber hinaus wurden Permeabilisierung und waschen Puffer in den Kits ersetzt, um die lyse der Zellen zu verringern. Vordefinierte Sonden sind neben dem Fisch-Kit gekauft oder bestimmte Protokolle angefordert werden können. Jedes proprietäre Sonde-Set ist erhältlich in einer der drei Fluoreszenz-Kanäle (C1, C2 und C3) multiplexing zu ermöglichen. Im aktuellen Experiment wurden murine Eizellen Dual-gebeizt und quantifizierte mit einer Sonde C2 Nanog und C3 Pou5f1 Sonde. Diese Sonden wurden anhand der gemeldeten Ausdruck von Nanog und Pou5f1 in Eizellen und Embryonen ausgewählt. Zum Abschluss der Hybridisierung Schritte wurden Eizellen in Tropfen von Anti-Fade Montage Medien für die Anwendung auf histologischen gelegt. Konfokale Bilder wurden verwendet, um die Anzahl der punctata fluoreszierende Signale zu quantifizieren, die einzelnen mRNAs darstellen. Neben der Quantifizierung der mRNAs Bildgebung zeigte auch die räumliche Verteilung der spezifischen mRNA in der Zelle sind die RNA-Quantifizierungsmethoden nicht in der Lage, zu erreichen. Dieses Verfahren erwies sich geringe Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe erlaubt die Verwendung einer kleineren Anzahl von Eizellen in jeder experimentellen Gruppe signifikante Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen3identifizieren.

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Protokoll

Tierische Verfahren wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of Nebraska-Lincoln genehmigt und alle Methoden wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Für diese Studie CD-1 fremd-Mäuse hatten ad libitum Zugang zu normalen Nagetier Chow und Wasser; Sie waren in einem 12:12 dunkle gepflegt: Licht-Zyklus.

1. Vorbereitung der erforderlichen Medien

  1. Fügen Sie für base Medien (OMM) 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4und 1,7 mM CaCl2-2 H2O 100 mL sterilem Wasser hinzu.
    Hinweis: OMM Medium kann bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.
  2. Fügen Sie für komplette Media (OMOPS) 20 mM 3-Morpholinopropane-1-Sulfo Säure (MOPS), 1,2 mM MgSO4-7 H2O, 0,5 mM Glukose, 6 mM L-Lactat, 1 mM Ala-Gln, Taurin, 0,1 mM 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Ethylenediaminetetraacetic Säure () 0,01 mM EDTA), 10 µM-alpha-Liponsäure, 10 µg/mL unverdünnt Gentamicin, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM Nahco33, 0,2 mM Pyruvat, 0,5 mM Citrat, 4 mg/mL FAF BSA zu einem 01:10 Verdünnung der OMM in sterilem Wasser für ein Gesamtvolumen von 100 mL. Sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 µM-Filter.
    Hinweis: OMOPS können bis zu 1 Woche aufbewahrt werden.
  3. Fügen Sie für das Betriebs-Medium (HM) 5 % fötalen Rinderserum zu OMOPS hinzu. 2 mL HM per Mausklick zu machen.
  4. Fügen Sie für Hyaluronidase Lösung 0,1 mg/mL von Hyaluronidase bovine Hoden zu 1 mL HM abgeleitet.
  5. Kombinieren Sie für die Fixierung Puffer 4 % Paraformaldehyd in 10 mL 1 X PBS zusammen mit 0,1 % Embryo Grade Polyvinylpyrrolidon (PVP)14.
  6. Um 50 mL Waschpuffer (WB) vorzubereiten, Hinzufügen von 0,1 % nicht-ionische Tenside und 0,1 % PVP bis 1 x PBS-14.
  7. Vorbereitung 10 mL Permeabilisierung Puffer fügen Sie 1 % nicht - ionische Tenside hinzu, 1 X PBS14.
    Hinweis: Die oben beschriebenen Wasch- und Permeabilisierung Puffer ersetzen die proprietäre Puffer in den handelsüblichen Kits.

2. Sammlung von Eisprung Eizellen von weiblichen Mäusen

  1. Zubereitung:
    1. Weibliche Mäuse im Alter von 5-8 Wochen zu fördern, indem intraperitoneal (IP) Injektion von 5 IU equine Chorion-Gonadotropin (EKG) gefolgt von 5 IU humanes Choriongonadotropin (hCG) 44-48 h später15,16.
    2. 35 mm Petrischalen mit 2 mL HM auf einer Warmhalteplatte 37 ° C zu halten. Eine Pipette, 100 µL Tropfen HM mit verdünnt Hyaluronidase, gefolgt von drei 50 µL Tropfen HM ohne Hyaluronidase in einer Petrischale 60 mm. Legen Sie Platten mit Tropfen auf 37 ° C Erwärmung vor Gebrauch Platte.
      Hinweis: Die Hyaluronidase-Tropfen sollte kurz vor der Dissektion jedes Eileiters Paares vorgenommen werden, um die Verdampfung und die Konzentration der Komponenten des HM mit oder ohne Hyaluronidase zu verhindern.
  2. Mäuse, 16 h nach der IP-Injektion von hCG einschläfern, mit Isofluran Überdosierung gefolgt von zervikale Dislokation.
  3. Reinigen Sie die Maus mit 70 % Ethanol. Setzen Sie die Bauchhöhle und visualisieren Sie der weiblichen Fortpflanzungsorgane. Halten Sie den Eierstock mit Zange und entfernen Sie die uterine Ligamente und überschüssiges Fettgewebe aus rund um die Eierstöcke zu. Schneiden Sie der Eileiter von der Gebärmutter und Eierstock Eileiter-paar in der warmen HM in der 35-mm-Schale.
  4. Entfernen Sie den Eierstock und alle umliegenden Fettgewebe. Reißen der geschwollenen Ampulle des Eileiters mit einem ½ Zoll-27-Gauge-Nadel. Drücken der Eileiter an der Stelle des Risses und der Cumulus-Zelle-Eizelle-komplexe (CoC) ausgewiesen werden. Übertragen der ovulated Eizellen, die in der Metaphase II (MII) der Meiose, bis zum 100 μL Tropfen mit HM-Medien mit Hyaluronidase mit einer Mund-Pipette (Abbildung 2) werden.

figure-protocol-1
Abbildung 2 : Teile von der Mund-Pipette verwendet, um Eizellen zu übertragen. (A) Mund Stück (B) 0,22 äh, 4 mm (C) Sauger Schlauch (D) 1000 μL Pipettieren Filterspitze (E) 9" Pasteur pipettieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Pipette die MII Eizelle-Cumulus Zelle komplexe rauf und runter in die Hyaluronidase, HM mit der Mund-Pipette, Kumuluszellen zu verdrängen. Jede Eizelle übertragen, sobald sie frei von Kumuluszellen zu waschen sind fallen mit HM nur mit dem Mund-Pipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Wäsche-Tröpfchen. Übertragen Sie fragmentierte oder transparente Eizellen15nicht.
    Hinweis: Es ist wichtig, die Eizellen aus jedem Tropfen in der 35-mm-Schale mit als wenig HM wie möglich zu übertragen. Dies gilt auch für jede Übertragung in das Protokoll. Die MII Eizellen dürfen nicht in die Hyaluronidase mit HM-Medium für mehr als eine Minute bleiben.

3. SM-Fisch Färbung der Eizellen

  1. Eizellen in einem einzelnen Brunnen einer 6-Well-Platte mit 500 µL Puffer Fixierung zu beheben. Tauchen 20 Eizellen oder weniger in den Brunnen. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: Jeder SM-Fisch Färbung Schritt tritt innerhalb einer einzelnen Brunnen in einer konischen 6-Well Platte. Sicherstellen Sie, dass Eizellen vollständig untergetaucht im Puffer und nicht schwebend über den Puffer. Jeder Schritt sollte mit 20 Eizellen oder weniger in jedem gut sein.
  2. Übertragen Sie feste Eizellen auf 500 μl Waschpuffer (WB im Schritt 1.6 beschrieben) für 10 Minuten. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
  3. Inkubieren Sie Eizellen in Permeabilisierung Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Die Permeabilisierung Puffer im Schritt 1.7 beschrieben ersetzt den Anstand Permeabilisierung Puffer.
    1. Sammeln Sie Sonde-Sets zu und drehen Sie schnell nach unten, in einem Microcentrifuge. Jede Sonde set für 10 min in einer 40 ° C Wasserbad oder Inkubator zu wärmen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
      Hinweis: Dieser Schritt sollte während der Inkubation Permeabilisierung durchgeführt werden
  4. Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
  5. Übertragen Sie Eizellen auf 80 μl Protease III Puffer (aus dem Kit verfügbar), verdünnt 1:8 in 1 X PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Die 80 µL Volumen deckt ausreichend unten von einem einzelnen Brunnen in einem 6-Well-Platte.
  6. Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
  7. Verdünnen Sie die erwärmten Sonde-Sets für Nanog, Pou5f1, und DapB (eine Negativkontrolle gen), 01:50 in Sonde Verdünnungsmittel. Inkubieren Sie Eizellen in 80 μL der Protokoll-spezifischen Sonde für 2 Stunden bei 40° c
    Hinweis: Jeder proprietäre Sonde Satz steht in einem der drei Fluoreszenz-Kanäle (C1, C2 und C3). Nanog und Pou5f1 Sonden wurden mit C2 und C3, bzw. markiert.
  8. Erwärmen Sie das proprietäre, 1 Verstärker (AMP 1), Verstärker 2 (AMP2) Verstärker 3 (AMP3) und Verstärker 4-Fluoreszenz (AMP 4-FL) bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Dieser Schritt sollte während der 2-stündigen Transkript-spezifische Sonde Inkubation durchgeführt werden.
  9. Übertragen Sie die Eizellen auf 500 μL der WB und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Inkubieren Sie Eizellen sequenziell in Verstärkung Puffern.
    1. Inkubieren Sie Eizellen in 80 µL AMP1 für 30 min bei 40° c Übertragung Eizellen zu 500 µL von WB für 10 min bei Raumtemperatur.
    2. Inkubieren Sie Eizellen in 80 µL AMP2 für 15 min bei 40 ° c Übertragen Sie Eizellen auf 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
    3. Inkubieren Sie die Eizellen in 80 µL AMP3 für 30 min bei 40 ° c Übertragen Sie Eizellen auf 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Der Rest des Protokolls wird im Dunkeln durchgeführt, weil AMP-FL der Fluorophor enthält. Beim Arbeiten unter dem sezierenden Mikroskop, reduzieren Sie das Licht so weit wie möglich.
    4. Fügen Sie Eizellen zu 80 μL der AMP4-FL für 15 min bei 40° C.
      Hinweis: AMP4-FL erfolgt als alternative Puffer-A (Alt-A), Alt-B oder Alt-C. Wählen Sie die AMP4-FL Puffer angewiesen auf die, den Emission Wellenlänge gewünscht wird.
  11. Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 10 min bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Eizellen in 80 µL DAPI für 20 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Eizellen in 500 µL WB für 5 min bei Raumtemperatur.
  12. Pipette 12 µL Anti-Fading-Montage-Medien auf die Mitte einer Folie ohne Luftblasen das Reagenz hinzuzufügen. Eizellen mit als wenig WB wie möglich in den Montage-Medien übertragen und einem Deckgläschen gelten.
    1. Kippen Sie das Deckgläschen schräg und platzieren Sie langsam und sanft über der Flüssigkeit auf der Folie. Vermeiden Sie drücken das Deckglas zu hart, um die Eizellen und die Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
    2. Speichern Sie die Folien in einer dunklen Box über Nacht trocknen bei Raumtemperatur. Bestreichen Sie die Ränder der Folien in klaren Nagellack, Deckglas zu versiegeln.
  13. Verwenden Sie ein standard Mikroskop Eizellen auf die Folie und Kreis mit einem permanent-Marker zu finden.
    Hinweis: Dieser Schritt ist nicht erforderlich, aber verbessert die Ortung Eizellen auf der Folie. Für beste Ergebnisse Bildfolien innerhalb von 1-5 Tagen als das Fluoreszenzsignal beginnt zu verblassen.

(4) Bildverarbeitung

  1. Bild der 3-dimensionalen Eizellen, mit Z Schritt konfokalen Mikroskopie.
    Hinweis: Um die Bilder genau zu analysieren, sollte jeder Schritt Z 1,0 µm/Stück.
  2. Als eine komprimierte Sd2 oder individuelle speichern Sie konfokale Bilder. TIFF-Dateien für jede Eizelle. Beide Bildtypen sind kompatibel mit dem open-Source-Bildbearbeitungsprogramm, Fidschi.
  3. Downloaden Sie und installieren Sie die open-Access-Fidschi-Software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    1. Sd2-Dateien in Fidschi und wählen Sie Hyperstack. Wenn konfokale Bilder gespeichert wurden. TIFF-Dateien überspringen Sie Schritt 4.4.
      Hinweis: Absinken die Sd2-Datei in Fidschi sollte der Hyperstack Dropdown-Liste automatisch angezeigt.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte " Bild ", wählen Sie Farbe, und klicken Sie auf Kanäle teilen , um die fluoreszierenden Kanäle der Sd2 Datei zu trennen.
    3. Generieren Sie individuelle. TIFF-Dateien für jede Z-Scheibe von der Eizelle in jedem fluoreszierende Kanal. Klicken Sie auf die Registerkarte " Bild ", wählen Sie Stapel aus, und klicken Sie auf Stapel zu Bildern. Klicken Sie auf die Registerkarte " Bild ", wählen Sie Typ, und klicken Sie auf RGB-Farbe um jede Z-Scheibe in eine einzelne RGB-Farbbild zu konvertieren.
      Hinweis: Die RGB-Farbe ist künstlich und kann werden gewählt für jedes Emissionswellenlänge.
    4. Speichern Sie jede konvertierte Bild als. TIFF-Datei. Platzieren Sie Bilder aus einer einzigen Eizelle für jeden fluoreszierende Kanal in einem neuen Ordner um Verwechslungen beim Nähen (Schritt 4.3).
  4. Jeweils zu normalisieren. TIFF-Bild für Pou5f1 und Nanog Negativkontrolle Bilder (DapB) verwenden.
    Hinweis: Normalisierung erfolgt über ein Bildbearbeitungsprogramm. Stellen Sie sicher, das gleiche Maß an Hintergrundfluoreszenz aus jedem Steuerelement Bild zu entfernen.
  5. Geöffnet jeweils normalisiert. TIFF-Datei in Fidschi an alle Z-Scheiben für jede Eizelle in jeder Wellenlänge zusammen zu nähen.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte " Plugins ", wählen Sie Naht, und klicken Sie auf Raster/Sammlung (Abb. 3A). Wählen Sie Aufeinander folgenden Bildern aus der Drop-Down-Menü und Klicken Sie auf "OK" (Abb. 3 b).
    2. Durchsuchen Sie das Verzeichnis und wählen Sie den Ordner mit allen Z-Schnittbilder für eine einzelne Eizelle bei einer Wellenlänge (siehe Schritt 4.3.4). Klicken Sie auf "OK".
    3. Bewegen Sie den Schieberegler am unteren Rand das gestickte Bild auf die entsprechende Farbe-Kanal für die verwendete Wellenlänge und erstellen Sie das Ergebnisbild RGB genähte durch Klick auf Bild, Auswahl- Typ, und klicken Sie auf RGB-Farbe.
      Hinweis: Dieses Bild wird für Fluoreszenz-Quantifizierung in Schritt 4.6 unten beschrieben verwendet werden.
  6. 32-Bit max. projizierte Bild umwandeln Sie das gestickte Bild. Klicken Sie auf Bild, wählen Sie Typ, und klicken Sie auf 32-Bit (Abbildung 3). Speichern Sie dieses Bild als eine neue. TIFF-Datei.

figure-protocol-2
Abbildung 3 : Zusammenfügen der konfokalen Z-Serie Bilder von Eizellen. (A) Screenshot zeigt das Plug-in-Grid/Datenerfassungs-Tool in Fidschi, die verwendet wurde, um zusammengesetzte Bilder der Eizelle zu produzieren. (B) aufeinander folgenden Bildern verwendet Fluoreszenz Überschneidungen zwischen sequentiellen. TIFF-Dateien um ein zusammengesetztes Bild zu erzeugen. (C) das zusammengesetzte Bild wurde als eine 32-Bit gespeichert. TIFF-Datei. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. Downloaden Sie und installieren Sie die Stelle finden und Tracking-Programm13, die von der Website für d.r. Larson, ein Ermittler an den nationalen Instituten der Gesundheit National Cancer Institute (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson) zur Verfügung steht. Downloaden Sie und installieren Sie die open-Access-Virtual-Machine für die interaktive Daten Sprache (IDL) Betriebssystem, das erforderlich ist, um die Stelle zu finden und Tracking Program (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf) laufen.
  2. Öffnen Sie das 32-Bit, genähte Bild, das in Schritt 4.6 (Abb. 4A), die Stelle zu finden und Tracking-Programm generiert wurde. Wählen Sie der Localize Dropdown-Liste aus , und klicken Sie auf Localize (Abbildung 4 b), die die Anzahl Plätze gefunden im Bild berechnet.
    Hinweis: Jeder Punkt gezählt repräsentiert einen einzelnen mRNA. Band-Pass und Photon-Schwelle-Einstellungen entnehmen Sie bitte dem Screenshot (Abbildung 4 b). Dieses Protokoll wurde standardmäßig für jede Schwellenwerteinstellung verwendet. Vertreter positive und Hintergrund-Spots werden (Abbildung 4) angezeigt.

figure-protocol-3
Abbildung 4 : Quantifizierung der mRNAs mit Spot Finder und Tracking. (A) einzelnen Z-Serie Bilder waren zusammengenäht, wie in Abbildung 3 beschrieben und als 32-Bit max. projiziert gespeichert. TIFF-Datei. (B) zusammengesetztes Bild wurde im Spot Finder und Tracking eröffnet. Lokalisiert wurde verwendet, um die fluoreszierenden Flecken (rote Markierung) zählen. Band-Pass und Photon Schwelle werden durch das blaue Kästchen gekennzeichnet. (C) der blaue Pfeil zeigt auf ein positives Signal (Schwellenwert). Der weiße Pfeil zeigt einen fluoreszierenden Punkt unterhalb des Schwellenwerts und daher nicht gezählt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Ergebnisse

Nach dem Abschluss des Protokolls, das Ergebnis wird Einzelbilder aus der konfokalen Z-Serie (Abbildung 4A und Abbildung 5), Zusammengeheftete Bilder (Abbildung 4), und mRNA zählt (Abbildung 4 b). Beim Multiplexen durchgeführt wird, wird auch sein zusammengeführten Bilder zeigen die Bezeichnung für zwei verschiedene mRNA...

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Diskussion

Eine Reihe von kleinen Schritten während des Protokolls gewährleisten die erfolgreiche Fluoreszenz und genaue Grafen von mRNAs. Erstens muss das Protokoll unmittelbar nach Sammlung und Fixierung der Eizellen erfolgen. Beachten Sie, dass die 4 % Paraformaldehyd Fixierung Puffer zu verhindern, dass Eizellen aneinander kleben PVP hinzugefügt wird. Wir fanden, dass es unmittelbar nach der Sammlung und Fixierung der die Eizellen das Experiment durchführen muss. Jede Verzögerung führt zu einer viel niedrigeren Fluoreszenzsigna...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verzollen

Danksagungen

Wir danken Dr. Daniel R. Larson für seine großzügige Unterstützung bei der Installation und Verwendung von Spot zu finden und Tracking-Programm 13 und die technische Unterstützung von der University of Nebraska Lincoln Mikroskopie Kern für die konfokale Mikroskopie-Bildgebung. Diese Studie ist ein Beitrag von der University of Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska und wurde unterstützt von UNL Luke Mittel (NEB-26-206/Accession Number-232435 und NEB-26-231/Zbl-Nummer-1013511).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(±)-α-LiponsäureSigma-AldrichT1395Alpha-Liponsäure
Albumin, Rinderserum, niedrige FettsäureMP Biomedicals, LLC199899FAF BSA
BD 10mL TB SpritzeBecton, Dickinson and Company30965910 mL Spritze
BD PrecisionGlide NadelBecton, Dickinson and Company30510927 1/2 Gauge
Nadel Calciumchlorid-DihydratSigma-AldrichC7902CaCl2-2H2O
ZitronensäureSigma-AldrichC2404Citrat
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichG6152
Na2HPO4
Easy Grip PetrischaleFalcon Corning35100835 mm
Schale Edetat DinatriumAvantor8994-01EDTA
Extra Fine Bonn SchereFine Science Tools14084-08Gerade, Scharf/Scharf, nicht gezahnt, 13mm Schneideschere
Fötales RinderserumAtlanta BiologicalsS10250FBS
Gentamicin Reagenz Lösunggibco15710-064Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)gibco35050-061Glutamax
Gold Seal Micro ObjektträgerGold Seal303925 x 75mm Objektträger
Gonadotropin, aus dem Serum trächtiger StutenSigmaG4877eCG
hCG rekombinantNHPPAFP8456AhCG
Hyaluronidase, Typ IV-S: aus RinderhodenSigma-AldrichH3884Hyaluronidase
Jewelers Style PinzetteIntegra17-305XPinzette 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Milchsäure, freie Säure MP Biomedicals, LLC190228L-Lactat
Magnesiumsulfat HeptahydratSigma-AldrichM2773MgSO4-7H2O
MEM Nichtessentielle AminosäurenCorning 25-025-ClNEAA
Mikroskop DeckglasFisher Scientific12-542-C25 x 25x 0,15 mm Deckgläser
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope SondeAdvanced Cell Diagnostics501891-C2Nanog Sonde
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope SondeAdvanced Cell Diagnostics501611-C3Pou5f1 Sonde
MOPSSigma-AldrichM3183
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Paraformaldehyd
PES 0,22 μm Membran -sterilMillex-GPSLGP033RS0,22 μm Filter
PolyvinylpyrrolidonSigma-AldrichP0930PVP
KaliumchloridSigma-Aldrich60128KCl
Kaliumphosphat monobasischSigma-Aldrich60218KH2PO4
Prolong Gold Antifade-ReagenzInvitrogenP36934Antifade-Reagenz ohne DAPI
RNAscope DAPIAdvanced Cell Diagnostics320858DAPI
RNAscope FL AMP 1Advanced Cell Diagnostics320852Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2Advanced Cell Diagnostics320853Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3Advanced Cell Diagnostics320854Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT AAdvanced Cell Diagnostics320855Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT BAdvanced Cell Diagnostics320856Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT CAdvanced Cell Diagnostics320857Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Detektionsreagenzien-KitErweiterte ZelldiagnostikFISH-Reagenzkit
RNAscope-Sonde 3-Plex-NegativkontrollsondeErweiterte Zelldiagnostik320871Negativkontrolle
RNAscope-Sonde 3-Plex-PositivkontrolleErweiterte Zelldiagnostik320881
VerdünnungsmittelErweiterte Zelldiagnostik300041Sonde Diluent
RNAscope Protease IIIAdvanced Cell Diagnositics322337Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagenzien-KitAdvanced Cell Diagnostics322340FISH Protease-Kit
RNAscope Protease IVAdvanced Cell Diagnostics322336Protease
IV S/S Nadel mit Luer Hub 30GComponent Supply Co.NE-301PL-50stumpfe 30-Gauge-Nadel
NatriumbikarbonatSigma-AldrichS6297NaHCO3
NatriumchloridSigma-AldrichS6191NaCl
NatriumhydroxidSigma-Aldrich306576NaOH
Natriumpyruvat, >= 99% Sigma-AldrichP5280Pyruvatlösung
6 Well DishAgtechincD186-Well-Schale
TaurinSigma-AldrichT8691Taurin
GewebekulturschaleFalcon Corning35300260 mm Schale
Triton X-100Sigma-AldrichX100Triton X-100
Glukose-Dinatriumphosphat 320851 Positivkontroll-RNAscope-Sonde

Referenzen

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
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