Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aktuelle Methoden routinemäßig verwendet, um mRNA in Eizellen und Embryonen zu quantifizieren sind digitale Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (dPCR), quantitative, Real-Time RT-PCR (RT-qPCR) und RNA Sequenzierung. Wenn diese Techniken durchgeführt werden, mit einer einzigen Eizelle oder Embryo sind niedrig-Kopie mRNAs nicht zuverlässig erkannt. Um dieses Problem zu überwinden, können Eizellen oder Embryonen für die Analyse zusammengefasst werden; Allerdings führt dies oft zu hohe Variabilität unter den Proben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) mit verzweigten DNA-Chemie. Diese Technik identifiziert das räumliche Muster der mRNAs in einzelnen Zellen. Wenn die Technik mit dem Ort zu finden und Tracking-Computer-Software gekoppelt ist, kann die Fülle der mRNAs in der Zelle auch quantifiziert werden. Mit dieser Technik gibt es geringere Variabilität innerhalb einer experimentellen Gruppe und weniger Eizellen und Embryonen sind erforderlich, um signifikante Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen erkennen. Handelsübliche verzweigte DNA SM-Fisch-Kits zur Erkennung von mRNAs in geschnittenen Gewebe oder adhärente Zellen auf Folien optimiert worden. Jedoch Eizellen haften nicht effektiv auf Folien und einige Reagenzien im Kit waren zu hart, was zu Eizelle Lyse. Um diese Zerstörung zu verhindern, wurden einige Modifikationen an das Fisch-Kit vorgenommen. Insbesondere ersetzt Eizelle Permeabilisierung und waschen Puffer für die Immunfluoreszenz von Eizellen und Embryonen entwickelt die proprietäre Puffer. Die Permeabilisierung, Waschungen und Inkubationen mit Sonden und Verstärker wurden in 6-Well Platten durchgeführt und Eizellen wurden auf Folien am Ende des Protokolls mit Montage Media platziert. Diese Änderungen konnten die Einschränkungen des kommerziell erhältlichen Kit, insbesondere die Eizelle Lyse zu überwinden. Um präzise und reproduzierbar mRNAs in einzelnen Eizellen zählen, wurde Computer-Software verwendet. Dieses Protokoll ist zusammen, eine Alternative zur PCR und Sequenzierung den Ausdruck der spezifischen Transkripte in Einzelzellen zu vergleichen.
Einleitung
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde der Goldstandard für die mRNA Quantifizierung. Derzeit werden zwei Assays, digitale PCR (dPCR)1 und quantitative, real Time PCR (qPCR)2 verwendet. Die zwei PCR-Techniken hat dPCR höhere Empfindlichkeit als qPCR darauf hindeutet, dass es verwendet werden, könnte um mRNA Fülle in einzelnen Zellen zu messen. Aber in unseren Händen produziert dPCR Analyse der niedrigen Fülle mRNAs in Pools von 5 bis 10 Eizellen pro jede experimentelle Probe Daten mit geringen Reproduzierbarkeit und hohe Variation3. Dies ist wahrscheinlich auf die experimentel....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Tierische Verfahren wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der University of Nebraska-Lincoln genehmigt und alle Methoden wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Für diese Studie CD-1 fremd-Mäuse hatten ad libitum Zugang zu normalen Nagetier Chow und Wasser; Sie waren in einem 12:12 dunkle gepflegt: Licht-Zyklus.
1. Vorbereitung der erforderlichen Medien
- Fügen Sie für base Medien (OMM) 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4und 1,7 mM CaCl2-2 H2O 100 mL sterilem Wasser hinzu.
Hinweis: OMM Medium kann bis zu 1 Mona....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Nach dem Abschluss des Protokolls, das Ergebnis wird Einzelbilder aus der konfokalen Z-Serie (Abbildung 4A und Abbildung 5), Zusammengeheftete Bilder (Abbildung 4), und mRNA zählt (Abbildung 4 b). Beim Multiplexen durchgeführt wird, wird auch sein zusammengeführten Bilder zeigen die Bezeichnung für zwei verschiedene mRNA.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Eine Reihe von kleinen Schritten während des Protokolls gewährleisten die erfolgreiche Fluoreszenz und genaue Grafen von mRNAs. Erstens muss das Protokoll unmittelbar nach Sammlung und Fixierung der Eizellen erfolgen. Beachten Sie, dass die 4 % Paraformaldehyd Fixierung Puffer zu verhindern, dass Eizellen aneinander kleben PVP hinzugefügt wird. Wir fanden, dass es unmittelbar nach der Sammlung und Fixierung der die Eizellen das Experiment durchführen muss. Jede Verzögerung führt zu einer viel niedrigeren Fluoreszenzsigna.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verzollen
Danksagungen
Wir danken Dr. Daniel R. Larson für seine großzügige Unterstützung bei der Installation und Verwendung von Spot zu finden und Tracking-Programm 13 und die technische Unterstützung von der University of Nebraska Lincoln Mikroskopie Kern für die konfokale Mikroskopie-Bildgebung. Diese Studie ist ein Beitrag von der University of Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska und wurde unterstützt von UNL Luke Mittel (NEB-26-206/Accession Number-232435 und NEB-26-231/Zbl-Nummer-1013511).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| (±)-α-Liponsäure | Sigma-Aldrich | T1395 | Alpha-Liponsäure |
| Albumin, Rinderserum, niedrige Fettsäure | MP Biomedicals, LLC | 199899 | FAF BSA |
| BD 10mL TB Spritze | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 10 mL Spritze |
| BD PrecisionGlide Nadel | Becton, Dickinson and Company | 305109 | 27 1/2 Gauge |
| Nadel Calciumchlorid-Dihydrat | Sigma-Aldrich | C7902 | CaCl2-2H2O |
| Zitronensäure | Sigma-Aldrich | C2404 | Citrat |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| Na2HPO4 | |||
| Easy Grip Petrischale | Falcon Corning | 351008 | 35 mm |
| Schale Edetat Dinatrium | Avantor | 8994-01 | EDTA |
| Extra Fine Bonn Schere | Fine Science Tools | 14084-08 | Gerade, Scharf/Scharf, nicht gezahnt, 13mm Schneideschere |
| Fötales Rinderserum | Atlanta Biologicals | S10250 | FBS |
| Gentamicin Reagenz Lösung | gibco | 15710-064 | Gentamicin |
| GlutaMAX-I (100X) | gibco | 35050-061 | Glutamax |
| Gold Seal Micro Objektträger | Gold Seal | 3039 | 25 x 75mm Objektträger |
| Gonadotropin, aus dem Serum trächtiger Stuten | Sigma | G4877 | eCG |
| hCG rekombinant | NHPP | AFP8456A | hCG |
| Hyaluronidase, Typ IV-S: aus Rinderhoden | Sigma-Aldrich | H3884 | Hyaluronidase |
| Jewelers Style Pinzette | Integra | 17-305X | Pinzette 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw |
| L-(+)-Milchsäure, freie Säure | MP Biomedicals, LLC | 190228 | L-Lactat |
| Magnesiumsulfat Heptahydrat | Sigma-Aldrich | M2773 | MgSO4-7H2O |
| MEM Nichtessentielle Aminosäuren | Corning | 25-025-Cl | NEAA |
| Mikroskop Deckglas | Fisher Scientific | 12-542-C | 25 x 25x 0,15 mm Deckgläser |
| Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Sonde | Advanced Cell Diagnostics | 501891-C2 | Nanog Sonde |
| Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Sonde | Advanced Cell Diagnostics | 501611-C3 | Pou5f1 Sonde |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | Paraformaldehyd |
| PES 0,22 μm Membran -steril | Millex-GP | SLGP033RS | 0,22 μm Filter |
| Polyvinylpyrrolidon | Sigma-Aldrich | P0930 | PVP |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | 60128 | KCl |
| Kaliumphosphat monobasisch | Sigma-Aldrich | 60218 | KH2PO4 |
| Prolong Gold Antifade-Reagenz | Invitrogen | P36934 | Antifade-Reagenz ohne DAPI |
| RNAscope DAPI | Advanced Cell Diagnostics | 320858 | DAPI |
| RNAscope FL AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 320852 | Amplifier 1 |
| RNAscope FL AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 320853 | Amplifier 2 |
| RNAscope FL AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 320854 | Amplifier 3 |
| RNAscope FL AMP 4 ALT A | Advanced Cell Diagnostics | 320855 | Amplifier 4 ALT A |
| RNAscope FL AMP 4 ALT B | Advanced Cell Diagnostics | 320856 | Amplifier 4 ALT B |
| RNAscope FL AMP 4 ALT C | Advanced Cell Diagnostics | 320857 | Amplifier 4 ALT C |
| RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Detektionsreagenzien-Kit | Erweiterte Zelldiagnostik | FISH-Reagenzkit | |
| RNAscope-Sonde 3-Plex-Negativkontrollsonde | Erweiterte Zelldiagnostik | 320871 | Negativkontrolle |
| RNAscope-Sonde 3-Plex-Positivkontrolle | Erweiterte Zelldiagnostik | 320881 | |
| Verdünnungsmittel | Erweiterte Zelldiagnostik | 300041 | Sonde Diluent |
| RNAscope Protease III | Advanced Cell Diagnositics | 322337 | Protease III |
| RNAscope Protease III & IV Reagenzien-Kit | Advanced Cell Diagnostics | 322340 | FISH Protease-Kit |
| RNAscope Protease IV | Advanced Cell Diagnostics | 322336 | Protease |
| IV S/S Nadel mit Luer Hub 30G | Component Supply Co. | NE-301PL-50 | stumpfe 30-Gauge-Nadel |
| Natriumbikarbonat | Sigma-Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S6191 | NaCl |
| Natriumhydroxid | Sigma-Aldrich | 306576 | NaOH |
| Natriumpyruvat, >= 99 | % Sigma-Aldrich | P5280 | Pyruvatlösung |
| 6 Well Dish | Agtechinc | D18 | 6-Well-Schale |
| Taurin | Sigma-Aldrich | T8691 | Taurin |
| Gewebekulturschale | Falcon Corning | 353002 | 60 mm Schale |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Triton X-100 |
Referenzen
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory resp....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
