Methodenartikel

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

DOI:

10.3791/59419

⸱

16. Dezember 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 2Rutgers School of Graduate Studies at New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 3Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine Population von multipotenten Zellen, die aus verschiedenen adulten und fetalen Geweben isoliert werden können, einschließlich Fettgewebe. Als klinisch relevanter Zelltyp sind optimale Methoden erforderlich, um diese Zellen in vitro zu isolieren und zu erweitern. Die meisten Methoden zur Isolierung von adipose-abgeleiteten MSCs (ADSCs) sind auf harte Enzyme wie Kollagennase angewiesen, um das Fettgewebe zu verdauen. Obwohl diese Enzyme zwar wirksam das Fettgewebe abbauen und eine hohe ADSC-Erholung ergeben, sind diese Enzyme teuer und können sich nachteilig auf die ADSCs auswirken – einschließlich der Risiken der Verwendung xenogener Komponenten in klinischen Anwendungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um ADSCs aus frischen Lipoaspirat- und Abdominoplastikproben ohne Enzyme zu isolieren. Kurz gesagt, beruht diese Methode auf der mechanischen Disassoziation von jedem Massengewebe gefolgt von einem Explant-Typ-Kultursystem. Die ADSCs dürfen aus dem Gewebe auf die Gewebekulturplatte wandern, danach können die ADSCs für eine beliebige Anzahl von Forschungs- und/oder klinischen Anwendungen in vitro kultiviert und erweitert werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine Klasse von multipotenten adulten Stammzellen, die aus verschiedenen adulten und fetalen Geweben isoliert werden können, einschließlich aus Fettgewebe. Diese Zellen sind ein attraktiver Zelltyp sowohl für die Grundlagenforschung als auch für klinische Anwendungen aufgrund ihrer Plastizität, um sich in Zellen aller Keimschichten in vitro zu differenzieren, allogene Barrieren zu kreuzen, Entzündungsbereiche zu beherbergen und Entzündungen zu unterdrücken (in Sherman, et al.1). Adipose-abgeleitete MSCs (ASCs) sind aufgrund ihrer einfachen Beschaffung besonders attraktiv, da Fettgewebe im Allgemeinen als Rückwurfgewebe nach routinemäßigen Fettabsaugungs- und Abdominoplastikverfahren betrachtet wird. Nach der Gewinnung werden die Proben jedoch in der Regel harten Bedingungen – entweder enzymatisch oder zentrifugiert – ausgesetzt, um die ASCs2,3zu isolieren. Diese Methode veranschaulicht ein einfaches Verfahren zum Isolieren von ASCs mit einer Explant-Methode, in Ermangelung harter enzymatischer oder Zentrifugierungsschritte.

Die häufigste Methode zur Isolierung von ASCs besteht darin, eine Fettprobe zu waschen, die Probe enzymatisch mit Kollagennase zu verdauen, die Probe zu zentrifugieren und schließlich die roten Blutkörperchen vor der Kultivierung der ASCs4zu lysieren. Während die Verwendung von xenogenen Komponenten (z. B. enzymatische Verdauung mit Kollagenase) effizient bei der Isolierung einer hohen Ausbeute von ASCs ist, wird sie von der US-amerikanischen Food and Drug Administration als mehr als "minimal manipuliert" betrachtet und kann Risiken wie Immunreaktionen darstellen, wodurch die Verwendung der Zellen in der Klinik verboten wird5,6. Um das Risiko von xenogenen Komponenten zu minimieren, haben viele Gruppen vorgeschlagen, nicht-tierische abgeleitete, hergestellte Enzyme, um das Fettgewebe zu verdauen. Diese Enzyme sind jedoch immer noch hart und können den Zellphänotyp7verändern.

Andere Methoden zur Isolierung von ASCs sind Hochgeschwindigkeitszentrifugation, mit Kräften bis zu 1.200 x gund Wirbel, um die ASCs8zu isolieren. Selbst Kräfte von bis zu 400 x g reichten aus, um lebensfähige ASCs9zu isolieren. Während diese Zellen eine große Menge lebensfähiger Zellen produzieren, vermehren sich viele Protokolle nicht über 14 Tage8hinaus. Darüber hinaus ergibt die mechanische Isolierung weniger wiedergewonnene Zellen als die enzymatische Verdauung, aber ein höherer Anteil isolierter Zellen war ASCs im Vergleich zu anderen Zellen endogene fettgewebe bei Durchgang 010.

Die Isolierung einer reineren, lebensfähigeren Population von ASCs in weniger Zeit, gepaart mit den Kosten und Risiken xenogener Komponenten, macht die enzymatische Verdauung für die Übersetzung in die Klinik immer weniger attraktiv. Während die mechanische Isolierung zunächst ein günstiger Ansatz ist, gibt es erhebliche Unterschiede in den verwendeten Methoden, und das Volumen des verarbeiteten Gewebes ist auf die Größe der spezialisierten Zentrifugaleinheiten begrenzt und kann von der Bedienerkonsistenz abhängen2.

Während sowohl die enzymatische Verdauung als auch die Zentrifugation schnell zu einem hohen Volumen an ASCs führen, zeigen diese isolierten Zellen phänotypische Veränderungen, was Fragen über ihr Verhalten bei der Rückkehr an einen Patientenergibt 2. Eine explantbasierte Methode der ASC-Isolierung, wie in diesem Protokoll beschrieben, wird daher von einigen Gruppen verwendet, wobei die ASCs aus kleinen Stücken festen Fettgewebes3,11,12migrieren. Diese Migration ist wahrscheinlich ein Effekt der Zellen, die zu den nährstoffreichen Medien gezogen werden. Wie andere Populationen von MSCs haften ASCs an Kunststoff und überleben und vermehren sich in den verwendeten Gewebekulturmedien (Komponenten unten), was ihre Isolierung von den anderen Zelltypen aus dem Fettgewebe ermöglicht. Während zunächst weniger Zellen zurückgewonnen werden – oft dauert es > 1 Woche, bis die Zellen auf der Gewebekulturplatte sichtbar sind – vermehren sich diese nicht manipulierten ASCs in vitro, was eine Ausdehnung der Zellen auf klinisch relevante Volumina11,12,13ermöglicht.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verwendung von Lipoaspirat- und Abdominoplastikproben wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Rutgers University — Newark Campus genehmigt.

1. Vorbereitung von Tissue Culture Media

  1. Steril eisig vorbereiten 500 ml Gewebekulturmedien vor der Isolierung von ASCs. Um die Kulturmedien vorzubereiten, fügen Sie 10% definiertes fetales Kalbsserum (FCS) und Penicillin-Streptomycin (10.000 U/100 ml) zu Dulbeccos minimalen essentiellen Medien (DMEM) mit hoher Glukose und 2 mM L-Glutamin hinzu. Das Medium kann bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden und sollte immer warm (zwischen Raumtemperatur bis 37 °C) verwendet werden.
    1. Wenn für die Kultur der Stammzellen ein anderes Medium bevorzugt wird, bereiten Sie diese Medien stattdessen vor.

2. Isolierung von ASCs aus Adipose-Gewebe

  1. Erhalten Sie Lipoaspirate oder Abdominoplastik-Proben. Nach der IRB-Zulassung erhalten Sie Proben wie Rückwurfgewebe nach verschiedenen chirurgischen Eingriffen. Transportieren Sie die Lipoaspiraten in das Labor, in welchem Gefäß der Chirurg das Gewebe entfernt; Abdominoplastikproben in einem Probesack oder Behälter im Operationssaal transportieren.
  2. Lagern Sie die Probe(en) bei Raumtemperatur bis zu 6 h oder bei 4 °C bis zu 24 h, wenn sie nicht sofort verarbeitet wird. Gewebeproben, die über die oben genannten Zeiten hinaus verarbeitet werden, werden wahrscheinlich eine verminderte Zellausbeute haben. Halten Sie Abdominoplastikproben feucht durch Zugabe von 1x steriler Phosphat gepufferte Saline.
  3. Führen Sie ab diesem Zeitpunkt alle Schritte in einer laminaren Strömungshaube unter aseptischen Bedingungen durch. Tragen Sie Handschuhe zum persönlichen Schutz. Halten Sie 10% Bleichmittel, 70% Ethanol und Papiertücher in der Nähe, um biologische Verschüttungen schnell zu beseitigen. Entsorgt von überschüssigem Gewebe als biomedizinische Abfälle.
  4. Die Proben in < 1 mm Stücke zerkleinern. Wenn der Abdominoplastik-Block zu groß ist, um mit ihm zu arbeiten, schneiden Sie eine überschaubare Gewebegröße aus dem Block vor dem Hacken. Übertragen Sie das Abdominoplastikgewebe auf den Deckel einer sterilen 100 mm Platte. Verwenden Sie eine sterile Nadel, um ein Stück Gewebe an Ort und Stelle zu halten und verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die Stücke abzuschneiden, indem Sie entweder schneiden oder sanft vom Schüttgewebe abschneiden.
    1. Dieser Schritt ist in der Regel nicht für Lipoaspiraten erforderlich. Wenn jedoch große Gewebebrocken im Lipoaspirat beobachtet werden, entfernen Sie solche Brocken mit sterilen Zangen und prozessieren Sie wie oben.
  5. Übertragen Sie das Gewebe in ein frisches Rohr und invertieren oder schütteln Sie die Probe 5-6 Mal, um das Mischen aller Schichten zu gewährleisten. Optional: Wenn sich das Lipoaspirat vollständig abgesetzt hat, entfernen und entsorgen Sie die Ölschicht vor dem Mischen.
  6. 2,5-5 ml Gewebe auf eine 100 mm Vakuumgasplasma behandelte Gewebekulturplatte (Materialtabelle )übertragen Messen Sie das Volumen der Probe, indem Sie in ein frisches Zentrifugenrohr gießen. Verwenden Sie bei Bedarf einen sterilen Spachtel, um bei der Übertragung des Gewebes zu helfen.
  7. Fügen Sie ein entsprechendes Volumen von Gewebekulturmedien zur Platte hinzu. Wirbeln Sie die Platte vorsichtig, um den Inhalt zu mischen.
  8. Inkubieren Sie die Paten bei 37 °C in 5%CO2, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen auf der Basis der Platte zu sehen ist. Im Laufe der Zeit wandern die Zellen aus dem Gewebe auf die Plattenoberfläche, an der sie am Kunststoff haften. Wenn sie das Gewebe verlassen, erscheinen die Zellen als kleine Cluster um die Gewebestücke.
  9. Alle 24 h, entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und ersetzen Sie durch eine ähnliche Menge an Medien. Lassen Sie die Gewebestücke an Ort und Stelle, wenn möglich.
  10. Sobald eine ausreichende Anzahl von Zellen auf der Platte notiert ist (>10 Cluster von > 15-25 Zellen auf der Platte) oder nach 7 Tagen, je nachdem, was früher ist, entfernen Sie alle verbleibenden Gewebestücke.
  11. Kultur die ASCs in Gewebekulturmedien, bis sie 70% Koninfluenza erreichen oder bis die Cluster dicht werden (>5 dichte Zellhaufen auf der Platte, jeweils mit einem Durchmesser von ca. > 500 m), an dem die Zellen durchzogen werden sollen.

3 Kultur der ASCs

  1. Durchfahrt der ASCs, wenn die Elternplatte etwa 70% Konfluenz erreicht. Achten Sie darauf, eine Überkendfähigkeit der ASC-Kulturen zu vermeiden.
  2. Spülen Sie die Platte vorsichtig mit 1x Phosphat gepufferte Kochsaline und versuchen, die anhaftenden Zellen zu versuchen. Um die Zellen zu versuchen, saugen Sie die phosphatgepufferte Kochchenundin und fügen Sie 1 ml Trypsin mit 0,25% EDTA zu jeder Platte und inkubieren bei 37 °C für 5 min. Nach 5 min, bestätigen Sie die De-Haftung durch Mikroskopie. Wenn die Zellen noch haften, geben Sie die Zellen für weitere 5 min an den Inkubator zurück.
  3. Fügen Sie eine kleine Menge Medien (ca. 25% des gesamten Trypsinvolumens) auf die Platte, um das Trypsin zu deaktivieren, und waschen Sie die Basis der Platte vorsichtig mit dem Medium/Trypsin. Um die Platte zu waschen, halten Sie die Platte in einem leichten Winkel und pipette das Medium/ Trypsin von der Oberseite der Platte nach unten, lösen Sie alle wöchentlich angebrachten Zellen von der Platte. Die Zellen können mit einem Verhältnis von 1:3 neu plattiert oder mit einer Dichte von 120.000–500.000 Zellen pro Platte gesät werden.
    1. Übertragen Sie die Trypsin/Medien von der Platte in ein konisches Zentrifugenrohr, und pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 7 min. Setzen Sie die Zellen in Gewebekulturmedien (ca. 1 ml pro Anfangsplatte) aus und zählen Sie die Zellen vor der Aussaat. Um die Zellen zu zählen, übertragen Sie 10 l der Zellsuspension in das Hämozytometer und zählen Sie die Zellen, die im 4 x 4 Quadranten an jeder Ecke des Rasters vorhanden sind. Durchschnittlich diese Werte zusammen und multiplizieren Sie den Wert mit 104, um die Zellenzahl zu berechnen.
    2. Fügen Sie der Platte Medien hinzu, bevor Sie die Zellen aussäen. Fügen Sie die Zellen tropfenweise hinzu und wirbeln Sie dann die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung über die Platte zu gewährleisten.
      HINWEIS: Nach 3 Passagen sollten die anhaftenden Zellen asymmetrisch und spindelförmig erscheinen. ASC-Phänotyp und -verhalten können mit Durchflusszytometrie und Differenzierungstests bestätigt werden.
  4. Bestätigung des ASC-Phänotyps und -verhaltens mit Flow-Zytometrie und Differenzierungs-Assays
    1. Durchflusszytometrie
      1. Sammeln und pellet die Zellen wie oben beschrieben. Waschen Sie das Pellet mit 1x Phosphat gepufferte Saline und beschriften Sie die Zellen mit dem Hersteller empfohlenen Mengen an Antikörpern. Ein detailliertes Protokoll für die Durchflusszytometrie, ein gemeinsames Laborverfahren, finden Sie hier12,14,15.
      2. Wählen Sie Oberflächenmarker-Panels aus den folgenden Optionen aus, um den ASC-Phänotyp zu bestätigen: negativ für CD14, CD31, CD34, CD45 und CD106; und positiv für CD29, CD36, CD44, CD73, CD90 und CD10516,17,18,19. Das Vorhandensein von CD36 und das Fehlen von CD106 unterscheiden ASCs von Knochenmark-abgeleiteten MSCs20.
    2. Differenzierungstests: Bestätigen Sie die Multilineage-Differenzierung mit einem MSC-Differenzierungskit. Kits sind von mehreren Herstellern erhältlich, um adipogene, osteogene und chondrogene Differenzierungskapazität zu bestätigen. Ändern Sie die mit dem Kit bereitgestellten Medien alle 3–4 Tage gemäß den Protokollen des Herstellers für 3 Wochen oder bis eine morphologische Differenzierung beobachtet wird.
  5. Kultur der Zellen für mehrere Passagen; die Anzahl der benötigten Passagen hängt von der Anwendung(n) ab. Bestätigen Sie bei jeder Passage die MSC-Zellmorphologie und den Phänotyp mit den oben genannten Zelloberflächenmarkern, und stellen Sie sicher, dass die Differenzierungskapazität für mehrere Linien nicht verloren gegangen ist. Während sich das Erweiterungspotenzial zwischen den Spendern unterscheidet, können die meisten Proben für bis zu 6-9 Passagen erweitert werden.
  6. Cryopreserve die Zellen und speichern sie in flüssigem Stickstoff für die zukünftige Verwendung.

4 Kryokonservierung von ASCs

  1. Bereiten Sie 10 ml Gefrierlösungen A und B vor.
    1. Für Gefrierlösung A 20% FCS zu DMEM mit hoher Glukose hinzufügen.
    2. Zum Einfrieren von Lösung B 20% FCS und 20% Dimethylsulfid (DMSO) zu DMEM mit hoher Glukose hinzufügen.
  2. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min. Die Zellen in einem kleinen Volumen der Gefrierlösung A aussetzen und die Zellen mit einem Hämozytometer wie in Schritt 3.3.1 zählen.
  3. Berechnen Sie das endgültige Volumen, in dem die Zellen resuspendiert werden, um eine endgültige Zellkonzentration von 500.000–1.000.000 Zellen/ml zu erreichen. Verwenden Sie Gefrierlösung A, um das Pellet in 50% des Endvolumens wieder auszusetzen. Fügen Sie langsam ein gleiches Volumen der Gefrierlösung B tropfenweise hinzu, während Sie das Rohr aufheben, um die endgültige Zellkonzentration zu erreichen.
  4. Sofort einfrieren die Zellen in 1-2 ml Kryovials. Einfrieren der Kryovials in einem geregelten Gefrierschrank oder in einem Gefrierbehälter bei -80 °C, wodurch die Temperatur um 1 °C/min sinkt. Nach dem kontrollierten Einfrieren (über Nacht für einen Gefrierbehälter) übertragen Sie die Zellen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit der hier beschriebenen Methode wurden ASCs erfolgreich aus Lipoaspirat- und Abdominoplastikproben isoliert (Abbildung 1). Nach drei Passagen wurden die isolierten Zellen eine MSC-Morphologie (asymmetrisch, Spindelform) und Einen Phänotyp gefunden, ähnlich wie ASCs nach enzymatischer Verdauung (Abbildung 2). Frühere Studien aus unserer Gruppe und anderen haben gezeigt, dass diese ASCs in Adipozyten, Osteozyten und Neuronen wie andere MSCs differenzieren, einschließlich ASCs, die mit anderen Mitteln isoliert sind11,21.

In den meisten Fällen kann die MIGRATION von ASCs auf die Gewebekulturplatte innerhalb von 3–5 Tagen durch Hellfeldmikroskopie visualisiert werden. In einigen Fällen sind jedoch nur spärliche Zellen nach 7 Tagen sichtbar. In seltenen Fällen wandern die Zellen nicht auf die Platte und/oder vermehren sich erst im dritten Durchgang. Dieses Ergebnis korreliert in der Regel mit einer Verzögerung bei der Verarbeitung der Gewebeprobe.

figure-results-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der ASC-Isolierung von Abdominoplastik und Lipoaspiratproben. Abdominoplastik und LipoaspiratProben wurden als Rückwurfgewebe nach routinemäßigen chirurgischen Eingriffen erhalten. Abdominoplastikproben wurden geschreddert, danach wurden entweder Abdominoplastik oder Lipoaspiratproben als Explantationen in Gewebekulturmedien plattiert. Die ASCs wanderten aus dem Gewebe, in Richtung der nährstoffreichen Medien. Nach einer Woche wurden die Expflanzen entfernt und ASCs für nachgelagerte Experimente und/oder klinische Anwendungen kultiviert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Isolierte ASCs mit MSC-Morphologie und Phänotyp. ASCs, die durch die enzymfreie Explant-Methode isoliert sind, haben eine MSC-Morphologie und einen Phänotyp in Durchgang 3. (A) Wie andere MSCs haben diese ASCs eine asymmetrische Spindelform, unabhängig davon, ob sie durch Explant- oder Enzymatik -Methode isoliert sind (z. B. Kollagenase). Die mit der Enzymmethode isolierten ASCs ergeben eine längere, engere Morphologie im Vergleich zu den explantisolierten ASCs; Letztere ähneln MSCs, die von anderen enzymfreien Isolationsmethoden abgeleitet sind, wie z. B. Knochenmark-abgeleitete MSCs. (B) Wie andere MSCs sind die explantisolierten ASCs negativ für CD45 und positiv für CD73, CD90 und CD105. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ASCs sind aufgrund des einfachen Zugangs zum Gewebe eine attraktive Quelle für MSCs. Sowohl bei klinischen als auch bei Forschungsanwendungen müssen Wissenschaftler die Variabilität der Spender berücksichtigen, wenn sie diese Zellen isolieren und kultivieren. Aus noch ungeklärten Gründen weisen MSCs verschiedener Geber unterschiedliche Kapazitäten auf, um sich in vitro zu vermehren, was sich anschließend auf die Migration des ASC aus der Fettausscheidungs- und Proliferationskapazität auswirken wird. Während die Variabilität in der Zeit beobachtet werden kann, die es dauert, bis die ASCs, die aus diesen enzymfreien Expflanzen isoliert sind, um die Konfluenz zu erreichen, selten war, dass sich eine Probe nicht in vitro vermehrte.

Über die Variabilität der Spender hinaus ist die wahrscheinlichste Ursache für das Versagen der Zellen, aus dem Gewebe zu wandern und/oder sich in vitro zu vermehren, die Dauer, in der das Gewebe vor der Verarbeitung gelagert wurde. Wenn die Proben vor der Verarbeitung für >12 h sitzen durften oder zwischen Ernte und Verarbeitung nicht feucht gehalten wurden, wurden schlechtere Wanderungs- und Proliferationsraten beobachtet. Die einzigen Proben, die sich häufig nicht vermehrten, waren Abdominoplastikproben, die nicht mit einer Salinelösung feucht gehalten wurden: In diesen Fällen war das Gewebe in der Mitte des Gewebeblocks oft feucht genug, um zu verarbeiten, musste aber gelegentlich verworfen werden. Es ist daher wichtig, das Gewebe von der Erntezeit an durch die Verarbeitung feucht zu halten.

In Fällen, in denen ASCs auf der Platte bei der 1-Wochen-Marke nicht beobachtet werden, sollten die Fettexplants weiterhin von den Gewebekulturplatten entfernt werden, damit keine Gewebenekrose auftritt. Manchmal gibt es zu wenige Zellen, um sie leicht zu identifizieren, aber diese wenigen Zellen werden innerhalb des Kultursystems expandieren können. Wenn die Zellen immer noch nicht nach 3 Wochen beobachtet werden, sollte die Isolierung als fehlgeschlagen betrachtet werden.

In einigen Fällen, insbesondere der Abdominoplastik, ist es aufgrund der Einschränkungen innerhalb der chirurgischen Arena nicht möglich, eine wirklich aseptische Probe zu erhalten. Wenn es nicht möglich ist, das Gewebe mit einem sterilen Gefäß aus dem Operationssaal zu einer laminaren Durchflusshaube zu transportieren, reicht das Entfernen der äußeren 1 cm des Gewebes im Allgemeinen aus, um eine Kontamination durch Mikroorganismen zu verhindern. Wenn die Abdominoplastikprobe an der Haut befestigt ist, kann die Haut mit 70% Ethanol abgewischt werden, um diese Oberfläche vor dem Zerlegen des Fettgewebes zu sterilisieren.

Während des Hackprozesses ist es entscheidend, dass das Gewebe in kleine, feine Stücke zerkleinert wird. Wenn die Explanten zu groß sind, wird die Oberfläche nicht ausreichen, damit die ASCs aus dem Gewebe auf die Platte wandern können. Darüber hinaus ist es wichtig, dass das Gewebe nicht länger als nötig in der Platte verbleibt, damit das Gewebe nicht nekrotisch wird.

Eine Einschränkung dieser Methode ist die Verwendung eines Enzyms (im beschriebenen Protokoll, Trypsin), um die ASCs während des Gewebekulturprozesses zu lösen. Andere nicht tierische Enzyme, wie Accutase, können ersetzt werden, um die Notwendigkeit von tierischen Produkten zu beseitigen, jedoch wird dies die Kosten der Gewebekultur erhöhen. Aus diesem Grund untersuchen zahlreiche Gruppen unter anderem nicht-zweidimensionale Gewebekulturmethoden wie Bioreaktoren und Gerüstsysteme, um das MSC-Wachstumspotenzial zu erhöhen und gleichzeitig die Notwendigkeit zu minimieren, die Zellen von ihrem Substrat zu lösen22.

Beim Umzug von ASCs in die Klinik ist eine wesentliche Einschränkung der Explant-Isolationsmethode die Abhängigkeit von einer guten Produktionspraxis (GMP) Ebene Gewebekultur-Einrichtung, die viele medizinische Zentren fehlen. In diesen Fällen müsste jede der selbst geschlossenen handelsüblichen enzym- oder zentrifugationsbasierten Methoden eingesetzt werden. Da gMP-Einrichtungen jedoch immer häufiger auftreten, wird erwartet, dass dieser Effekt begrenzt wird. In der Zwischenzeit können selbst solche Einrichtungen, in denen es an GMP-Gewebekultureinrichtungen mangelt, die Explantationsmethode für die Untersuchung von ASCs in vitro in Betracht ziehen: Je weniger Manipulation, desto ähnlicher sind diese Zellen mit ihren in vivo-Pendants11.

Diese Methode bietet eine einfache Möglichkeit, ASCs aus Fettgewebe – sowohl Lipoaspiren als auch Abdominoplastiken – in Ermangelung harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte zu isolieren. Während die anfängliche Ausbeute von ASCs niedriger ist als die anderer Methoden, werden die ASCs in vitro vermehren, wodurch die Wirkung der niedrigeren Anfangsausbeute minimiert wird. Der Mangel an exzessiver oder gewaltsamer Manipulation macht ASCs auf diese Weise besonders relevant, da es weniger Fragen gibt (d.h. ob die beobachteten Effekte auf die Zellen selbst oder auf die Manipulation der Zellen während des Isolationsprozesses zurückzuführen sind. ).

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Bestätigungen

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DimethylsulfoxidFisher BioreagenzienBP231
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - HighGlucose Sigma-AldrichD5671
Falcon 3003 GewebekulturplattenCorning Corning
Fetal RinderserumSigma-AldrichF2442Serum wird chargengetestet, um sicherzustellen, dass es das MSC-Wachstum
unterstützt L-Glutamin LösungSigma-AldrichG7513
Mr. FrostyNalgene5100-0001
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
Trypsin-EDTA-LösungSigma-AldrichT4049

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective. Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).
  2. Conde-Green, A., et al. Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017(2016).
  3. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), (2017).
  4. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  5. Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
  6. Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
  7. Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  8. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  9. Palumbo, P., et al. In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).
  10. Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
  11. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).
  12. Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy. Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).
  13. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons. Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).
  14. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241(2014).
  15. Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).
  16. Munoz, J. L., et al. Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs. Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).
  17. Amati, E., et al. Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14(2017).
  18. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), (2015).
  19. Palumbo, P., et al. Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
  20. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  21. Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method. Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).
  22. Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. From "Bench to Bedside": Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Enzymfreie Isolierungmechanische GewebedissoziationExplantatkultursystemdurchflusszytometrische AnalyseDifferenzierungsassaysCD73 CD90 CD105 MarkerGewebekulturexpansionProtokoll zur ZerkleinerungsmethodeTrypsinierungsverfahren

Verwandte Artikel