Methodenartikel

Induktion des rechtsventrikulären Versagens durch Lungenarterienverengung und Bewertung der rechten ventrikulären Funktion bei Mäusen

DOI:

10.3791/59431

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13. Mai 2019

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1Department of Cardiology, State Key Laboratory of Organ Failure Research, Nanfang Hospital, Southern Medical University, 2The Third Clinical Medical College, Guangzhou Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier bieten wir einen nützlichen Ansatz für die Untersuchung des Mechanismus des rechtsventrikulären Versagens. Ein bequemerer und effizienterer Ansatz zur Verengung der Lungenarterie wird mit chirurgischen Instrumenten aus dem eigenen Haus etabliert. Darüber hinaus werden Methoden zur Bewertung der Qualität dieses Ansatzes durch Echokardiographie und Katheterisierung bereitgestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Mechanismus des rechtsventrikulären Versagens (RVF) erfordert eine Klärung aufgrund der Einzigartigkeit, hohen Morbidität, hohen Sterblichkeit und feuerfesten Natur von RVF. Frühere Rattenmodelle, die die RVF-Progression imitieren, wurden beschrieben. Im Vergleich zu Ratten sind Mäuse zugänglicher, wirtschaftlicher und weit verbreitet in Tierversuchen. Wir entwickelten einen Ansatz zur Pulmonarterienverenstriktion (PAC), der darin besteht, den Lungenstamm bei Mäusen zu bandieren, um eine rechtsventrikuläre Hypertrophie (RV) zu induzieren. Eine spezielle chirurgische Verriegelungsnadel wurde entwickelt, die eine einfachere Trennung der Aorta und des Lungenstammes ermöglicht. In unseren Experimenten reduzierte die Verwendung dieser hergestellten Riegelnadel das Risiko einer Arteriorrhexis und verbesserte die chirurgische Erfolgsrate auf 90%. Wir verwendeten verschiedene Polsternadeldurchmesser, um präzise quantitative Verengung zu erzeugen, die verschiedene Grade der RV-Hypertrophie induzieren kann. Wir quantifizierten den Grad der Verengung durch Die Auswertung der Durchblutungsgeschwindigkeit der PA, die durch nichtinvasive transthorakale Echokardiographie gemessen wurde. Die RV-Funktion wurde nach 8 Wochen nach der Operation durch rechte Herzkatheterisation genau bewertet. Die chirurgischen Instrumente aus dem Eigenen Haus wurden aus gängigen Materialien mit einem einfachen Verfahren, das leicht zu meistern ist. Daher ist der hier beschriebene PAC-Ansatz mit Instrumenten aus dem Labor leicht zu imitieren und kann in anderen Labors weit verbreitet sein. Diese Studie präsentiert einen modifizierten PAC-Ansatz, der eine höhere Erfolgsrate als andere Modelle und eine 8-wöchige postsurgeryische Überlebensrate von 97,8% hat. Dieser PAC-Ansatz bietet eine nützliche Technik zum Studium des RVF-Mechanismus und ermöglicht ein besseres Verständnis von RVF.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RV Dysfunktion (RVD), hier als Beweis für eine abnormale RV-Struktur oder Funktion definiert, ist mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden. RVF, als Endstufe der RV-Funktion, ist ein klinisches Syndrom mit Anzeichen und Symptomen von Herzinsuffizienz, die aus progressiver RVD1resultieren. Bei Unterschieden in Struktur und physiologischer Funktion haben linksventrikuläres (LV) Versagen und RVF unterschiedliche pathophysiologische Mechanismen. Es wurden einige unabhängige pathophysiologische Mechanismen in RVF berichtet, einschließlich der Überexpression von 2-adrenergen Rezeptorsignalisierung2, Entzündung3, Quertubuli-Umbau und Ca2+ Umgang mit Dysfunktion4 .

RVF kann durch Volumen- oder Drucküberlastung des Wohnmobils verursacht werden. Frühere Tiermodelle haben SU5416 (einen potenten und selektiven Inhibitor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptors) in Kombination mit Hypoxie (SuHx)5,6 oder Monocrotain7 verwendet, um eine pulmonale Hypertonie zu induzieren, führt zu RVF sekundär zu pulmonalen Gefäßerkrankungen2. Die Forscher, die diese Studien durchführten, konzentrierten sich auf die Vaskulatur anstelle der pathologischen Progression von RVF. Darüber hinaus hat Monocrotain extra-kardiale Wirkungen, die nicht genau kardiogene Krankheit darstellen können. Andere Modelle haben arterienförmige Shunts verwendet, um Volumenüberlastung und RVF8zu induzieren. Diese Operation ist jedoch schwierig durchzuführen und ungeeignet für Mäuse, die lange Induktionsperioden für die Produktion von RVF benötigen.

Ratte PAC-Modelle mit Banding-Clips existieren auch9,10. Im Vergleich zu Ratten haben Mäuse viele Vorteile als Tiermodelle von Herzerkrankungen, wie eine einfachere Fortpflanzung, eine breitere Nutzung, reduzierte Kosten und Zugang zur Genmodifikation11. Die Durchmesser der Bandclips reichen jedoch in der Regel zwischen 0,5 mm und 1,0 mm, die für Mäuse zu groß sind9. Darüber hinaus ist der Banding-Clip schwer zu produzieren, zu imitieren und in anderen Labors zu popularisieren.

Wir bieten ein Protokoll zur Entwicklung eines modifizierten reproduktiven RVF-Mausmodells auf der Grundlage von berichteten Studien, das PAC verwendet, um die Tetralogie des Fallot- und Noonan-Syndroms oder anderer pulmonaler arterieller hypertensiver Erkrankungen nachzuahmen12,13, 14,15,16,17,18,19. Dieser PAC-Ansatz wird durch Liganderung des Lungenstamms von Mäusen mit einem Riegel und einer Polsternadel aus dem eigenen Haus erzeugt, um den Grad der Verengung zu kontrollieren. Die Verriegelungsnadel besteht aus einer 90° gebogenen Injektionsspritze mit einer geflochtenen Seidennaht, die durch die Spritze geleitet wird. Die Nadel wird aus gängigen Materialien mit einem Prozess hergestellt, der einfach zu meistern ist. Die Polsternadel ist 120° von der Messnadel gekrümmt. Je nach Gewicht der Mäuse (20-35 g) werden Polsternadeln mit unterschiedlichen Durchmessern (0,6-0,8 mm) verwendet. Zusätzlich legen wir ein Bewertungskriterium fest, um die Stabilität und Qualität des RVF-Modells durch Echokardiographie und rechte Herzkatheterisierung zu bestimmen. Wir verwenden Mäuse als Mustertier wegen ihrer weit verbreiteten Verwendung in anderen Experimenten. Die Nadeln aus dem Labor sind leicht zu reproduzieren und können in anderen Labors weit verbreitet werden. Diese Studie bietet einen guten Ansatz für Forscher, um den Mechanismus von RVF zu untersuchen.

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Protokoll

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Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Leitlinien für die Tierforschung durchgeführt, die dem von den US National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996) entsprechen. C57BL/6 männliche Mäuse (8-10 Wochen alt, mit einem Gewicht von 20-25 g) wurden vom Animal Center der South Medical University zur Verfügung gestellt. Nach der Ankunft wurden die Mäuse unter einem 12/12 h Dunkel-Licht-Zyklus mit ausreichend Nahrung und Wasser untergebracht.

1. Vorbereitung der chirurgischen Instrumente und Herstellung der Nadeln

  1. Bereiten Sie die sterilen chirurgischen Instrumente (Abbildung1A), eine 6-0 geflochtene Seidennaht (Abbildung1B[a]) für die Ligation und eine 5-0 Nylonnaht für Schnittverschluss vor (Abbildung 1B[b]).
  2. Übergeben Sie die 6-0 geflochtene Seidennaht (Abbildung1B[a]) durch eine 25 G Nadel, die aus einer 1 ml Injektionsspritze demontiert wird. Dann krümmen Sie die Nadel um 90° mit hämostatischen Zangen, um eine Verriegelungsnadel zu bilden (Abbildung 1C[a]). Die 22 G-Nadel 120° (Abbildung1C (b)) zu einer Polsternadel zu biegen.

2. Vorbereitung auf die Operation

  1. Autoklaven Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation. Stellen Sie das Heizkissen auf 37 °C ein. Anästhesisieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung aus Xylazin (5 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg) zur Schmerzlinderung. Legen Sie die Mäuse in einzelne Boxen, um auf den Beginn des Betäubungsmittels zu warten.
    HINWEIS: Es wird auch empfohlen, 1,5% Isofluran zur inhalativen Anästhesie zu verwenden.
  2. Überwachen Sie die Angemessenheit der Anästhesie durch das Verschwinden des Pedalentzugsreflexes. Halten Sie die Mäuse in der Supine-Position auf dem Heizkissen, indem Sie die Schneidezähne mit einer Naht befestigen und die Beine mit Klebeband fixieren. Überprüfen Sie den Reflex erneut, um die Tiefe der Anästhesie zu gewährleisten.
  3. Tragen Sie die Enthaarungspaste vom Hals auf die Haut auf. Desinfizieren Sie den Bereich mit Jod gefolgt von 75% Alkohol.
  4. Führen Sie endotracheale Intubation durch.
    1. Passen Sie die Parameter des Tierminiventilators (Abbildung 1D) an und stellen Sie die Atemfrequenz auf 150/min und das Gezeitenvolumen auf 300 l ein.
    2. Ziehen Sie die Zunge leicht heraus, indem Sie eine spitzen Zange verwenden, heben Sie den Unterkiefer mit einem Labor gemacht Spachtel Figur 1C[c]), um die Glottis zu belichten, und sanft einfügen eine Labor gemacht Luftröhre (Abbildung1C[d]) durch die Glottis, während eine kalte Lichtquelle ist auf den Kehlkopf gerichtet.
    3. Schließen Sie das Rohr und das Beatmungsgerät an, um zu überprüfen, ob die Kanüle in die Luftröhre eingeführt wurde. Korrigieren Sie die Luftröhre mit Klebeband, wenn die Kanüle richtig eingelegt wurde.

3. Chirurgie

  1. Öffnen Sie die Brust.
    1. Machen Sie einen Schnitt in der Haut parallel zur zweiten Rippe, ca. 10 mm lang, mit einer Augenschere. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt aus dem Sternwinkel beginnt und auf der linken vorderen Achsellinie endet. Identifizieren Sie den zweiten interkostalen Raum, indem Sie die Rippen aus dem Sternwinkel zählen.
    2. Trennen und schneiden Sie die pectoralis major und pectoralis minor Muskeln mit Schere und Ellbogen Pinzette über dem zweiten interkostalen Raum, um diesen Raum zu belichten.
      HINWEIS: Es wird auch empfohlen, die Pectoralis-Muskeln unverblümt nach rechts und kranially zu trennen, zu mobilisieren und zu bewegen.
    3. Mit einer Ellbogenpinzette dringen Sie in den zweiten interkostalen Raum ein und öffnen Sie diesen Raum. Dann trennen Sie das Parenchym und den Thymus unverblümt, bis der Lungenstamm sichtbar ist.
  2. Verengen Sie die Lungenarterie.
    1. Den Lungenstamm und die aufsteigende Aorta mit ellbogener Pinzette stumpf trennen. Passieren Sie die Naht durch das Bindegewebe zwischen dem Lungenstamm und der aufsteigenden Aorta mit einer Riegelnadel.
    2. Legen Sie die Polsternadel (siehe Schritt 1.2) auf den Lungenstamm und legen Sie dann den Lungenstamm zusammen mit der Polsternadel mit der 6-0 geflochtenen Seidennaht auf. Entfernen Sie die Polsternadel unmittelbar nach der Füllung des Lungenkonus beobachtet und schneiden Sie die Enden der Naht.
    3. Beobachten Sie die Füllung des Lungenkonus, um zu beurteilen, ob eine Verengung vorhanden ist. Bewerten Sie den Reflex des Tieres erneut, um den Erfolg der Ligation zu gewährleisten.
      HINWEIS: Führen Sie eine Scheinoperation durch, indem Sie alle oben genannten Schritte mit Ausnahme der Verengung befolgen.
  3. Schließen Sie die Brust und die Haut mit der 5-0 Nylon Naht. Desinfizieren Sie die Haut erneut mit 75% Alkohol.
  4. Injizieren Sie 0,5 ml Saline subkutan, um flüssigkeitsverluste während der Operation zu ersetzen. Legen Sie die Maus separat mit Heizkissen in den Käfig, um die Erholung zu fördern. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige in einem 12/12 h hellen/dunklen Zyklusraum zurück, wenn das Bewusstsein zurückkehrt. Behandeln Sie die Mäuse mit Buprenorphin über ihr Trinkwasser für die folgenden 3 Tage.
  5. Achten Sie besonders auf die Heilung der Thorakotomiewunde, indem Sie die Mäuse in der ersten Woche 2x pro Tag überwachen, um Anzeichen einer unzureichenden Heilung, eingeschränkter Beweglichkeit oder Gewichtsverlust zu erkennen.

4. Echokardiographische Beurteilung der RV-Funktion nach der Operation

HINWEIS: Echokardiographische Veränderungen können 3 Tage nach der Operation erkannt werden.

  1. Anästhesisieren Sie die Mäuse mit 3% Isofluran durch Inhalation und halten Sie die Tiefe der Anästhesie mit 1,5% Isofluran. Befestigen Sie eine Maus auf der Plattform, kleben Sie ihre Krallen an die Elektrode und halten Sie das Tier in einer Supine-Position. Halten Sie die Herzfrequenz der Maus zwischen 450-550 Schlägen/min, indem Sie die Konzentration von Isofluran zwischen 1,5% und 2,5% einstellen.
  2. Entfernen Sie das Haar auf der Brust der Maus mit Enthaarungscreme und tragen Sie Ultraschallgel auf die Haut der Brust auf.
  3. Bewerten Sie die Lungenstammverengung mit einer 30 MHz Sonde.
    1. Halten Sie die Sonde bei 30° gegen den Uhrzeigersinn relativ zur linken parasternalen Linie, während Sie die Kerbe in kaudaler Richtung ausrichten. Regulieren Sie die y-Achse und diex-Achse unter dem B-Modus, bis die Mitralklappe, Aorta und LV-Kammer deutlich sichtbar sind.
    2. Drehen Sie die Sonde 30°-40° auf ihrer y-Achse in Richtung Brust. Regulieren Sie die y-Achse und diex-Achse, bis der Lungenkonus deutlich sichtbar ist.
    3. Platzieren Sie den Cursor an der Spitze der Lungenventil-Broschüren, um die Spitzenströmungsgeschwindigkeit zu messen. Verwenden Sie den Farbdopplermodus, indem Sie Farbe, gefolgt von PW, drücken und dann den Cursor bewegen, um die PW-gestrichelte Linie parallel zur Richtung des Blutflusses zu platzieren.
    4. Messen Sie die Spitzengeschwindigkeit der Lungenarterie. Speichern Sie die Daten und das Bild mit Cine Store und Frame Store.
  4. Bewerten Sie die RV-Parameter mit einem 30 MHz-Sonden.
    1. Stellen Sie die linke Seite des Pads so ein, dass es niedriger als die rechte Seite ist. Halten Sie die Sonde bei 30° zum Horizont entlang der rechten vorderen Achsellinie mit der Kerbe in kaudaler Richtung ausgerichtet. Regulieren Sie die y-Achse und diex-Achse, bis das Wohnmobil deutlich angezeigt wird.
    2. Drücken Sie M-Mode 2x, um die Indikatorlinie anzuzeigen. Messen Sie die RV-Kammerdimension, die fraktionale Verkürzung und die RV-Wanddicke. Speichern Sie die Daten und das Bild mit Cine Store und Frame Store.
  5. Stoppen Sie die Isofluran-Inhalation, damit die Mäuse das Bewusstsein wiedererlangen und die Tiere dann in einem 12 h hellen/dunklen Zyklusraum in ihre Käfige zurückbringen können.

5. Rechte Herzkatheterung zur Beurteilung der RV-Funktion

HINWEIS: Die rechte Herzkatheterisierung wurde 8 Wochen nach der Operation durchgeführt, um die RV-Funktion mit einem 1,0-F-Katheter und einem Überwachungssystem zu bewerten.

  1. Autoklaven Sie alle chirurgischen Instrumente. Anästhesisieren Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung aus Xylazin (5 mg/kg) und Ketamin (100 mg/kg).
  2. Nachdem der Pedalentzugsreflex verschwindet, fixieren Sie die Maus auf der Plattform, kleben Sie ihre Krallen an die Elektrode und halten Sie die Maus in Supine-Position. Entfernen Sie das Haar im chirurgischen Bereich mit Enthaarungscreme.
  3. Desinfizieren Sie die Haut des Operationsbereichs mit 75% Alkohol. Mit spitzen Zangen, ziehen Sie die Zunge leicht heraus, heben Sie den Unterkiefer mit einem Spachtel im Haus gemacht, um die Glottis zu belichten, und sanft einfügen Sie die Luftröhre im Haus durch die Glottis gemacht, während eine kalte Lichtquelle auf den Kehlkopf gerichtet ist. Verwenden Sie ein Beatmungsgerät (Abbildung1E), um die Beatmung zu unterstützen.
  4. Öffnen Sie die Brusthöhle mit einem 1,5 cm großen beidseitlichen Schnitt unterhalb des Xiphoid-Prozesses durch das Zwerchfell mit Augenschere und Zange. Schneiden Sie durch die Membran und Rippen mit augenheilbeomischen Scheren, um das Herz zu belichten. Durchdringen Sie die RV-freie Wand mit einer 23 G Nadel und entfernen Sie die Nadel; Drücken Sie die Punktionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen, um Blutungen zu stoppen. Punktieren Sie den Ventrikel mit der Katheterspitze durch die Wunde.
    HINWEIS: Es wird auch empfohlen, die rechte Herzkatheterisierung über die richtige juguläre Vene6durchzuführen. Wenn sich die Katheterspitze im Ventrikel befindet, zeigt der Monitor die RV-Druckkurve an.
  5. Zeichnen Sie den systolischen RV-Blutdruck, den RV-Enddiastolischen Druck, den RV dP/dt, die Herzfrequenz der Maus und die RV-Exponentialzeitkonstante der Entspannung (Tau) für 10 min auf, wenn die Kurve stabil ist. Klicken Sie mit der Software auf Auswählen und dann auf Analysieren.
  6. Regulieren Sie die Spitze des Katheters in Richtung des RV-Abflusstraktes. Ziehen Sie den Katheter heraus, nachdem die Aufnahme abgeschlossen ist. Legen Sie den Katheter in die Saline, wenn die Messungen abgeschlossen sind.
  7. Euthanisieren Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektionen von Pentobarbital-Natrium 150 mg/kg, gefolgt von zervikalen Dislokation. Dann ernten Sie Herz, Lunge und Tibia für histomorphologische und molekularbiologische Analysen.

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Ergebnisse

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In dieser Studie wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip der PAC-Gruppe (n = 9) oder der Schein-Operationsgruppe (n = 10) zugeordnet. Die Echokardiographie wurde 1, 4 und 8 Wochen nach der Operation durchgeführt. Acht Wochen nach der Operation wurden die Mäuse nach den letzten Echokardiographie- und Katheteruntersuchungen eingeschläfert und ihre Herzen für eine morphologische und histologische Beurteilung geerntet.

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Diskussion

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Pathologische Erhöhungen der RV-Fülldrücke führen zu einer Linksverschiebung des Septums, die die LV-Geometrie21verändern kann. Diese Veränderungen tragen zu einer reduzierten Herzleistung und LV-Auswurffraktion (LVEF) bei, die eine hämodynamische Störung des Kreislaufsystems verursachen können22. Daher ist ein effizientes, stabiles und wirtschaftliches Modell zur Untersuchung des Mechanismus von RVF wertvoll.

Wir haben einen effektiveren und hoc...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81570464, 81770271; an Dr. Liao) und der Municipal Planning Projects of Scientific Technology of Guangzhou (201804020083) (an Dr. Liao) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ALC-V8S BeatmungsgerätSHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  COALC-V8SBeatmungshilfe
Mini-Beatmungsgerät für TiereTyp845Beatmungshilfe
Ultraschallsystem für Tiere VEVO2100Visual Sonic  VEVO2100Echokardiographie
Kaltlicht-IlluminatorOlympusILD-2Light
Heat Pad - thermostatisches chirurgisches System (ALC-HTP-S1)SHANGHAI  ALCOTT  BIOTECH  COALC-HTP-S1Heizung
IsofluranRWD Life ScienceR510-22Inhalationsmittel Anästhesie
Matrx VIP 3000 Isofuran VaporizerMidmark CorporationVIP 3000Anästhesie
Medizinische geflochtene Seidennaht (6-0)Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co.6-0Ligation
Medizinisches Nylon-Nahtmaterial (5-0)Ningbo Medical Needle Co.5-0
(1,0 F)AD-Instrumente1,0 FFür die Rechtsherzkatheterisierung
Pentobarbital-NatriumsalzMerck25MGAnästhesie
PowerLab Multidirektionales physiologisches Aufzeichnungssystem AD-Instrumente4/35Aufzeichnung des Ergebnisses der Rechtsherzkatheterisierung
PräzisionswaageDenver InstrumentTB-114Wiegesensor
Selbstgemachte ZungennadelTrennung von Aorta und Lungenstamm
Selbstgemachte Polsternadel Verengung
Selbstgemachte TrachealintubationTracheale Intubation 
Mikrochirurgie-Geräte für KleintiereNapoxMA-65Chirurgische Instrumente
Transmission GelGuang Gong pai250MLEchokardiographie
Veet HaarentfernungscremeReckitt BenchiserRQ/B 33 Typ 2Haare von Mäusen entfernen
Vertikaler automatischer elektrothermischer DruckdampfsterilisatorHefei Huatai Medical Equipment Co.LX-B50LAutomatische Reinigung der chirurgischen Instrumente
Vertikales Mikroskop für die Chirurgie von KleintierenYihua Optisches InstrumentY-HX-4AFür die Katheterisierung des Rechtsherzens
Naht-Millar-Katheter

Referenzen

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Rechtsherzkatheteruntersuchungtransthorakale Echokardiographiechirurgische Latch NadelInduktion einer RV HypertrophieMausmodellh modynamische Pr funghistologische UntersuchungHerzfibrose

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