Ein In-Vitro-Modell für das Studium der Tau Aggregation mit Lentiviral-vermittelter Transkription menschlicher Neuronen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird ein Verfahren beschrieben, bei dem menschliche neuronale Kulturen mit Linsenkonstrukten übertragen werden, die für mutwillige menschliche Tauben kodieren. Durchgeführte Kulturen zeigen Tau-Aggregate und damit verbundene Pathologien.

Zusammenfassung

Die Aberrante Aggregation des Proteintau ist pathogenisch an einer Reihe neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD). Obwohl Mausmodelle der Tauopathie eine wertvolle Ressource für die Untersuchung der neurotoxischen Mechanismen des aggregierten Tau zur Verfügung gestellt haben, wird immer deutlicher, dass das Maushirn aufgrund der Unterschiede zwischen den Arten in der Neurophysiologie ungeeignet ist. Modellierung des menschlichen Zustandes. Fortschritte in den Methoden der Zellkultur haben menschliche neuronale Kulturen für den experimentellen Einsatz in vitro zugänglich gemacht und bei der Entwicklung der Neurotherapie geholfen. Trotz der Anpassung der menschlichen neuronalen Zellkulturen sind In-vitro-Modelle menschlicher Tauopathie aber noch nicht weit verbreitet. Dieses Protokoll beschreibt ein zelluläres Modell der Tau-Aggregation, in dem menschliche Neuronen mit Linsenvektoren transferiert werden, die für pathogenisch mutierte Tau kodieren, die zu einem gelben Fluoreszenzprotein (YFP)-Reporter verschmolzen sind. Durchgeführte Kulturen produzieren Tau-Aggregate, die positiv für Thioflavin und Anzeige von Markern der Neurotoxizität, wie verminderte axonale Länge und erhöhte lysosomale Volumen. Dieses Verfahren kann ein nützliches und kostengünstiges Modell für die Untersuchung menschlicher Tauopathien sein.

Einleitung

Die pathologische Aggregation des mikrotubule-assoziierten Proteintau ist ein prägendes Merkmal vieler neurodegenerativer Erkrankungen, darunter AD, frontotemporale Demenz (FTD), Pick es Krankheit und progressive supranuclear Lähmung (PSP) 1^. In einem nicht erkrankten Zustand bindet tau Mikrotubule-Filamente in neuronalen Axonen²und stabilisiert sie. Die krankheitsbedingte Hyperphosphoryation von Tau fördert jedoch die Tau-Aggregation, die Trennung von Mikrotubuli und die neuronale Toxizität 3. Die toxischen Wirkungen des aggregierten Tau können eine aberzogene^Aktivierung v....

Protokoll

1. Vorbereitung von Medien und Reagenten

1. Tauen Sie die Kellermembranmatrix-Beschichtung für Kulturplatten bei 4 ° C auf (lassen Sie die Kellermembranmatrix nicht erwärmen oder sie wird sich verfestigen). 1 mL aliquots machen und bei-20 ° C oder-70 ° C aufbewahren.
2. Reconstitute basic fibroblaast growth factor (bFGF) in sterile Phosphat-gepufferte Saline (PBS) bei 10 μg/mL und machen 10 μL Aliquots. Speichern Sie sie bei 4 ° C.
3. Zu einer neuen, unöffneten 500 ml Flasche DMEM/F12 mit Glutamin, B27 (10 ml), N2 (5 ml) und Penicillin-Streptomycin (5 ml) hinzufügen. 50 mL dieses neuronalen Stammzellmediums (NSC) in ein konisches Rohr legen und 10....

Ergebnisse

Tau-RDLM-YFP-übertragene Neuronen wurden fluoreszierend mit YFP versehen, und RDLM-übertragene Kulturen zeigten Aggregate nach der Transduktion. Diese Einschlüsse befleckten positiv für Thioflavin (Abbildung 1). Wie Abbildung 1 zeigt , produziert dieses Protokoll neuronale Kulturen, die Thioflavin-positive Tau-Aggregate aufweisen. Für erste Experimente wird empfohlen, dass die neuronale Differenzierung durch die Immunolabeling des neuronenspezifischen Markers β-.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines In-vitro-Modells menschlicher Tauopathie, das silberfarbene Flecken positive Aggregate und Thioflavin-positive neurofibrilläre Tangles (NFTs) aufweist. Darüber hinaus weisen die übertragenen Zellen tau-induzierte Pathologien wie morphologische Defekte, eine reduzierte Synaptogenese und ein erhöhtes lysosomales Volumen auf. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es ein zugängliches und kostengünstiges Modell der neuronalen Tauopathie bietet, das sowohl für .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm Kulturschalen	Thermofisher	12556002
15 mL Röhrchen	Biopioneer	CNT-15
16% Paraformaldehyd	Thermofisher	50-980-487
24 Well Kulturplatten	Thermofisher	930186
50 mL Röhrchen	Biopioneer	CNT-50
70% Ethanol in Sprühflasche	Verschiedene Quellen	NA
B27 Supplement	Thermofisher	17504044
Basalmembranmatrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Rinderserumalbumin	Sigma	A7906
Zellkultur-Inkubator	Verschiedene Quellen	NA
Zentrifuge	Verschiedene Quellen	NA
DMEM-F12 Nährmedien mit Glutamin	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% Konzentration oder höher)	Verschiedene Quellen	NA
Fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper	Verschiedene Quellen, experimentierabhängig	NA
Fluoreszenzmikroskop	Verschiedene Quellen	NA
Glasdeckgläser	Thermofisher	1254581
Objektträger Thermofisher		12-550-15
Menschliche neurale Stammzellen	Verschiedene Quellen	NA
Lentivirale Vektoren	Verschiedene Quellen	Sonderanfertigung
Eindeckmedien	Thermofisher	P36934
N2 Ergänzung	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Thermofisher	14190250
Primärantikörper	Verschiedene Quellen, experimentierabhängig	NA
Wippende oder rotierende Plattform	Verschiedene Quellen	NA
Sterile Zellkulturhaube	Diverse Quellen	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Wasserbad	Diverse Quellen	NA