Methodenartikel

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

DOI:

10.3791/59438

⸱

9. April 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh, 2Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression. Im Laufe der Jahre führte diese Technik zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung. Allerdings ist wie bei vielen ähnlichen experimentellen Techniken, die Ergebnis der Western-Blot Analysen leicht Entscheidungen bei der Gestaltung und Durchführung des Experiments beeinflusst. Spezifische Zimmermädchen Proteine traditionell verwendet wurden, um Protein-Ebene für die Quantifizierung zu normalisieren, aber diese haben eine Reihe von Einschränkungen und sind daher in den letzten Jahren zunehmend kritisiert worden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das wir entwickelt haben, um komplexe Vergleiche von Protein Ausdruck Variation in verschiedenen Geweben, Maus-Modellen (einschließlich Krankheitsmodelle) und Entwicklungsstörungen Zeitpunkte auf höchstem Niveau zu ermöglichen. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Gesamtprotein Fleckes und Einführung in die Verwendung von einem internen standard laden, es ist möglich, bestehende Einschränkungen in der Anzahl der Stichproben zu überwinden, die in Experimenten verglichen werden können und systematisch vergleichen Proteingehalte in eine Reihe von experimentellen Bedingungen. Dieser Ansatz erweitert die Verwendung von traditionellen western-Blot-Techniken, so dass Forscher besser Proteinexpression in verschiedenen Geweben und Proben zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Westliche Beflecken ist eine Technik, die häufig verwendet wird, zu erkennen und zu quantifizieren, Protein-Expression, einschließlich Gewebe Homogenates oder Extrakte. Im Laufe der Jahre hat diese Technik führte zu viele Fortschritte in der Grundlagenforschung und klinische Forschung, wo es als diagnostisches Werkzeug lässt sich das Vorhandensein der Krankheit1,2identifizieren. Westliche Beflecken wurde erstmals im Jahr 1979 als eine Methode, um Proteine von Polyacrylamid-Gele auf Nitrozellulose Blätter übertragen und anschließend visualisieren Proteine mit sekundären Antikörpern, die waren entweder radioakti....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gewebe für dieses Verfahren stammen aus tierexperimentellen Studien, die von der internen Ethikkommission an der Universität von Edinburgh genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit institutionellen und UK Home Office Regelungen unter der Aufsicht der zuständigen persönliche und Projekt-Lizenzen.

Hinweis: Dieses Protokoll optimiert mit standardisierten, im Handel erhältlichen Kits und Reagenzien um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen (siehe Tabelle der Materialien).

1. Vorbereitung der Proben

  1. Proteingewinnung
    1. Transfer Snap eingefroren Zelle oder Gewebepr....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind Beispiele für die Verwendung von TPS und internem Standard Vergleiche von Protein-Ebene über Gewebe und Zeitpunkte zu erleichtern. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse von Western blotting auf Protein extrahiert aus dem Gewebe von Neugeborenen (postnatale 5.Tag) im Vergleich zu Erwachsenen Mäusen (10 - Wochen alten) erhalten. TPS und Smn Immunoblot sind in Figur 1A, Cdargestellt. Quantifizierung der Fluoresz.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit der geeigneten Versuchsdesign, Kontrollmaßnahmen und statistische Analyse westliche Beflecken lässt sich verlässliche quantitative Schätzungen der Proteinexpression innerhalb und zwischen ein vielfältiges Angebot an biologischen Proben vornehmen. Das Protokoll, die, das wir im aktuellen Manuskript beschreiben, soll dienen als Richtlinien für Forscher auf der Suche nach Western blotting um Quantitative Analyse auf größeren und komplexeren Gruppen von Proben, verpflichten sich, durch eine Kombination von Fluoreszenz-ba.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.J.N.G. wird vom Wellcome Trust (Grant 106098/Z/14/Z) unterstützt. Sonstige Finanzierung wurde durch den Trust SMA (SMA UK Konsortium; vorgesehen T.H.G. & Y-T. (H.) SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), der University of Edinburgh DTP in Präzision Medizin (T.H.G., l.l. & U.V.M.) und Europa Euan MacDonald Zentrum zur Erforschung von Motoneuronen Krankheiten (T.H.G).

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Alpha

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LaboratoriesGL20057SNTL
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-frei 100x 5mLThermoFisher Scientific78437
Handheld-Homogenisator VWR Collection431-0100
iBlot 2 GeltransfergerätThermoFisher ScientificIB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, normale GrößeThermoFisher ScientificIB401031
Image Studio LiteLicorN/AKostenloser Download von https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/
IRDye 800CW SekundärantikörperLicor–Wählen Sie einen geeigneten Sekundärantikörper aus, der spezifisch gegen den Wirt des Primärantikörpers ist.
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23235
Novex Sharp Vorgefärbtes Protein StandardThermoFisher ScientificLC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gele, 1,0 mm, 15 WellThermoFisher ScientificNP0323BOX
NuPAGE LDS Probenpuffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Puffer (20X)ThermoFisher ScientificNP0001
Odyssey Blocking BufferLicor927-40000
Gereinigter monoklonaler Anti-SMN (Survival Motor Neuron) Maus-AntikörperBD Transduction Laboratories610646Wird häufig in der SMN/SMA-Literatur verwendet und liefert konsistente Ergebnisse, unabhängig von der Chargennummer
REVERT Total Protein Stain, 250 mL Likör926-11021 
WASCHLÖSUNG ZURÜCKSETZEN Likör926-11012 
RIPA Lyse- und ExtraktionspufferThermoFisher Scientific89900
XCell  SureLock Mini-ZelleThermoFisher ScientificEI0001

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
  2. Hutchinson, A. B., et al.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

ProteinexpressionsanalyseFluoreszierende Gesamtprotein F rbungInterner LadungsstandardProteinnormalisierungGewebeproteinvergleichEntwicklungszeitpunkteProteinkonzentrationsmessungGelelektrophoreseWestern Blot Transfer

Verwandte Artikel