Hier beschreiben wir zwei nicht-invasive Methoden zur chronischen Kontrolle der neuronalen Aktivität mit Chemogenetik bei Mäusen. Augentropfen wurden verwendet, um Clozapin-N-Oxid (CNO) täglich zu liefern. Wir beschreiben auch zwei Methoden für die längere Verabreichung von CNO im Trinkwasser. Diese Strategien zur chronischen neuronalen Kontrolle erfordern minimale Eingriffe, um den Stress der Tiere zu reduzieren.
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Methodenartikel
Nicht-invasive Strategien zur chronischen Manipulation der DREADD-kontrollierten neuronalen Aktivität
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chemogenetische Strategien haben sich als zuverlässige Werkzeuge für die Fernsteuerung der neuronalen Aktivität herauskristallisiert. Unter diesen, Designer-Rezeptoren ausschließlich durch Designer-Medikamente aktiviert (DREADDs) haben sich die beliebtesten chemogenetischen Ansatz in der modernen Neurowissenschaft verwendet. Die meisten Studien liefern das Ligand Clozapin-N-Oxid (CNO) mit einer einzigen intraperitonealen Injektion, die für die akute Aktivierung/Hemmung der gezielten neuronalen Population geeignet ist. Es gibt jedoch nur wenige Beispiele für Strategien zur chronischen Modulation von DREADD-kontrollierten Neuronen, von denen die meisten auf den Einsatz von Trägersystemen angewiesen sind, die einen chirurgischen Eingriff erfordern. Hier erweitern wir zwei nicht-invasive Strategien zur Bereitstellung des Liganden-CNO zur chronischen Manipulation der neuronalen Population bei Mäusen. CNO wurde entweder mit repetitiven (täglichen) Augentropfen oder chronisch durch das Trinkwasser des Tieres verabreicht. Diese nicht-invasiven Paradigmen führen zu einer robusten Aktivierung der Designerrezeptoren, die während der gesamten CNO-Behandlungen fortbestehen. Die hier beschriebenen Methoden bieten Alternativen zur chronischen DREADD-vermittelten Kontrolle der neuronalen Aktivität und können für Experimente nützlich sein, die entwickelt wurden, um das Verhalten bei frei beweglichen Tieren zu bewerten, wobei der Schwerpunkt auf weniger invasiven CNO-Bereitstellungsmethoden liegt.
Einleitung
Technische Fortschritte auf dem Gebiet der Neurowissenschaften haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die Aktivität bestimmter neuronaler Populationen genau zu identifizieren und zu kontrollieren1. Dies hat dazu beigetragen, die Grundlagen der neuronalen Schaltkreise und ihre Auswirkungen auf das Verhalten von Tieren besser zu verstehen, sowie die Überarbeitung etablierter Dogmen2,3. Unter diesen neuartigen Werkzeugen haben optogenetische und chemogenetische Strategien nicht nur die Qualität der Entdeckungen, sondern auch die Art und Weise, wie Experimente konzipiert und gestaltet werden....
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Protokoll
Alle Tiere wurden nach den Richtlinien der Tierpflege- und Einsatzausschüsse des National Institute of Mental Health (NIMH) behandelt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Schmerz und die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren.
1. Adeno-assoziierte Virusinjektionen im Hippocampus
HINWEIS: Wilde männliche Mäuse mit gemischtem Hintergrund (B6/129 F1 Hybrid, 3 Monate alt) wurden für stereotaxisch mit einem AAV injiziert, der den M3-Muskarinrezeptor (hM3Dq) in den Hippocampus kodiert. Während des gesamten Experiments wurden Mäuse eingeschossig untergebracht, unter einem normalen 12 h Licht....
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Ergebnisse
Wir beobachteten, dass eine wiederholte CNO-Lieferung mit Augentropfen eine robuste Induktion der c-Fos-Expression in den meisten infizierten Neuronen hervorrief (Abbildung 1C), was zeigt, dass die Wirksamkeit der CNO-Bereitstellung während der wiederholten Exposition aufrechterhalten wird. Darüber hinaus wurde eine signifikante Induktion von c-Fos in Proben beobachtet, die 2 h nach der CNO-Behandlung entnommen wurden, verglichen mit Proben, die 6 h nach CNO-Exposition(Abbildungen 1D.......
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Diskussion
DREADDs haben sich als ein beliebter und effektiver Ansatzzur Fernmanipulation neuronaler Aktivität 17 herauskristallisiert. Die Entwicklung alternativer Strategien für die CNO-Bereitstellung wird das Spektrum der verfügbaren Optionen für spezifische experimentelle Einstellungen weitgehend erweitern. Darüber hinaus minimieren nicht-invasive Strategien für die Bereitstellung von CNO mögliche Fehlinterpretationen von Ergebnissen, indem sie nebenwirkungen, die sich direkt auf die Gesundheit des Tiere.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch das intramurale Forschungsprogramm am National Institute of Mental Health (ZIA MH002964-02) unterstützt. Wir danken der Unterstützung des NIMH IRP Nagetier Behavioral Core (ZIC MH002952).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma Life Science | #A2153-100G | Lyophilisiertes Pulver > 96% (Agarose-Gelelektrophorese) |
| C57BL/6J Mäuse | Das Jackson Labor | #000664 | männliche Mäuse, 3 Monate alt |
| Kapillaren | Drummond Scientific Company | #3-000-203-G/X | Außendurchmesser: 1,14 Zoll |
| Clozapin-N-oxid | Sigma | #C0832 | 5 mg |
| Forane | Baxter | #NDC 10019-360-60 | Isofluran, USP |
| Mikroinjektor III | Drummond Scientific Company | #3-000-207 | Nanoject III - Programmierbarer Nanoliter-Injektor |
| Eindeckmedien | Invitrogen | #P36930 | Prolong Gold Antifading-Reagenz |
| Paraformaldehyd | Elektronenmikroskopie Sciences | #15710 | 16% wässrige Lösung (methanolfrei), 10 mL |
| Primärer c-Fos Antikörper | Zellsignaltechnologie | #2250S | c-Fos (9F6) Kaninchen mAb ( 100&Mikro; L) |
| rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry | UNC Vektor-Kerntiter | : ~3 x 1012 vg/mL | |
| rAAV5/hSyn-mCherry | UNC Vektor-Kerntiter | : ~3x10e12 vg/ml | |
| Sekundärantikörper | Invitrogen | #A21206 | Alexa Fluor TM 488 Esel Anti-Kaninchen IgG(H+L), 2mg/ml |
| Triton X-100 | americanbio.com | #AB02025-00100 |
Referenzen
- Park, H. G., Carmel, J. B. Selective Manipulation of Neural Circuits. Neurotherapeutics. 13 (2), 311-324 (2016).
- Muir, J., Lopez, J., Bagot, R. C. Wiring the depressed brain: optogenetic and chemogenetic circuit interrogation in animal models of dep....
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Nachdrucke und Genehmigungen
