Methodenartikel

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

DOI:

10.3791/59448

⸱

22. August 2019

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Pharmacology, University of South Alabama

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mehrere Techniken basieren auf dem Nachweis von Fluoreszenzsignalen, um Phänomene zu identifizieren oder zu untersuchen oder Funktionen aufzuklären. Die Trennung dieser Fluoreszenzsignale erwies sich bis zum Aufkommen der hyperspektralen Bildgebung als umständlich, bei der Fluoreszenzquellen voneinander sowie von Hintergrundsignalen und Autofluoreszenz getrennt werden können (angesichts der Kenntnis ihrer spektralen Unterschriften). Die traditionelle hyperspektrale Bildgebung beim Emissionsscannen leidet jedoch unter langsamen Erfassungszeiten und niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen aufgrund der notwendigen Filterung sowohl von Anregungs- als auch von Emissionslicht. Es wurde bereits gezeigt, dass die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen die erforderliche Erfassungszeit reduziert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Daten erhöht. Mit kommerziell erhältlichen Geräten beschreibt dieses Protokoll, wie ein hyperspektrales Mikroskopkopiesystem für die Anregung, das Scannen von Hyperspektralbildern zusammenbaut, kalibriert und verwendet wird, um Signale von mehreren Fluoreszenzquellen in einer einzigen Probe zu trennen. Obwohl diese Technik für die mikroskopische Bildgebung von Zellen und Geweben sehr anwendbar ist, kann sie auch für jede Art von Experiment mit Fluoreszenz nützlich sein, bei dem es möglich ist, Anregungswellenlängen zu variieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: chemische Bildgebung, Umweltanwendungen, Augenpflege, Lebensmittelwissenschaft, Forensik, Medizin und Mineralogie.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrale Bildgebung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden und wird durch mehrere Begriffe1,2,3,4bezeichnet. Im Allgemeinen bezieht sich die Spektralbildgebung auf Daten, die in mindestens zwei räumlichen Dimensionen und einer Spektraldimension erfasst wurden. Multispektrale und hyperspektrale Bildgebung unterscheiden sich am häufigsten durch die Anzahl der Wellenlängenbänder oder ob die Spektralbänder zusammenhängend sind1. Für diese Anwendung werden hyperspektrale Daten definiert als Spektraldaten, die mit zusammenhängenden Wellenlängenbändern erfasst werden, die durch den Abstand der mittleren Wellenlängen erreicht werden, nicht weniger als die Hälfte der vollen Breite bei halbmaximaler Breite (FWHM) jedes Bandpassfilters, der für die Anregung verwendet wird (d. h. 5 nm Wellenlängenabstand für Bandpassfilter mit 14-20 nm Bandbreiten). Die Kontinuität der Datenbänder ermöglicht ein Oversampling des Datensatzes, wodurch sichergestellt wird, dass die Nyquist-Kriterien beim Sampling der Spektraldomäne erfüllt sind.

Hyperspektrale Bildgebung wurde von der NASA in den 1970er und 1980er Jahren in Verbindung mit dem ersten Landsat-Satelliten5,6entwickelt. Das Sammeln von Daten aus mehreren zusammenhängenden Spektralbändern ermöglichte die Erzeugung eines Strahlungsspektrums jedes Pixels. Die Identifizierung und Definition des Strahlungsspektrums einzelner Komponenten ermöglichte es, Oberflächenmaterialien nicht nur anhand ihrer charakteristischen Spektren zu erkennen, sondern auch intervenierende Signale, wie z.B. Schwankungen des Signals durch atmosphärischen Bedingungen. Das Konzept der Detektion von Materialien anhand ihrer charakteristischen Spektren wurde 1996 auf biologische Systeme angewandt, als Schröck et al. Kombinationen von fünf verschiedenen Fluorophoren und ihren bekannten Spektren verwendeten, um markierte Chromosomen in einem Prozess zu unterscheiden, der als spektrale Karyotypisierung7. Diese Technik wurde im Jahr 2000 von Tsurui et al. für die Fluoreszenzbildgebung von Gewebeproben ausgearbeitet, wobei sieben fluoreszierende Farbstoffe und Singularwertzersetzung verwendet wurden, um eine spektrale Trennung jedes Pixels in lineare Kombinationen von Spektren in der Referenzzuteilung zu erreichen. Bibliothek8. Ähnlich wie ihre Fernerkundungs-Gegenstücke kann der Beitrag jedes bekannten Fluorophors aus dem hyperspektralen Bild berechnet werden, wobei a priori Informationen über das Spektrum jedes Fluorophors gegeben sind.

Hyperspektrale Bildgebung wurde auch in den Bereichen Landwirtschaft9, Astronomie10, Biomedizin11, chemische Bildgebung12, Umweltanwendungen13, Augenpflege14, Lebensmittelwissenschaft15, Forensische Wissenschaft16,17, medizinische Wissenschaft18, Mineralogie19, und Überwachung20. Eine wesentliche Einschränkung der aktuellen hyperspektralen Bildgebungssysteme des Fluoreszenzmikroskops besteht darin, dass die standardmäßige hyperspektrale Bildgebungstechnologie Fluoreszenzsignale in schmalen Bändern isoliert, indem sie zuerst das Anregungslicht filtert, um die Anregung der Probe zu steuern, 2) weitere Filterung emittiertes Licht, um die Fluoreszenzemission in schmale Bänder zu trennen, die später mathematisch getrennt werden können21. Durch das Filtern sowohl der Anregungsbeleuchtung als auch der emittierten Fluoreszenz wird die Menge des verfügbaren Signals reduziert, was das Signal-Rausch-Verhältnis senkt und lange Erfassungszeiten erfordert. Das niedrige Signal und die langen Erfassungszeiten begrenzen die Anwendbarkeit der hyperspektralen Bildgebung als Diagnostisches Werkzeug.

Es wurde eine bildgebende Modalität entwickelt, die hyperspektrale Bildgebung nutzt, aber das verfügbare Signal steigert und dadurch die erforderliche Erfassungszeit21,22reduziert. Diese neue Modalität, die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen genannt wird, erfasst spektrale Bilddaten, indem sie die Anregungswellenlänge variiert und ein breites Spektrum emittierten Lichts sammelt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Technik im Vergleich zu Emissionsscantechniken21,22Größenordnungen im Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses ist weitgehend auf den weiträumigen (ca. 600 nm) von Emissionslicht, der erkannt wird, während spezifität durch Filterung nur des Anregungslichts anstelle der Fluoreszenzemission gewährleistet wird. Dadurch erreicht das gesamte emittierte Licht (für jede Anregungswellenlänge) den Detektor21. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Autofluoreszenz von exogenen Etiketten zu unterscheiden. Darüber hinaus reduziert die Möglichkeit, die Erfassungszeit durch erhöhtes nachweisbares Signal zu reduzieren, die Gefahr von Photobleichungen und ermöglicht Spektralscans mit einer Erfassungsrate, die für die spektrale Video-Bildgebung akzeptabel ist.

Ziel dieses Protokolls ist es, als Datenerfassungsleitfaden für die anregend-scannende hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zu dienen. Darüber hinaus sind Beschreibungen enthalten, die helfen, den Lichtpfad und die Hardware zu verstehen. Ebenfalls beschrieben ist die Implementierung von Open-Source-Software für ein anregendes hyperspektrales Bildgebungsmikroskop. Schließlich werden Beschreibungen bereitgestellt, wie das System auf einen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert, Software- und Hardwareeinstellungen für genaue Ergebnisse angepasst und das erkannte Signal in Beiträge einzelner Komponenten entgemischt werden kann.

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Protokoll

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1. Geräteeinrichtung

  1. Lichtquelle: Wählen Sie eine Breitband-Spektrallichtquelle mit hoher Leistung und hoher Kollimation (für diese Studien wurde eine 300 W Xe Lichtbogenlampe verwendet).
  2. Shutter (optional): Fügen Sie einen Verschluss zum optischen Pfad hinzu, um die Photobleichung für die Zeitraffer-Bildgebung zu reduzieren.
  3. Tunable Filtersystem: verfügen über eine mechanische Tuning-Baugruppe und einen Dünnschicht-Tunable-Filter (TFTF), um den gewünschten wellenlängenverstellbaren Anregungsbereich (z. B. 360-485 nm) zu ermöglichen.
  4. Mikroskop: Verwenden Sie ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten dichroitischen Filterrevolver und einem Controller.
    1. Fluoreszenzfilterwürfel: Einen Langpass-Fluoreszenzfilterwürfel montieren. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, wählen Sie einen dichroitischen Spiegel und einen Langpass-Emissionsfilter bei derselben Wellenlänge, um eine optimale Trennung der Anregung von Emissionslicht (z. B. 495 nm) zu erreichen.
    2. Ziel: Verwenden Sie ein geeignetes apochromatisches Ziel, um einen gleichmäßigen Fokus über den für das Experiment verwendeten Wellenlängenbereich zu gewährleisten (für diese Studie wurde ein 60-faches Wasserobjektiv verwendet).
    3. Automatisierte Phase (optional): Verwenden Sie eine automatisierte Stufe für die schnelle Abtastung mehrerer Sichtfelder und/oder sehr großer Felder durch Bildnähte. Kalibrieren Sie die Bühne mit dem Objektiv und der Kamera.
  5. Kamera: Wählen Sie eine geeignete Kamera aus, um die räumlicheAuflösung, Empfindlichkeit und Geräuschanforderungen des Experiments zu erreichen (dieses System nutzte eine hochempfindliche sCMOS-Kamera).

2. Akquisitionssoftware

  1. Wählen Sie ein Softwarepaket aus, das eine unabhängige Steuerung jeder Hardwarekomponente ermöglicht, z. B. Micro-Manager.
    1. Erstellen der Konfigurationsdatei: Die Konfigurationsdatei ist ein gespeicherter Satz von Instrumenten und Anweisungen, die Micro-Manager für den Betrieb der Systemhardware lädt. Um eine Konfigurationsdatei zu erstellen, klicken Sie auf Extras > Hardwarekonfigurations-Assistent.
      1. Klicken Sie in Schritt 1 auf Neue Konfiguration erstellen > Weiter, um fortzufahren. Beachten Sie, dass der Benutzer die vorhandene Konfiguration ändern oder untersuchen kann, wenn eine bereits verfügbar ist.
      2. Durchsuchen Sie in Schritt 2 die Liste Verfügbare Geräte, um die Geräte zu finden, die über Micro-Manager gesteuert werden sollen, z. B. Mikroskop, Lampe, Bühne, Verschluss und Kamera. Wenn diese Taste hervorgehoben ist, klicken Sie auf die... , um das Gerät zur Liste der installierten Geräte hinzuzufügen. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet.
        1. Legen Sie die Bezeichnung des Geräts im Feld Label fest. (z.B. sCMOS-Kamera)
        2. Wählen Sie unter Wertden entsprechenden COM-Port für jedes Gerät aus. Dadurch wird eine Liste der Geräteeigenschaften am unteren Rand des Fensters angezeigt.
        3. Belassen Sie die Geräteeigenschaften bei den Standardeinstellungen. Beachten Sie, dass benutzerdefinierte Werte für jede Geräteeigenschaft wie gewünscht eingegeben werden können.
        4. Wenn jedes Gerät hinzugefügt wird, klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter, um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Beachten Sie, dass die Konfigurationsdatei, wenn Geräte nicht mehr oder geändert werden müssen, später geändert werden kann, wie in Schritt 2.1.1.1 beschrieben.
      3. Verwenden Sie in Schritt 3 die Dropdown-Menüs, um die Standardkamera, den Auslöser und die Fokusstufe auszuwählen. Wenn Auto-Shutter gewünscht wird, klicken Sie auf das Kontrollkästchen unter der Dropdown-Liste der Fokusstufe. Wenn die Fokusrichtung der Z-Stufe bekannt ist, wählen Sie sie aus der Dropdown-Liste unter Stage focus directions (advanced)aus. Andernfalls belassen Sie den Standardwert als Unbekannt.
      4. Doppelklicken Sie in Schritt 4 auf die Felder unter der Überschrift Verzögerung [ms], um Verzögerungen im Zusammenhang mit den automatisierten Geräten festzulegen, z. B. Verzögerungen von 100 ms für Lampe, Bühne und Verschluss und eine Verzögerung von 250 ms für Befehle an die mechanische Abstimmungsbaugruppe, um die mechanische Schaltzeit zwischen Filtern.
      5. Weisen Sie in Schritt 5 Beschriftungen für die Statusgeräte zu. Die Konfiguration für das Anregungs-Scanning-Mikroskopsystem verwendet Etiketten im Filterblock, um jeden Fluoreszenzfilterwürfel zu identifizieren (z.B. entspricht Zustand 0 der Bezeichnung Bright, dem leeren Filterwürfel, der bei der Lichtfeld-Bildgebung verwendet wird; während Zustand 3 entspricht dem Etikett 495 nm und dem kundenspezifischen 495 nm dichroitischen Filterwürfel, der zur Trennung von Anregungs- und Emissionslicht bei 495 nm verwendet wird. Etiketten werden auch in der mechanischen Stimmeinheit verwendet, um die Schaltbefehle für jede Anregungswellenlänge zu speichern (z.B. entspricht Zustand 0 dem 340 nm Anregungswellenlängenabstimmungsbefehl für die mechanische Stimmeinheit).
      6. Klicken Sie in Schritt 6 auf die Schaltfläche Durchsuchen neben dem Feld Konfigurationsdatei, um einen Speicherort und Dateinamen für die Konfigurationsdatei auszuwählen. Klicken Sie auf Fertig stellen, um die Konfigurationsdatei zu speichern.
    2. Startgruppen und Voreinstellungen: Micro-Manager kann verschiedene Gruppen in jeder Konfigurationsdatei speichern, um eine Teilmenge der Hardware zu aktivieren oder zu ändern. Beispielsweise werden in einer Gruppe "Systemstart" und einer voreingestellten Kombination Standardeinstellungen wie Binning-Größe und Ausleseraten für die Kamera gespeichert.
      1. Erstellen Sie eine Gruppe (z. B. System), indem Sie im Hauptfenster im Unterabschnitt Gruppe auf + klicken.
      2. Überprüfen Sie jede Verwendung in Gruppe? Innerhalb der Gruppe, für die ein Standardwert festgelegt werden muss (z. B. Binning in der zugehörigen Standardkamera).
      3. Erstellen Sie eine neue Voreinstellung (z. B. "Start"), indem Sie im Hauptfenster im Unterabschnitt Voreinstellung auf + klicken.
      4. Jedes In Schritt 2 aktivierte Kontrollkästchen wird hier als voreingestellte Option angezeigt. Wählen Sie einen Standardwert aus, der für jedes kontrollkästchen geladen werden soll.
    3. Gruppe und Presets für Anregungswellenlängen: Micro-Manager behandelt jede Anregungswellenlänge als eigenen Kanal mit eigenem Wellenlängenschaltbefehl; Daher muss jeder als seine eigene Voreinstellung gespeichert werden.
      1. Erstellen Sie eine neue Gruppe, die einen Satz gewünschter Anregungswellenlängen enthält (z. B. "495 nm dichroic")
      2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Verwenden in Gruppe? mit dem Namen Label, das dem VF-5-Gerät entspricht.
      3. Erstellen Sie eine neue Voreinstellung, die für jede Anregungswellenlänge benannt ist (z. B. "340 nm").
      4. Weisen Sie jeder Voreinstellung den entsprechenden Eigenschaftsnamen und voreingestellten Wert zu (z. B. Eigenschaftsname: "Label"; voreingestellter Wert: "340 nm").
    4. Mehrdimensionales Erfassungstool: klicken Sie aufMulti-D Acq.in der Nähe der oberen linken Seite des Micro-Manager-Fensters, um ein anpassbares Werkzeug zu öffnen, das zum Erfassen eines Bildes der Probe bei jeder Anregungswellenlänge mit einem Klick auf eine einzelne Schaltfläche verwendet werden kann. Es gibt mehrere Anpassungsoptionen, um die Erfassung genau wie gewünscht zu konstruieren.
      1. Zeitpunkte (in diesem Beispiel nicht verwendet): Lassen Sie das Kontrollkästchen für Studien ohne Zeitrafferkomponente deaktiviert. Wenn Zeitrafferstudien gewünscht werden, aktivieren Sie dieses Kontrollkästchen. Wenn diese Option aktiviert ist, geben Sie die Anzahl der Einstellungen für die Ausführung der restlichen Erfassungseinstellungen in das Feld Nummer ein. Legen Sie die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Erfassungen fest, indem Sie die Dauer in das Feld Intervall eingeben, und wählen Sie die richtige Einheit (Millisekunden, Sekunden oder Minuten; in der Regel Sekunden).
      2. Mehrere Positionen (XY; in diesem Beispiel nicht verwendet): Lassen Sie das Kästchen für Studien einer einzelnen XY-Position deaktiviert. Wenn mehrere XY-Positionen gewünscht werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Position bearbeiten, um ein separates Fenster zu öffnen. Verschieben Sie die Bühne an jede gewünschte Position, und klicken Sie auf die Schaltfläche Markieren, um diese Position in der Software zu speichern. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle gewünschten XY-Positionen markiert sind. Schließen Sie dieses Fenster, um fortzufahren.
      3. Z-Stacks (Folien; in diesem Beispiel nicht verwendet): Lassen Sie das Kästchen für Studien einer einzelnen Z-Position unaktiviert. Wenn mehrere Z-Positionen gewünscht werden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen. Bewegen Sie die Bühne in die gewünschte Anfangs-Z-Position und klicken Sie auf die Schaltfläche Set neben dem Z-Start-Feld. Bewegen Sie die Bühne in die gewünschte End-Z-Position, und klicken Sie auf die Schaltfläche Festlegen neben dem Z-Ende-Feld. Geben Sie die gewünschte Schrittgröße (in Mikrometern) in das Feld Z-Schritt ein.
      4. Kanäle: Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Kanäle aktiviert ist. Hier sind Kanäle die Namen, die den einzelnen Anregungswellenlängen gegeben werden. Die verfügbaren "Kanäle" entsprechen den in den Schritten 2.1.2 und 2.1.3 beschriebenen "Gruppen".
        1. Gruppe: Klicken Sie auf die Dropdown-Liste, um eine Gruppe auszuwählen, aus der verfügbare Anregungswellenlängen ausgewählt werden sollen (z. B. 495 nm dichroitische).
        2. Klicken Sie auf das Feld Shutter öffnen halten, um den Verschluss zwischen den Erfassungen für jeden Kanal offen zu halten. Beachten Sie, dass sich der Verschluss zwischen aufeinanderfolgenden Spektralscans immer noch schließt, wenn dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, vorausgesetzt, die Autoshutter-Option ist auch im Hauptfenster ausgewählt.
      5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neu, um Kanäle zur Erfassungsliste hinzuzufügen. Beachten Sie, dass die Schaltfläche Entfernen verwendet werden kann, um nicht mehr erwünschte Kanäle zu entfernen, und dass Nach oben und unten verwendet werden kann, um einen ausgewählten Kanal neu anzuordnen.
        1. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Verwenden? für jede gewünschte Wellenlänge im Spektralscan aktiviert ist.
        2. Konfiguration: Klicken Sie auf die Dropdown-Liste unter Konfiguration und wählen Sie die erste Wellenlänge im gewünschten Spektralbereich (z. B. 340 nm).
        3. Belichtung: Doppelklicken Sie auf das Feld unter Belichtung und geben Sie die gewünschte Belichtungszeit für die gewählte Wellenlänge ein (z. B. "100" für 100 ms). Unter Abschnitt 5 ("Datenerfassung") finden Sie Vorschläge zur Auswahl geeigneter Belichtungszeiten.
        4. Z-Offset (gilt nicht bei einem Spektralscan): Lassen Sie dieses Feld leer (bei 0), wenn Sie einen Spektralscan durchführen.
        5. Z-Stack: Stellen Sie sicher, dass dieses Kontrollkästchen für jede Wellenlänge im Spektralbereich aktiviert ist, wenn Sie einen Z-Stack ausführen.
        6. Fr. überspringen (gilt nicht bei einem Spektralscan): Lassen Sie dieses Feld leer (bei 0), wenn Sie einen Spektralscan durchführen. Beachten Sie, dass es nützlich sein kann, Frames selektiv zu überspringen, falls eine oder wenige Anregungswellenlängen deutlich stärker sind als andere oder wenn sich einzelne Anregungswellenlängen als besonders phototoxisch erweisen.
        7. Farbe: Lassen Sie dieses Feld leer, wenn Sie einen Spektralscan durchführen. Beachten Sie, dass Farben für einzelne Wellenlängenbänder für Datenvisualisierungszwecke ausgewählt werden können, die Farbe jedoch für das nachfolgende Spektral-Unmixen ungeeignet ist.
        8. Wiederholen Sie diese Schritte, bis jede gewünschte Anregungswellenlänge innerhalb des angegebenen Spektralscanbereichs hinzugefügt wird.
      6. Akquiseauftrag: Klicken Sie auf die Dropdown-Liste, um auszuwählen, in welcher Reihenfolge die oben genannten Optionen (2.1.4.1-2.1.4.5) ausgeführt werden. Bei Spektralscans, wie hier gezeigt, ist der Erfassungsauftrag einfach Kanal. Beachten Sie, dass zusätzliche Optionen angezeigt werden, wenn zusätzliche Kontrollkästchen im Werkzeug Multidimensionale Erfassung aktiviert sind [Zeitpunkte, mehrere Positionen (XY) und Z-Stacks (Slices)] und die Wahl der Position oder der Zeit zuerst ermöglicht, gefolgt von einem Slice oder bett.
      7. Autofokus (in diesem Beispiel nicht verwendet): Wenn mehrere Positionen (XY) ausgewählt sind, stehen verschiedene Stile der Autofokussierung zur Verfügung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Optionen, und wählen Sie eine Autofokus-Methode aus der Dropdown-Liste neben der Schaltfläche Schließen aus.
      8. Zusammenfassung: Überprüfen Sie dieses Fenster auf eine Zusammenfassung der Anzahl der Zeitpunkte, XY-Positionen, Z-Slices, Kanäle, Gesamtzahl der Bilder, Gesamtspeicher, Scandauer und Erfassungsreihenfolge, um sicherzustellen, dass die aufgeführten Informationen den erwarteten Erfassungseinstellungen entsprechen.
      9. Bilder speichern: Stellen Sie sicher, dass dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, um die gesammelten Daten mithilfe des Werkzeugs Multi-Dimensional Acquisition zu speichern.
        1. Klicken Sie auf die ... Schaltfläche neben Verzeichnisstamm, um einen Verzeichnisstamm auszuwählen, in dem die Dateien gespeichert werden sollen. Benennen Sie den Verzeichnisstamm so, dass relevante Details des Experiments beschrieben werden (z. B. GCaMP Airway Smooth Muscle Cells).
        2. Geben Sie einen Namen in das Feld neben dem Präfix Name ein, das die aktuelle Bildaufnahme beschreibt (z. B. FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). Es ist ratsam, ein Namenspräfix zu erstellen, das das Sichtfeld und die Belichtungszeit sowie andere relevante Informationen wie das verwendete Objekt und den dichroitischen Filter identifiziert. Beachten Sie, dass der erste Image-Stack, der mit diesen Einstellungen aufgenommen wurde, mit "_1" nach dem Namenspräfix gespeichert wird. Jeder nachfolgende Stapel, der mit demselben Verzeichnisstamm- und Namenspräfix aufgenommen wurde, wird mit "_n" gespeichert, wobei "n" die Häufigkeit ist, mit der ein Stack mit diesem Namen im Verzeichnis aufgenommen wurde.
        3. Klicken Sie auf Bilddateien trennen, um sicherzustellen, dass das bei jeder Anregungswellenlänge generierte Bild gespeichert wird.
      10. Speichern unter: Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern unter... in der rechten oberen Form des Multi-Dimensional Acquisition-Tools, um diese Erfassungseinstellungen für eine einfache zukünftige Verwendung zu speichern. Beachten Sie, dass auch die Verzeichnisstamm- und Namenspräfixe gespeichert werden.
      11. Erwerben: schließlich klicken Sie auf die Acquire! , um mit dem Erfassen von Bildern gemäß den oben gewählten Aufnahmeeinstellungen zu beginnen.

3. Spektrale Reaktionskorrektur (optional):

  1. Die Spektralausgangskorrektur kann durchgeführt werden, um die spektrale Reaktion des Systems auf einen bekannten Standard zu kalibrieren, z. B. eine NIST-nachverfolgbare Lampe oder einen anderen NIST-nachverfolgbaren Standard oder ein anderes NIST-rückverfolgbares Gerät. Dieser Schritt ist besonders wichtig, wenn die Ergebnisse mit anderen spektralen Bildgebungsinstrumenten, Spektrometern oder zwischen verschiedenen Laboratorien verglichen werden. Dieser Prozess wurde bereits ausführlich berichtet21,23.
    1. Verwenden Sie ein Spektrometer, das auf eine NIST-nachverfolgbare Lichtquelle (z. B. LS-1-CAL-INT, Ocean Optics) oder einen anderen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert ist, um die spektroradiometrische Leistung der Beleuchtung zu erfassen, wie sie in der Probenphase gemessen wurde. Führen Sie eine separate Korrektur für jede Kombination aus Lichtquelleneinstellung, dichroitischem Spiegel und Objektiv durch. Verwenden Sie eine mit dem Spektrometer gekoppelte integrierende Kugel, um die Weitwinkelbeleuchtung vom Mikroskopobjektiv aus genau zu messen.
    2. Verwenden Sie eine Integrationsmethode, z. B. die Trapezregel, um die spektroradiometrischen Daten über beleuchtete Wellenlängen zu integrieren. Eine 40 nm Bandbreite für die Integration zentriert um die mittlere Wellenlänge ist ausreichend für die meisten Filter, die eine nenne Bandbreite zwischen 14-20 nm volle Breite bei halbmaximum (FWHM) haben. Der integrierte Wert stellt die Intensität der spektralen Beleuchtung bei jedem Anregungswellenlängenband dar.
    3. Zeichnen Sie die integrierte Intensität jedes Wellenlängenbandes als Funktion der Anregungszentrumswellenlänge, um eine Visualisierung des Spektralbeleuchtungsintensitätsprofils zu ermöglichen.
    4. Bestimmen Sie das Wellenlängenband mit der niedrigsten integrierten Intensität.
    5. Normalisieren Sie das Intensitätsprofil der spektralen Beleuchtung, indem Sie die niedrigste integrierte Intensität durch die integrierte Intensität jedes Wellenlängenbandes dividieren, um einen wellenlängenabhängigen Korrekturfaktor zu erzeugen.

4. Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie eine "leere" Probe vor (z. B. einen Glasdeckel in die Zellkammer legen und 1 ml Puffer hinzufügen). Dieser Puffer wurde zuvor24beschrieben.
  2. Bereiten Sie eine unbeschriftete Probe vor, um jede Proben-Autofluoreszenz zu bestimmen (z. B. einen Glasdeckel mit unbeschrifteten, glatten Muskelzellen der Atemwege25,26 in die Zellkammer legen und 1 ml Puffer hinzufügen).
  3. Bereiten Sie für jedes im Experiment verwendete Fluoreszenzetikett eine separate, einetikettierte Probe wie folgt vor:
    1. Fügen Sie verdünnte mitochondriale Etikett zu Puffer, um eine 100 nM Konzentration zu erreichen. Fügen Sie diesen Puffer dem Deckelschlupf hinzu, der glatte Muskelzellen der Atemwege enthält. 20 min bei 20-25 °C inkubieren. Bewegen Sie den Coverslip in die Zellenkammer und fügen Sie 1 ml Puffer hinzu. Beachten Sie, dass die optimale Konzentration des mitochondrialen Etiketts je nach Hersteller, zugehöriger Farbe und gewünschter Spezifität variiert.
    2. Bewegen Sie einen Coverslip mit atemwegsglatten Muskelzellen, die mit der GCaMP-Sonde27 transfiziert wurden, in die Zellkammer und fügen Sie 1 ml Puffer hinzu.
  4. Bereiten Sie eine oder mehrere Versuchsproben vor, die eine Mischung der gewünschten Fluoreszenzetiketten enthalten.
    1. Fügen Sie 1 ml Puffer (100 nM Konzentration mitochondriale Etikett) zu einem Deckschrutsch mit Atemwegsglatten Muskelzellen, die mit der GCaMP-Sonde transfiziert und inkubieren für 20 min bei 20-25 °C. Bewegen Sie den Coverslip in die Zellenkammer und fügen Sie 1 ml Puffer hinzu.

5. Datenerfassung:

  1. Prüfen Sie, ob der richtige dichroitische Strahlteiler (z. B. 495 nm dichroiischer Filterwürfel), objektiv (z. B. 60x Wasserobjektiv) und Kamera (sCMOS-Kamera) ausgewählt sind.
  2. Laden Sie das Sample auf die Bühne.
  3. Doppelklicken Sie auf das Feld neben Belichtung [ms] und geben Sie "100" ein, um die Belichtungszeit auf 100 ms einzustellen. Beachten Sie, dass die Belichtungszeit je nach Fluoreszenzintensität der Probe möglicherweise erhöht oder verringert werden muss.
  4. Wählen Sie 475 nm aus dem Dropdown-Menü des Micro-Manager-Hauptfensters für die erste Beispielanzeige aus. Beachten Sie, dass 475 nm möglicherweise nicht die optimale Wellenlänge für die Probenanzeige oder die Bestimmung ist, ob eine Übersättigung im gesamten Bildstapel auftritt.
  5. Klicken Sie auf Live, um das Beispiel anzuzeigen.
    1. Klicken Sie auf die Schaltfläche automatischer Intensitätsanzeigebereich Auto neben dem Histogramm am unteren Rand des Fensters, um die minimalen und maximalen Werte in aussagekräftige visuelle Bereiche zu bringen.
  6. Verwenden Sie die Fokusknöpfe des Mikroskops, um sich auf die Probe zu konzentrieren. Es ist oft nützlich, den Rand der Stichprobe zu finden, um bei der Fokussierung zu helfen. Das Beispiel wird fokussiert, wenn die Kanten-Features im Bild scharf erscheinen. Beachten Sie, dass es erforderlich sein kann, während der Fokussierung mehrmals auf die Auto-Schaltfläche zu klicken, um das Fluoreszenzbild anzuzeigen. Darüber hinaus können einige Benutzer es einfacher finden, sich auf die Probe zu konzentrieren, wenn sich das Mikroskop im Übertragungsmodus befindet.
    1. Wenn Sie sich im Übertragungsmodus aus Sicherheitsgründen fokussieren, stellen Sie zunächst sicher, dass die spektrale Lichtquelle kein Licht auf die Okulare überträgt, bevor Sie den Lichtpfad für die Transmissionsbildgebung anpassen. Beachten Sie auch, dass es kleine Abweichungen zwischen dem Fokus der Übertragung und Fluoreszenzbildern geben kann. Wenn ein akzeptabler Fokus erreicht wurde, konfigurieren Sie den Lichtpfad für die spektrale Fluoreszenzbildgebung neu.
  7. Klicken Sie auf den Multi-D Acq. oben links im Fenster, um das Werkzeug Multidimensional Acquisition zu öffnen (beschrieben und konfiguriert in Abschnitt 2).
  8. Wählen Sie einen geeigneten Spektralbereich für die spektrale Erfassung (z.B. 360-485 nm für den 495 nm dichroitischen Filter), indem Sie auf die Schaltfläche Laden... oben rechts im Werkzeugfenster Multi-Dimensional Acquisition klicken und zu den Anregungseinstellungen navigieren. zuvor gespeichert (in Schritt 2.1.4.10). Weitere Informationen zu geeigneten Spektralbereichen finden Sie in der Diskussion.
  9. Erfassen Sie ein Hintergrund-/Leerbild, das keine Fluoreszenzdaten enthält, die für die Hintergrund- und Rauschsubtraktion verwendet werden können. Dies kann mit einem leeren Beispiel (Schritt 4.1) oder durch Navigieren zu einem leeren Bereich einer experimentellen Probe durchgeführt werden. Wie in Schritt 5.6 beschrieben, wird dies am einfachsten erreicht, indem die Kante der Probe gefunden und dann so positioniert wird, dass die Kante innerhalb des Sichtfeldes zentriert ist.
    1. Sobald die Erfassungseinstellungen bestätigt wurden und ein Hintergrundbereich sichtbar ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Acquire!, um einen Spektralbildstapel zu erhalten, der Hintergrund und Rauschen enthält, der später für die Subtraktion verwendet werden soll. Es sei darauf hingewiesen, dass Proben wahrscheinlich eine intensivere Fluoreszenz afern vom Rand der Probe haben. Es kann ratsam sein, sich über die Probe zu bewegen, um die "hellsten" Bereiche zu finden und mehrere Testabbildstapel durchzuführen, um geeignete Erfassungszeiten zu bestimmen und Überbelichtung zu vermeiden.
  10. Nehmen Sie einen einzelnen Bildstapel auf einem Bereich der Probe, der eine intensive Fluoreszenz zu haben scheint, um sicherzustellen, dass keine Kombination von Wellenlängen und Belichtungszeiten zu einer Überbelichtung führen.
  11. Verwenden Sie ImageJ, um zu bestätigen, dass keine Wellenlängen überbelichtete Pixel enthalten.
    1. Klicken Sie in ImageJ auf Datei > Importieren > Bildsequenz, und navigieren Sie zu dem Ordner, der die spektralen Bilder enthält, die in Schritt 5.10 aufgenommen wurden. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet. Klicken Sie auf das Feld neben Anzahl der Bilder und geben Sie die Anzahl der Wellenlängen ein, die im Spektralscan enthalten sind (z. B. 26). Lassen Sie das Startbild und das Inkrement als "1". Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um fortzufahren.
    2. Drücken Sie M auf der Tastatur, um die Messfunktion von ImageJ zu nutzen. Stellen Sie sicher, dass die unter Max aufgeführte Nummer nicht die obere Erkennungsgrenze der Kamera ist (z. B. 65.535). Wiederholen Sie dies für jedes Bild im Spektralscan. Beachten Sie, dass die Erkennungsgrenze der Kamera von der Kamera selbst abhängt. Die obere Grenze wird oben rechts im Histogramm im Hauptfenster von MicroManager angezeigt. Alternativ kann die obere Grenze durch Öffnen eines Bildes in ImageJ und Navigieren zu Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrastbestimmt werden. Klicken Sie im resultierenden Popup-Fenster auf die Schaltfläche Festlegen, geben Sie einen zu großen Wert (z. B. 999.999) in das Leerzeichen neben Maximal angezeigter Wertein, und klicken Sie auf OK, um fortzufahren. Der im neuen Histogramm angezeigte Maximalwert sollte die obere Erkennungsgrenze der Kamera sein.
    3. Wenn Bilder die obere Erfassungsgrenze der Kamera enthielten (z. B. 65.535), passen Sie die Belichtungszeit des Spektralscans an, um sicherzustellen, dass das maximale Signal im gesamten Spektralbereich den Dynamikbereich der Kamera nicht überschreitet.
  12. Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus nicht beschrifteten Proben, um eine Autofluoreszenz zu bestimmen. Erfassen Sie den Scan für die nicht beschrifteten Proben mit einem identischen Wellenlängenbereich und Kameraeinstellungen wie den Rest des Experiments (z. B. 360-485 nm bei 100 ms pro Wellenlänge).
  13. Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus einbeschrifteten Samples, die als Spektralsteuerelemente zum Erstellen der Spektralbibliothek verwendet werden sollen. Führen Sie den Scan für jedes Etikett mit einem identischen Wellenlängenbereich, Belichtungszeit und Kameraeinstellungen durch. Beachten Sie, dass für einige Proben möglicherweise eine längere Erfassungszeit erforderlich ist, um eine genaue Erkennung von Etikettenspektrumen mit minimalem Geräuschbeitrag zu ermöglichen.
  14. Führen Sie Messungen an einer experimentellen Probe durch (z. B. glatte Muskelzellen der menschlichen Atemwege mit GCaMP-Sonde und mitochondrialem Etikett).
    1. Legen Sie einen Dia oder Einen Deckelzettel mit der Versuchsprobe auf das Mikroskop.
    2. Wählen Sie ein Sichtfeld mit entsprechend beschrifteten Gewebezellen aus.
    3. Erfassen Sie die Spektralbilddaten mit den gewünschten Erfassungseinstellungen, wie oben beschrieben.

6. Bildanalyse

  1. Korrigieren Sie Bilder auf eine flache spektrale Reaktion.
    1. Subtrahieren Sie das in Abschnitt 5.9 erhaltene Hintergrundspektrum und multiplizieren Sie es mit dem in Abschnitt 3.1.5 ermittelten Korrekturkoeffizienten. Dies kann mit einem einfachen MATLAB-Skript oder einer ImageJ-Routine erfolgen. Ein SUBtraktions-/Korrektur-MATLAB-Code (in diesem Beispiel verwendet) ist auf der Website der University of South Alabama Bioimaging Resources verfügbar.
      1. Laden Sie den Subtraktions-/Korrekturcode in MATLAB.
      2. Klicken Sie auf der Registerkarte EDITOR auf Ausführen. Dadurch wird ein neues Fenster mit einer Bsq-Korrekturschaltfläche geöffnet. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bsq-Korrektur, um ein anderes Fenster zu öffnen, das Optionen für Arbeitsverzeichnis, Hintergrunddatei, Korrekturfaktordatei und nicht korrigierten Tiff-Ordner enthält.
        1. Durchsuchen verwenden... Schaltfläche neben Working Directory, um den Dateipfad auszuwählen, in dem nachfolgende Fenster geöffnet werden. Navigieren Sie zu dem Ordner, der das gespeicherte Hintergrundspektrum enthält (im .dat-Format).
        2. Durchsuchen verwenden... Schaltfläche neben Hintergrunddatei (.dat), um das in Schritt 6.1.1.2.1 gewählte Verzeichnis zu öffnen und die gewünschte Hintergrunddatei (im .dat-Format) auszuwählen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen, um fortzufahren.
        3. Verwenden Sie die Schaltfläche Durchsuchen... neben Korrekturfaktor (.dat), um einen Korrekturfaktor auszuwählen. Das Verzeichnis für den Korrekturfaktor ist standardmäßig der Speicherort des übergeordneten MATLAB-Codes. Navigieren Sie ggf. zum Unterordner, der die Korrekturfaktordatei enthält (im .dat-Format). Markieren Sie die richtige Korrekturfaktordatei, und klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen, um fortzufahren.
        4. Verwenden Sie die Schaltfläche Durchsuchen... neben Uncorrected Tiff Folder, um das in Schritt 6.1.1.2.1 ausgewählte Verzeichnis zu öffnen und den Ordner für die Hintergrundsubtraktion und Bildkorrektur auszuwählen (dies ist in der Regel der Pos0-Ordner, der sofort den Rohformat enthält). Spektralbilder). Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen, um fortzufahren.
        5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Klicken für Spektralkorrektur. Nach Abschluss der Verarbeitung wird ein Fenster mit der Meldung "Bsq Correction Complete" geöffnet. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um fortzufahren. Die Korrekturbilder werden in einem neuen Ordner mit dem ursprünglichen rohen Spektralbildordner und einem zusätzlichen "_Corrected" (z.B. Pos0_Corrected) gespeichert.
  2. Generieren Sie die Spektralbibliothek. Mehrere Softwarepakete können verwendet werden, um Spektraldaten aus Bildern zu extrahieren, einschließlich ImageJ. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, normalisieren Sie jedes Endmitglied auf das Wellenlängenband mit der größten Intensität, indem Sie bestimmen, welches Wellenlängenband den intensivsten Wert hat, und die Messung bei jedem Wellenlängenband durch diesen Maximalwert dividieren. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass Ein-Label-Kontrollen, die in autofluoreszierenden Proben erzeugt werden, zusätzliche Modifikationen erfordern28,29,30,31,32. Siehe Schritt 6.2.4 und Diskussion für Details.
    1. Klicken Sie in ImageJ auf Datei > Importieren > Bildsequenz. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet. Navigieren Sie zu dem Ordner mit den korrigierten Spektralbildern. Doppelklicken Sie auf eine beliebige Bilddatei im Ordner, um ein neues Fenster zu öffnen. Klicken Sie auf das Feld neben Anzahl der Bilder und geben Sie die Anzahl der Wellenlängen ein, die im Spektralscan enthalten sind (z. B. 26). Lassen Sie das Startbild und das Inkrement als "1". Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um fortzufahren.
    2. Klicken Sie im ImageJ-Hauptfenster auf das Polygonauswahlsymbol, und verwenden Sie dann den Mauszeiger, indem Sie auf das Bild klicken, um ein Polygon um einen Bereich zu erstellen, der Fluoreszenzdaten enthält. Beachten Sie, dass es in der ursprünglichen Wellenlänge möglicherweise wenig bis gar keine Fluoreszenzdaten gibt. Navigieren Sie zu einem anderen Wellenlängenbild und/oder verwenden Sie das Helligkeits-/Kontrastwerkzeug (Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast > Auto), um Bereiche mit fluoreszenzhaltigen Fluoreszenzdaten besser zu visualisieren.
    3. Wenn das Polygon gezeichnet ist, generieren Sie das Profil der Z-Achse, indem Sie auf Bild > Stapel > Z-Achsenprofilzeichnen klicken. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet. Klicken Sie auf Speichern, um die Spektraldaten als CSV-Datei zu speichern.
    4. Führen Sie eine Subtraktion durch, um eine korrekte Spektralbibliothek mit reinen Etiketten ohne Autofluoreszenzkontamination sicherzustellen. Verwenden Sie die folgende Gleichung29, um ein reines Spektrum aus der Mischung aus ein Etikett und Fluoreszenz zu isolieren:
      figure-protocol-1(1)
      Wo: Srein ist das reine Spektrum des Etiketts, Sgemischt ist das gemessene Spektrum der Mit Autofluoreszenz kontaminierten Probe, S autoFL ist das gemessene Autofluoreszenzspektrum, "a" ist ein Skalar Multiplikator des Autofluoreszenzspektrums (zwischen 0 und 1; z.B. 0,4) und "Offset" ist ein Offset (normalerweise 0). Variieren Sie den Begriff "a", bis ein Nahe Nullwert für den scheinbaren Beitrag der Autofluoreszenz erreicht wird. Weitere Informationen finden Sie in mehreren Veröffentlichungen28,29,30,31,32.
  3. Unmixen Sie die Spektralbilddaten. Der Unmixing-Schritt erzeugt für jedes Fluoreszenzetikett ein Häufigkeitsbild, wobei die Häufigkeit die Menge des relativen Fluoreszenzsignals im Bild vom jeweiligen Etikett ist. Für die Verwendung mit ImageJ33,34,35stehen mehrere Unmixing-Algorithmen zur Verfügung. Darüber hinaus ist ein spektrales Unmixing von MATLAB-Code (in diesem Beispiel verwendet) auf der Website der University of South Alabama Bioimaging Resources verfügbar. Einen umfassenderen Überblick über die Spektral-Unmixing finden Sie36.
    1. Laden Sie den spektralen Unmixing-Code in MATLAB.
    2. Bearbeiten Sie die Dateien Wavelength.mat und Library.mat, um den experimentellen Bedingungen (z. B. "Wavelength" als 360-485 in Schritten von fünf) zu entsprechen.
      HINWEIS: Die entsprechenden Werte für diese Wellenlängen sollten für jedes fluoreszierende Etikett (und die Autofluoreszenz) in "Bibliothek" geladen werden. Endmember_Name sollte die Beschriftungen in der gleichen Reihenfolge wie die Spaltenwerte von "Library" auflisten. Beachten Sie, dass die Datei Library.mat sowohl die Variablen "Library" als auch "Endmember_Name" enthalten sollte.
    3. Klicken Sie auf der Registerkarte EDITOR auf Ausführen. Dadurch wird ein neues Fenster geöffnet, in dem der Benutzer ein Verzeichnis auswählen kann. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die zu nicht gemischten Spektralbilder enthält. Nach der Auswahl wird dadurch ein neues Fenster geöffnet.
    4. Geben Sie in die resultierenden Rohlinge den Bildnamen (z.B. HASMC mit GCaMP und Mito FOV1), die Anzahl der Wellenlängenbänder (z.B. 26), die Anzahl der Zeitpunkte (z.B. 1) und ob eine FRET-Messung (z.B. n) in ihren jeweiligen Rohlingen gewünscht wird. Wenn "n" für FRET ausgewählt ist, lassen Sie beide End-Member-Leerzeichen leer. Drücken Sie OK, um fortzufahren, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird.
    5. Navigieren Sie in den Ordner, der die Datei Wavelength.mat enthält. Sobald sie ausgewählt ist, klicken Sie auf Öffnen, um fortzufahren, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird.
    6. Navigieren Sie zu dem Ordner, der die Datei Library.mat enthält. Sobald Sie die Option Ausgewählt haben, klicken Sie auf Öffnen, um fortzufahren, wodurch die nicht gemischten Bilder in einem neuen Ordner "Unmixed" im Verzeichnis mit den Spektralbildern gespeichert werden.
  4. Prüfen Sie die ungemischten Spektralbilder auf Qualität.
    1. Öffnen Sie jedes ungemischte Bild, um die Verteilung reiner Komponenten visuell zu überprüfen.
      1. Vergleichen Sie die Größe des Fehlerbildes mit der der nicht gemischten Bilder (ähnlich wie in Schritt 5.11 kann dies über die Measurefunktion von ImageJ erfolgen). Wenn die Größe des Fehlerbildes in der Größe der ungemischten Überflussbilder ähnlich ist, ist es wahrscheinlich, dass es Signale in den Spektralbilddaten gibt, die nicht genau durch die Spektralbibliothek und den linearen spektralen Unmixprozess berücksichtigt werden.
      2. Vergleichen Sie das Fehlerbild mit den nicht gemischten Bildern, um festzustellen, ob nicht identifizierte Reststrukturen vorhanden sind.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mehrere wichtige Schritte aus diesem Protokoll sind notwendig, um die Sammlung von Daten sicherzustellen, die sowohl genau als auch ohne Bildgebung und spektrale Artefakte sind. Das Überspringen dieser Schritte kann dazu führen, dass Daten signifikant erscheinen, aber nicht mit einem anderen spektralen Bildgebungssystem überprüft oder reproduziert werden können, wodurch alle Schlussfolgerungen, die mit diesen Daten gemacht wurden, effektiv zunichte gemacht werden. Zu diesen wichtigen Schr...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die optimale Nutzung einer hyperspektralen Bildgebung scannt mit der Konstruktion des Lichtweges. Insbesondere die Wahl der Lichtquelle, Filter (tunable und dichroic), Filter-Switching-Methode und Kamera bestimmen den verfügbaren Spektralbereich, mögliche Scangeschwindigkeit, Detektorempfindlichkeit und räumliche Probenahme. Quecksilberlichtbogenlampen bieten viele Anregungswellenlängenspitzen, bieten jedoch keinen flachen Spektralausgang und erfordern eine signifikante Signalreduktion an den Ausgangsspitzen, um die Spek...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drs. Leavesley und Rich geben finanzielles Interesse an einem Start-up-Unternehmen, SpectraCyte LLC, bekannt, das gegründet wurde, um die spektrale Bildgebungstechnologie zu kommerzialisieren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten die Unterstützung von NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 und dem Abraham Mitchell Cancer Research Fund würdigen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Glatte Muskelzellen der AtemwegeNational Disease Research Interchange (NDRI)Isoliert aus menschlichem Lungengewebe, gewonnen aus NDRIHochgradig autofluoreszierende, kalziumempfindliche Zellen
Automated ShutterThorlabs Inc.SHB1Fernsteuerbarer Verschluss zur Minimierung von Photobleaching
Automatisierter TischPrior Scientific H177P1T4Fernsteuerbarer Tisch für die automatische Aufnahme mehrerer Sichtfelder oder zusammengesetzter Bilder.
Automated Table Controller (XY)Prior ScientificProscan III (H31XYZE-US)Zur Anbindung des automatisierten Tisches an Computer und Joystick
PufferEigenhergestellt145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-Glucose, 1 mM MgCl2 und 1 mM CaCl2, bei pH 7,3
ZellkammerThermoFisher ScientificAttofluor-Zellkammer, A7816Deckglashalter aus chirurgischem Edelstahl und einem Gummi-O-Ring zur Abdichtung von Medien und zur Verhinderung von Proben- und/oder Objektivkontaminationen
AnregungsfilterSemrock Inc.TBP01-378/16Mittlerer Wellenlängenbereich (340-378 nm), Bandbreite (Minimum 16 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,88)
Semrock Inc.TBP01-402/16Mittlerer Wellenlängenbereich (360-400 nm), Bandbreite (Minimum 16 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,8)
Semrock Inc.TBP01-449/15Mittlerer Wellenlängenbereich (400-448,8 nm), Bandbreite (Minimum 15 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,8)
Semrock Inc.TBP01-501/15Mittlerer Wellenlängenbereich (448,8-501,5 nm), Bandbreite (Minimum 15 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,84)
Semrock Inc.TBP01-561/14Mittlerer Wellenlängenbereich (501,5-561 nm), Bandbreite (Minimum 14 nm, nominale FWHM 20 nm), Brechungsindex (1,83)
Fluoreszenzfilter Würfel dichroitischer StrahlteilerSemrock Inc.FF495-Di03Trennt Anregungs- und Emissionslicht bei 495 nm (>98 % Reflexion zwischen 350-488 nm, >93 % Transmission zwischen 502-950 nm), Filter Effektivindex (1,78)
Fluoreszenzfilter Würfel LangpassfilterSemrock Inc.FF01 496/LP-25Ermöglicht den Durchgang von Licht länger als 496 nm ( >93% durchschnittliche Transmission zwischen 503,2-1100 nm), Brechungsindex (1,86)
GCaMP SondeAddgen G-CaMP3; Plasmid #22692Ein genetisch kodierter Calcium-Indikator auf Basis einer einzigen Wellenlänge GCaMP2
Integrating SphereOcean OpticsFOIS-1Wird für die genaue Messung der Weitwinkelbeleuchtung
verwendet Inverses Fluoreszenzmikroskop Die inversenTE2000Nikon Instrumentsermöglichen die direkte Anregung der Probe, ohne dass Schichten von Medien und/oder Gewebe durchdrungen werden müssen.
Mitotracker GreenFM ThermoFisherScientific M7514Labels Mitochondrien
NIST-Traceable Calibration LampOcean OpticsLS-1-CAL-INTEine Lampe mit bekanntem Spektrum für den Einsatz als Standard
NIST-Traceable FluoresceinThermoFisher ScientificF36915Zur Überprüfung der angemessenen spektralen Empfindlichkeit des Systems
NucBlueThermoFisher ScientificR37605Markierung von Zellkernen
Objektiv (10X)Nikon InstrumentsPlan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105Nützlich für große Sichtfelder
Objektiv (20X)Nikon InstrumentsPlan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205Am häufigsten für Gewebeproben
verwendet Objektiv (60X)Nikon InstrumentsPlan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27Am häufigsten verwendet für Zellproben
sCMOS-KameraPhotometriePrime 95B (Rev A8-062802018)Zur Aufnahme hochempfindlicher digitaler Bilder
SpektrometerOcean OpticsQE65000Wird zur Messung der spektralen Ausgabe des Anregungs-Scanning-Spektralsystems verwendet
Abstimmbarer FilterwechslerSutter InstrumentLambda VF-5Motorisierte Einheit zur automatischen Abstimmung des Anregungsfilters/
schaltende Xenon-BogenlampeSunoptic TechnologiesTitan 300HP LichtquelleLichtquelle mit relativ gleichmäßiger spektraler Leistung
Mikroskope von

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
  2. Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901(2013).
  3. Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901(2014).
  4. Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802(2018).
  5. Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
  6. Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
  7. Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
  8. Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
  9. Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
  10. Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
  11. Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
  12. Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034(2018).
  13. Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
  14. Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
  15. Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
  16. Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
  17. Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
  18. Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
  19. Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518(2018).
  20. Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
  21. Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
  22. Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
  23. Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
  24. Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  25. Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
  26. Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
  27. Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
  28. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207(2005).
  29. Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
  30. Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601(2007).
  31. Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
  32. Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
  33. Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
  34. Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
  35. Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
  36. Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
  37. Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
  38. Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
  39. Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
  40. Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
  41. Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614(2014).
  42. Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017(2014).
  43. Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
  44. Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
  45. Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M(2019).
  46. Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B(2019).
  47. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
  48. Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

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