Wir präsentieren ein Protokoll für einen kolorimetrischen Test der Citratsynthase-Aktivität zur Quantifizierung intakter mitochondrialer Masse in Drosophila-Gewebehomogenaten.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein kolorimetrischer Test der Citrat-Synthase-Aktivität in Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondrien spielen die wichtigste Rolle im Zellstoffwechsel, indem sie ATP durch oxidative Phosphorylierung produzieren und eine Vielzahl von physiologischen Prozessen regulieren. Mitochondriale Dysfunktion ist eine primäre Ursache für eine Reihe von metabolischen und neurodegenerativen Erkrankungen. Intakte Mitochondrien sind entscheidend für ihr ordnungsgemäßes Funktionieren. Das Enzym Citratsynthase ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und kann somit als quantitativer Enzymmarker intakter mitochondrialer Masse verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass viele Moleküle und Wege, die wichtige Funktionen in Mitochondrien haben, sind stark zwischen Menschen und Drosophilakonserviert, und dass eine Reihe von leistungsfähigen genetischen Werkzeugen in Drosophilazur Verfügung stehen, Drosophila dient als ein gutes Modellsystem für die Untersuchung mitochondriale Funktion. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Messung der Citrat-Synthase-Aktivität in Gewebehomogenat von erwachsenen Fliegen, ohne Mitochondrien zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich auch zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Larven, kultivierten Zellen und Säugetiergeweben.
Einleitung
Mitochondrien sind am besten bekannt als die kraftproduzierenden Organellen in den meisten eukaryotischen Organismen, die die Energiewährung ATP durch den Tricarbonsäurezyklus (d.h. Krebs-Zyklus) und oxidative Phosphorylierung produzieren. Mitochondrien werden auch gefunden, um wichtige Rollen in vielen anderen physiologischen Prozessen zu spielen, wie Regulierung der Apoptose1, Ca2+ Homöostase2,3, reaktive Oxidation Spezies (ROS) Generation4, und endoplasmisches Retikulum (ER)-Stress-Antwort5. Mitochondriale Dysfunktion kann jedes Organ im Körper in jedem Alter beeinflussen und ist eine primäre Ursache für metabolische, Alterungs-bedingte6, und neurodegenerative Erkrankungen7. Intakte Mitochondrien sind mechanistisch mit der mitochondrialen Funktion verwandt. Daher ist eine korrekte Quantifizierung der intakten mitochondrialen Masse sehr wichtig für die Bewertung der mitochondrialen Funktion8. Citrat-Synthase, ein ratenbegrenzendes Enzym im ersten Schritt des Tricarbonsäurezyklus9, ist in der mitochondrialen Matrix innerhalb eukaryotischer Zellen lokalisiert und kann daher als quantitativer Marker für das Vorhandensein intakter mitochondrialer Masse9,10verwendet werden. Citrat-Synthase-Aktivität kann auch als Normalisierungsfaktor für intakte mitochondriale Proteine11,12verwendet werden.
Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der mitochondrialen Funktion, da viele Moleküle und Wege, die eine zentrale Rolle in Mitochondrien spielen, evolutionär von Drosophila bis zum Menschen konserviert werden13,14,15. Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Methode zur Messung der Citrat-Synthase-Aktivität durch einen kolorimetrischen Assay in Drosophila-Gewebehomogenaten 16 in einem 96-Well-Platten-Format vor. Im Citrat-Synthase-Aktivitätstest katalysiert Citrat-Synthase in Drosophila-Gewebehomogenat die Reaktion von Oxaloacetat mit Acetylcoenzym A (Acetyl CoA) zu dem Citrat CoA-SH und H+. CoA-SH reagiert anschließend mit 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) und erzeugt ein farbiges Produkt, 2-Nitro-5-Thiobenzoat (TNB), das bei 412 nm spektrophotometrisch leicht gemessen werden kann. Die Citrat-Synthase-Aktivität kann durch die Rate der Farbproduktion widergespiegelt werden.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Colorimetric Citrat Synthase Activity Assay für D. melanogaster16
- Sammeln Sie zehn erwachsene Fliegen für jede Probe. Sammeln Sie mindestens dreifache Proben für jeden Genotyp.
- Bereiten Sie 500 l eiskalten Extraktionspuffer mit 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA und 0,1% Triton X-100 in einem 1,5 ml Reagenzglas für jede Probe vor.
- Anästhesisieren Sie erwachsene Fliegen mit CO2 auf einem Anästhesiepad und isolieren Sie die gewünschten Gewebe. Um die erwachsenen Fliegenbrustzuale zu isolieren, zum Beispiel, fixieren Sie die Fliegenbrust durch ein Paar Zange, und dann isolieren Sie den Fliegenbauch, indem Sie entlang der Grenze des Thorax und Bauch mit einer Schere schneiden. Sammeln Sie die Fliegenbrustaxen für die Muskelcitrat-Synthase-Aktivität Assay.
HINWEIS: Bestimmen Sie das frische Gewicht des Gewebes in diesem Schritt, wenn Sie es verwenden, um die Citrat-Synthase-Aktivität zu normalisieren. - 10 erwachsene Fliegenthoraxes sofort auf 100 L eiskalten Extraktionspuffer übertragen und mit einem Stößel auf Eis homogenisieren. Um die Proben eiskalt zu halten, homogenisieren Sie die Proben für 5-10 s auf Eis, dann lassen Sie die Proben 5 s auf dem Eis sitzen und wiederholen Sie, bis alle Gewebe in der Röhre vollständig homogenisiert sind.
HINWEIS: Verkleben Sie das Rohr, überprüfen Sie die Homogenate, um sicherzustellen, dass sich keine Gerinnsel in den Homogenaten befinden und dass die Gewebe im Rohr vollständig homogenisiert sind. Alle Probenbehandlungen sollten auf Eis durchgeführt werden. - Nehmen Sie 10 l jeder homogenisierten Probe in einem neuen Rohr für die Messung des Proteingehalts. Bewahren Sie die Proben für die Proteinmessung auf Eis auf.
HINWEIS: Die Proteinproben können eingefroren und bei -80 °C für eine spätere Analyse gelagert werden. Die Proteinkonzentrationen dienen als interner Parameter für die Normalisierung der Citrat-Synthase-Aktivitäten. - Fügen Sie jeder verbleibenden Probe 400 l eiskalten Extraktionspuffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 500 l zu erzielen. Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 5x nach oben und unten pfeifen, wodurch Blasenbildung vermieden wird. Für jede Reaktion 1 l verdünntes Zelllysat zu 150 l der frisch zubereiteten Reaktionslösung (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM Acetyl-CoA, 1 mM Oxaloessigsäure) hinzufügen. Mischen Sie gründlich und sofort durch sanfte Pipettierung, Vermeidung von Blasenbildung. Messen Sie die Absorption bei 412 nm alle 10-30 s für 4 min bei 25 °C mit einem Plattenleser, der in der Lage ist, die Absorption bei 412 nm in minimalen Intervallen von 10 s zu messen.
HINWEIS: Ändern Sie die Spitze, bevor Sie ein anderes Reagenz pipetieren, und vermeiden Sie das Bilden von Blasen in den Brunnen. Eine unvollständige Vermischung der Reagenzien kann zu Abweichungen in den Messungen führen. Der Citrat-Synthase-Aktivitätstest sollte bei Raumtemperatur unmittelbar nach der Entnahme der Proben durchgeführt werden, da dieser Assay verwendet wird, um intakte mitochondriale Masse zu quantifizieren. Der Reaktionspuffer sollte unmittelbar vor Gebrauch vorbereitet und nicht gespeichert werden. - Plotdaten als optische Dichte (OD) Absorption (abs) (Y-Achse) im Vergleich zur Zeit (in Minuten) (X-Achse). Berechnen Sie dann die Steigung für den linearen Teil der Kurve, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit
Dividieren Sie den Wert durch die Probenproteinkonzentration, um die Citratsynthase-Aktivität zu normalisieren. Die Citrat-Synthase-Aktivität wird als
HINWEIS: Die Probenproteinkonzentration kann mit einem Proteinkonzentrations-Assay-Kit gemessen werden.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die kinetischen Kurven für die OD-Absorption bei 412 nm im Zeitverlauf, die mit hilfe des kolorimetrischen Assays der Citrat-Synthase-Aktivität zur Messung der Drosophila Thoraxgewebehomogenate verschiedener Genotypen erhalten wurden. Es ist allgemein bekannt, dass PGC-1a ein Master Regulator der mitochondrialen Biogenese ist. PGC-1 ist funktionell zwischen Drosophila und Menschen konserviert. Drosophil...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Metabolische Studien mit Drosophila als Modell müssen den genetischen Hintergrund, die Ernährung und die Bestandspflege der Fliegen berücksichtigen18. Um die Auswirkungen unterschiedlicher genetischer Hintergründe auf die Messung der Citrat-Synthase-Aktivität zu vermeiden, sollten verschiedene Stämme von Drosophila für 10 Generationen auf den Kontrollstamm zurückgekreuzt werden. Der genetische Hintergrund aller Drosophila-Stämme, die in unseren Experimenten verwendet wer...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31401013 und 31471010), der Wissenschafts- und Technologiekommission der Shanghai Municipality, shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (TRIZMA-Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxalacetat | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pelletstößel | Sangon | F619072 | |
| Pelletstößel | Motor Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plattenleser | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay Kit | Beyotime | P0010S | |
| Schere | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referenzen
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
