Wir präsentieren ein Protokoll für einen kolorimetrischen Test der Citratsynthase-Aktivität zur Quantifizierung intakter mitochondrialer Masse in Drosophila-Gewebehomogenaten.
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Methodenartikel
Ein kolorimetrischer Test der Citrat-Synthase-Aktivität in Drosophila Melanogaster
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondrien spielen die wichtigste Rolle im Zellstoffwechsel, indem sie ATP durch oxidative Phosphorylierung produzieren und eine Vielzahl von physiologischen Prozessen regulieren. Mitochondriale Dysfunktion ist eine primäre Ursache für eine Reihe von metabolischen und neurodegenerativen Erkrankungen. Intakte Mitochondrien sind entscheidend für ihr ordnungsgemäßes Funktionieren. Das Enzym Citratsynthase ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und kann somit als quantitativer Enzymmarker intakter mitochondrialer Masse verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass viele Moleküle und Wege, die wichtige Funktionen in Mitochondrien haben, sind stark zwischen Menschen und Drosophilakonserviert, und dass eine Reihe von leistungsfähigen genetischen Werkzeugen in Drosophilazur Verfügung stehen, Drosophila dient als ein gutes Modellsystem für die Untersuchung mitochondriale Funktion. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Messung der Citrat-Synthase-Aktivität in Gewebehomogenat von erwachsenen Fliegen, ohne Mitochondrien zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich auch zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Larven, kultivierten Zellen und Säugetiergeweben.
Einleitung
Mitochondrien sind am besten bekannt als die kraftproduzierenden Organellen in den meisten eukaryotischen Organismen, die die Energiewährung ATP durch den Tricarbonsäurezyklus (d.h. Krebs-Zyklus) und oxidative Phosphorylierung produzieren. Mitochondrien werden auch gefunden, um wichtige Rollen in vielen anderen physiologischen Prozessen zu spielen, wie Regulierung der Apoptose1, Ca2+ Homöostase2,3, reaktive Oxidation Spezies (ROS) Generation4, und endoplasmisches Retikulum (ER)-Stress-Antwort5. Mitochondriale Dysfunktion kann je....
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Protokoll
1. Colorimetric Citrat Synthase Activity Assay für D. melanogaster16
- Sammeln Sie zehn erwachsene Fliegen für jede Probe. Sammeln Sie mindestens dreifache Proben für jeden Genotyp.
- Bereiten Sie 500 l eiskalten Extraktionspuffer mit 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA und 0,1% Triton X-100 in einem 1,5 ml Reagenzglas für jede Probe vor.
- Anästhesisieren Sie erwachsene Fliegen mit CO2 auf einem Anästhesiepad und isolieren Sie die gewünschten Gewebe. Um die erwachsenen Fliegenbrustzuale zu isolieren, zum Beispiel, fixieren Sie die Fliegenbrust durch ein Paar Zange, und dann isolieren Sie den Fliegenbau....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die kinetischen Kurven für die OD-Absorption bei 412 nm im Zeitverlauf, die mit hilfe des kolorimetrischen Assays der Citrat-Synthase-Aktivität zur Messung der Drosophila Thoraxgewebehomogenate verschiedener Genotypen erhalten wurden. Es ist allgemein bekannt, dass PGC-1a ein Master Regulator der mitochondrialen Biogenese ist. PGC-1 ist funktionell zwischen Drosophila und Menschen konserviert. Drosophil.......
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Diskussion
Metabolische Studien mit Drosophila als Modell müssen den genetischen Hintergrund, die Ernährung und die Bestandspflege der Fliegen berücksichtigen18. Um die Auswirkungen unterschiedlicher genetischer Hintergründe auf die Messung der Citrat-Synthase-Aktivität zu vermeiden, sollten verschiedene Stämme von Drosophila für 10 Generationen auf den Kontrollstamm zurückgekreuzt werden. Der genetische Hintergrund aller Drosophila-Stämme, die in unseren Experimenten verwendet wer.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31401013 und 31471010), der Wissenschafts- und Technologiekommission der Shanghai Municipality, shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (TRIZMA-Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxalacetat | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pelletstößel | Sangon | F619072 | |
| Pelletstößel | Motor Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plattenleser | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay Kit | Beyotime | P0010S | |
| Schere | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
Referenzen
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
