Summary
يتيح اختبار التحليل متعدد الجوانب المتغيرة (MLVA) الذي تم عرضه هنا، نماذج جينية عالية الدقة وغير مكلفة وقوية ومحمولة للبكتيريا المسببة للأمراض في الرسينيا روكري. بدءا من الثقافات النقية، والقول باستخدام PCR متعددة والكهربائي الشعرية لإنتاج عشرة موضع MLVA ملامح لتطبيقات المصب.
Abstract
Yersinia ruckeri هو ممرض مهم من سمك السلمون المستزرع في جميع أنحاء العالم، ولكن لم تكن هناك أدوات بسيطة مناسبة للتحقيقات الحيوانية (تتبع العدوى، وما إلى ذلك) من هذه البكتيريا. ولذلك، تم تطوير اختبار تحليل متعدد الأرقام المتغيرة للتكرار جنبا إلى جنب (MLVA) كأداة يسهل الوصول إليها ولا لبس فيها للكتابة الجينية عالية الاستبانة للعزلات المستردة. لاختبار MLVA المعروضة هنا، يتم استخراج الحمض النووي من عينات المستزرعة Y. ruckeri عن طريق الخلايا البكتيرية المغلية في الماء، تليها استخدام supernatant كقالب لPCR. يتم توزيع أزواج التمهيدي التي تستهدف عشرة مواقع ذات عدد متغير من الأرقام المتداخلة (VNTR)، تتخللها جميع أنحاء جينوم Y. ruckeri، بالتساوي بين اثنين من ردود الفعل PCR خمسة بلبل تعمل في ظل ظروف ركوب الدراجات متطابقة. يتم وضع علامة التمهيديات إلى الأمام مع أي من الأصباغ الفلورية الثلاثة. بعد تأكيد amplicon بواسطة الكهربائي هلام، يتم تخفيف منتجات PCR وتخضع لالكهربائي الشعرية. من الملامح الكهربائي الناتجة، القمم التي تمثل كل من موضع VNTR تسمى الحجم وتستخدم لحساب VNTR تكرار التهم في silico. ثم يتم استخدام التشكيلات الجانبية MLVA المكونة من عشرة أرقام لإنشاء أشجار تمتد الحد الأدنى مما يتيح التقييم الحيواني عن طريق تحليل الكتلة. ويمكن مقارنة بيانات النواتج المحمولة للغاية، في شكل ملفات تعريف ية رقمية من نوع MLVA، بسرعة عبر المختبرات ووضعها في سياق زمني مبجّل. يمكن إكمال الإجراء بأكمله من المستعمرة المستزرعة إلى التقييم الحيواني للزوولوجيلمدة لمدة تصل إلى 48 Y. ruckeri isolates في غضون يوم عمل واحد.
Introduction
Yersinia ruckeri، وهي بكتيريا سلبية غرام وعضو في عائلة Yersiniaceae ، يسبب داء الرسيس في الأسماك السالمونية المستزرعة في جميع أنحاء العالم1. يتم تشخيصه بسهولة من الأسماك المصابة عن طريق الزراعة على أنواع كثيرة من وسائل الإعلام أجار، ولكن حتى وقت قريب، لم يكن معروفا إلا القليل فيما يتعلق بالهيكل السكاني وعلم الحيوان من Y. ruckeri في جميع أنحاء العالم وفي الموائل المختلفة (الأنواع المضيفة، وما إلى ذلك). إن نظم الأنماط المصلية القائمة لـ Y. ruckeri غير متسقة، وتفتقر إلى التوافق المتبادل، وتوفر دقة وبائية منخفضة. وقد أجريت بعض الدراسات الجزيئية على البكتيريا، وتستخدم تقنيات مثل متعدد اللولوس تسلسل الكتابة (MLST)، نبض المجال هلام الكهربائي (PFGE)أو تسلسل الجينوم الكامل (WGS) تحليل 2،3،4 ،5. ومع ذلك، MLST لا توفر دقة عالية بما فيه الكفاية لتتبع العدوى الروتينية، في حين PFGE هو العمل تطالب وتنتج النتائج التي ليست محمولة بسهولة عبر المختبرات. وفي حين أن تحليل الفريق العامل سيوفر حلا ً نهائياً تقريباً، فإن إنشاء وتنفيذ هذه التحليلات من شأنه أن يُحدد مسبقاً القدرات التقنية وقدرات المعلوماتية الأحيائية التي لا تزال مقصورة على عدد صغير نسبياً من المختبرات.
يمثل التحليل المتكرر للتكرار (MLVA) أداة كتابة جزيئية بسيطة يسهل الوصول إليها، والتي تقدم دقة وراثية في بعض الحالات مطابقة تقريباً لدقة تحليل WGS6و7. وتستند هذه التقنية إلى تكرار تباين الأرقام في موضع محدد من حيث الأرقام المتغيرة والمكررة (VNTR)، مما يؤدي إلى بيانات إخراج قابلة للنقل إلى حد كبير، مما يجعل المقارنة بين المعزولات الشخصية نحو قواعد البيانات عبر الإنترنت وعبر المختبرات مباشرة. على الرغم من أن MLST لا يزال المعيار الذهبي للكتابة الوبائية للعديد منمسببات الأمراض البكتيرية، وعدد متزايد من الدراسات تحديد قوة تمييزية أعلى بكثير من MLVA 8،9،10. كما تم نشر العديد من البروتوكولات التي تستهدف البكتيريا المسببة للأمراض السمكية، مثل فرانسيسيلا نوماتونينسيس، إدواردسيلا بيسكيدا ورينيباكتريوم سالمونيناروم11،12، 13.
بروتوكول MLVA عشرة loci المقدمة هنا، والتي شكلت مؤخرا الأساس لدراسة سكانية واسعة النطاق Y. ruckeri 14، ينطوي على استخراج الحمض النووي من المستعمرات المزروعة أجار، متعددة PCR والكهربائي الشعرية (CE)، تليها المصب في تطبيقات silico. وبالنسبة لكل عزل تم فحصه، يتم تشغيل اثنين من وحدات فينول الخماسي الكلور متعددة المضاعفات، وكلاهما يحتوي على خمسة أزواج أولية تحمل علامة فلورسنت (6FAM أو NED أو VIC) يستهدف كل منها مناطق VNTR فردية، بالتوازي في ظل ظروف متطابقة. بعد التحقق من amplicons PCR بواسطة الكهربائي هلام (GE)، يتم تخفيف منتجات PCR قبل تحليل CE، والقمم التي تمثل موضع VNTR المعنية هي الحجم يسمى من ملفات الكهربائي الناتجة. جنبا إلى جنب مع الصيغ الخاصة بالمكان التي تمثل الاختلافات الطفيفة، وتسلسل محددة في أنماط الهجرة CE، ثم يتم استخدام VNTR CE حجم المكالمات لحساب VNTR تكرار التهم التي يتم ربطها في ملامح MLVA من عشرة أرقام. وتستخدم هذه كمدخلات للتقييمات الحيوانية الحيوانية (على سبيل المثال، عن طريق تحليل الكتلة في الحد الأدنى من الامتداد شجرة (MST) الرسومات التخطيطية).
Protocol
تحذير: بالنسبة للبروتوكول بأكمله، من المستحسن إجراء جميع إجراءات المختبر الرطب بشكل معقمة باستخدام معاطف المختبر والقفازات التي يمكن التخلص منها والكواشف والمعدات المعقمة. ومن المستحسن أيضاً إعداد ردود فعل تفاعل PCR في غرفة منفصلة (ما قبل PCR) لا تستخدم لتضخيم و/أو مناولة منتجات PCR (ما بعد PCR). تخزين كافة الكواشف على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل عن الكواشف والمعدات والبرامج الحاسوبية المستخدمة.
1. الزراعة البكتيرية واستخراج الحمض النووي الجينومي
- زرع الثقافات النقية Y. ruckeri على أي نوع أجار مناسبة (استخدم المؤلفون 5٪ أجار الدم البقري) وحضانة في 22 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام، أو 15 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
- من كل لوحة أجار، اختيار مستعمرة تمثيلية واحدة مع حلقة التلقيح ونقل إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل التي تحتوي على 50 درجة مئوية من المياه فائقة النقاء. تعليق، دوامة لفترة وجيزة، وحضانة لمدة 7 دقائق على كتلة التدفئة في 100 درجة مئوية.
- الطرد المركزي في 16 000 × ز لمدة 3 دقائق واستخدام ماصة لنقل بعناية supernatant في أنبوب الطرد المركزي فارغة 1.5 مل. انتقل إلى الخطوة التالية باستخدام supernatant كقالب DNA أو تخزين في -20 درجة مئوية حتى ذلك الوقت.
2. تعدد السنوات PCR الإعداد وشروط ركوب الدراجات
ملاحظة: يجب أن يحتوي كل تفاعل متعدد الـ PCR (اثنان لكل Y. ruckeri isolate) على 12.5 ميكرولتر من مزيج رئيسيمن 2x PCR Plus، ومن 0.1 إلى 0.2 ميكرومتر لكل زوج التمهيدي المناسب (الجدول 1) و3 ميكرولتر من الحمض النووي للقالب، معدلًا إلى حجم تفاعل نهائي قدره 25 ميكرولتر بواسطة إضافة من المياه الخالية من RNase. تهدف إلى الحفاظ على التعرض للضوء من الفلورسنت المسمى إلى الأمام التمهيديات في الحد الأدنى (على سبيل المثال، عن طريق التفاف أنابيب التخزين الخاصة بهم في رقائق الألومنيوم).
- لكل من اختباري PCR المتعددين(الجدول 1)، قم بإعداد الخلطات الرئيسية كما هو موضح أعلاه (بدون قالب DNA) وفقًا لعدد العينات بالإضافة إلى عنصر تحكم إيجابي واحد وعنصر تحكم سلبي واحد. بالإضافة إلى ذلك، السماح حجم الفائض 10٪. دوامة سيد أعدت يمزج بلطف في سرعة منخفضة.
- توزيع 22 ميكرولتر من كل مزيج رئيسي بشكل منفصل في آبار فردية إما على شرائط PCR أو لوحات، حسب الاقتضاء لعدد العينات، وإضافة 3 ميكرولتر من القالب إلى كل بئر (للتحكم الإيجابي والسلبي، على التوالي، استخدم الحمض النووي من Y. ruckeri تم التحقق منه سلالة والمياه فائقة النقاء). ختم والطرد المركزي لفترة وجيزة.
- تشغيل جميع العينات على دورة حرارية PCR مع البرنامج التالي: '1' 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية (2) 30 دورة من 0.5 دقيقة عند 95 درجة مئوية، و1.5 دقيقة عند 60 درجة مئوية، و1 دقيقة عند 72 درجة مئوية، و(3) 60 دقيقة عند 68 درجة مئوية، تليها التبريد إلى 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. سيتم الانتهاء من البرنامج في أقل من 3 ح.
3. تأكيد AMPlicon PCR من قبل جل الكهربائي
- وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، وإعداد حجم من 1.5٪ (ث / الخامس) هلام أغاروز في 1X tris-borate-EDTA (TBE) العازلة المناسبة لعدد من ردود فعل PCR ليتم اختبارها. قبل الصب، إضافة 5 ميكرولتر من صبغ حمض نووي الفلورسنت لكل 50 ميكرولتر من محلول هلام ومزيج. استخدام الصواني والأمشاط حسب الاقتضاء للصب، وترك عدد مناسب من الآبار مجانا لسلالم مرجع الحمض النووي.
- بعد الإعداد، غمر الجل في 1X TBE-العازلة في نظام جنرال إلكتريك. مزيج 5 ميكرولتر من المنتج PCR جنبا إلى جنب مع 2 ميكرولتر من صبغ التحميل ونقلها إلى آبار هلام. إضافة 5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في الآبار الفارغة للرجوع إليها.
- تشغيل هلام في 110 V لكل 15 سم لمدة ساعة تقريبا واستخدام الأشعة فوق البنفسجية القائمة على هلام التصوير / نظام التصور للتحقق من وجود عدة (تصل إلى خمسة) العصابات التي تمثل amplicons PCR (انظر المثال في الشكل 1). تجاهل الجل. انتقل إلى الخطوة التالية أو قم بتخزين منتجات PCR المتبقية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى يتم إجراء المزيد من المعالجة.
4. إعداد الكتروفوريس الشعرية وشروط التشغيل
- بعد تأكيد amplicons PCR، تخفيف منتجات PCR 1:10 (V / v) في المياه النقية. ختم، مزيج والطرد المركزي لفترة وجيزة.
- العمل في خزانة الدخان، وإعداد حجم من مزيج الرئيسي تتكون من 9 ميكرولتر من الفورماميد و 0.5 ميكرولتر من حجم قياسي لكل منتج PCR (السماح حجم الفائض 10٪). دوامة لفترة وجيزة وتوزيع 9.5 ميكرولتر في الآبار على لوحة مناسبة لنظام CE المتاحة، قبل إضافة 0.5 ميكرولتر من المنتج PCR المخفف. ختم، مزيج والطرد المركزي لفترة وجيزة.
تحذير: التعامل مع بعناية. خلط الفورماميد مع الماء يولد حمض الفورميك، وهو أمر سام. - باستخدام دورة PCR الحرارية، تشويه العينات في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل التبريد إلى 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. الطرد المركزي لفترة وجيزة وتحميل لوحة على نظام CE معايرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- تشغيل تحليل الأجزاء CE باستخدام الكواشف حسب الاقتضاء للجهاز المفضل والإعدادات التالية: 60 درجة مئوية؛ 5 ق حقن في 1.6 كيلو فولت (32 V لكل سم)؛ 32 دقيقة وقت التشغيل في 15 كيلو فولت (300 V لكل سم). تحليل جزء CE من 24 بئرا على 24-الشعرية (50 سم) سوف يستغرق عادة ما يقرب من 50 دقيقة.
5. VNTR حجم الدعوة، تكرار حساب العد و ملفا التنميط
ملاحظة: الخطوة 5.1 يصف Y. ruckeri VNTR CE حجم الدعوة من ملفات الكهربائي، وذلك باستخدام البرامج المحددة المدرجة في جدول المواد. راجع دليل البرامج للحصول على تفاصيل إضافية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. لاستخدام برامج أخرى، راجع الأدلة المناسبة.
-
استيراد ملفات نتائج CE (اثنان لكل Y. عزل ruckeri). قم بتعيين طريقة التحليل إلى افتراضي الأقمار الصناعية الدقيقة وحدد اختيار المنتج المناسب ضمن معيار الحجم، قبل الضغط على الزر تحليل. تحقق من التعريف الصحيح للأجزاء القياسية الحجم من خلال "محرر مطابقة الحجم" وتصحيح أية عمليات تخصيص خاطئة بشكل واضح.
- بعد تحديد العينة (العينات) التي سيتم قراءتها، اضغط على الزر عرض المؤامرات واضغط على Ctrl+A لتمكين عرض جدول تغيير الحجم. أثناء وجودك في اللوحة العلوية، اضغط باستمرار على Ctrl أثناء النقر على القمم الخمس التي تمثل مكبرات صوت VNTR (استخدم أداة التكبير/التصغير حسب الحاجة).
ملاحظة: وبالنسبة لكل منتج من منتجات PCR المتعددة، سيظهر الرسم الكهربائي خمس قمم موزعة بين الأصباغ الثلاثة المستخدمة (انظر وضع العلامات على الصبغة 5 من المواد التمهيدية الأمامية في الجدول 1 والمثالين الواردين في الشكل2). - اضغط على Ctrl+G لتصفية جدول تغيير الحجم، مع عرض الخصائص فقط للقمم الخمس المميزة، واستدعاء حجم CE القياسي لكل موضع VNTR (مع الإشارة إلى الجدول 1)لتطبيق المصب.
- بعد تحديد العينة (العينات) التي سيتم قراءتها، اضغط على الزر عرض المؤامرات واضغط على Ctrl+A لتمكين عرض جدول تغيير الحجم. أثناء وجودك في اللوحة العلوية، اضغط باستمرار على Ctrl أثناء النقر على القمم الخمس التي تمثل مكبرات صوت VNTR (استخدم أداة التكبير/التصغير حسب الحاجة).
- من أجل حساب أنماط التنقل amplicon منحازة خلال CE، حساب دقيقة VNTR تكرار التهم وفقا للصيغة الواردة أدناه، وذلك باستخدام VNTR CE حجم المكالمات جنبا إلى جنب مع المتغيرات الخاصة بالموقع (انظر الجدول 1). وللكفاءة، من المستحسن أتمتة هذه العملية (على سبيل المثال، باستخدام قالب جدول بيانات).
- تكرار VNTR المحسوبة تقريب ًا يتم عده إلى أقرب عدد صحيح ووصل إلى سلاسل من عشرة أرقام، يمثل كل منها ملف تعريف MLVA لعزل Y. ruckeri واحد.
6. الحد الأدنى من تحليل كتلة شجرة الامتداد من بيانات MLVA
ملاحظة: تصف الخطوة 6 إنشاء رسومات تخطيطية لـ MST من بيانات Y. ruckeri MLVA، باستخدام البرامج المحددة المدرجة في جدول المواد. راجع دليل البرامج للحصول على تفاصيل إضافية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. لاستخدام برامج أخرى، راجع الأدلة المناسبة.
- إنشاء قاعدة بيانات جديدة واختيار لتنشيط البرنامج المساعد MLVA.
- استيراد ملفات تعريف Y. ruckeri MLVA وبيانات التعريف عن طريق تحديد بيانات نوع الحرف متبوعاً بحقول الاستيراد والأحرف (مزيد من التحديد الفرعي اعتماداً على تنسيق التخزين). عند المطالبة، حدد قواعد الاستيراد وفقًا لمحتوى ملف الاستيراد: في العمود نوع الوجهة، قم بتصنيف تكرار VNTR كقيمة حرف: VNTR، وبيانات التعريف المتنوعة كمعلومات إدخال: حقل معلومات الإدخال .
ملاحظة: للمقارنة والسياق، من الممكن أيضاً استيراد مجموعة البيانات المنشورة بالكامل (الوصول المفتوح) مع الورقة الأصلية التي تستخدم بروتوكول MLVAالحالي 14. تتوفر الملامح والبيانات الوصفية للـ MLVA على المجموعة المتنوعة من عزلات Y. ruckeri (n = 484) التي تم فحصها في تلك الدراسة من موادها التكميلية (الجدولان S1 وS2) من خلال الرابط التالي: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files - في لوحة نوع التجربة، افتح إدخال VNTR وحدد القيم الدنيا والقصوى لكل موضع VNTR إلى 0 و 100على التوالي. ضمن الإعدادات العامة، قم بتعيين عدد الأرقام العشرية إلى 0 وحدد الأرقام ضمن نوع البيانات. تحقق من اعتبار القيم الغائبة صفر.
-
حدد العينات المستوردة الموجهة لتحليل نظام المجموعة MST وانقر فوق الزر إنشاء مقارنة جديدة (في لوحة المقارنة).
- إذا رغبت في العرض المرئي لـ MST، قم بتخصيص العينات للمجموعات الملونة (على سبيل المثال، وفقًا لسمة بيانات وصفية معينة) باستخدام الخيارات المختلفة المتوفرة في لوحة المجموعات.
ملاحظة: يمكن أيضًا إنشاء/تغيير المجموعات بأثر رجعي، بعد الخطوات التالية. - حدد تحليل نظام المجموعة المتقدم...
- مواصلة تعديل العرض المرئي لـ MST كما هو مفضل (على سبيل المثال، عن طريق إضافة معلمات التقسيم، ووضع العلامات على العقدة/الفروع، والروابط المتقاطعة، والأساطير، وما إلى ذلك). انظر المثال في الشكل 3.
ملاحظة: تم استخدام عتبة تقسيم الكتلة (مجمع clonal) من ≤ 4/10 غير متطابقة VNTR loci، بالإضافة إلى إخفاء اتصالات الفروع التي تمثل > 5/10 غير متطابقة VNTR loci، سابقا لتحليل الكتلة MST استنادا إلى بيانات MLVA التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول14. وشريطة استيراد مجموعة البيانات المذكورة أعلاه التي تضم 484 ملفاً من الملامح الخاصة بـ Y. ruckeri MLVA، يمكن أيضاً إدراج هذه العينات لتحليل مجموعات MST (على النحو المبين أعلاه) لتوفير سياق عالمي وتاريخي. ومن شأن ذلك، على سبيل المثال، أن ييسر تحديد أي عينات مرتبطة بمجمعات كلونية سبق وصفها، فضلا عن العينات التي تمثل سلالات لم توصف بعد. وتبعاً للبيانات الوصفية المتاحة، يمكن فحص الرسم التخطيطي لـ MST الناتج بطرق مختلفة، مثل اكتشاف أنماط التجميع المحتملة المرتبطة بسمات معينة (الجغرافيا، والمضيف، والوقت، وما إلى ذلك). - إذا لزم الأمر، قم بتصدير MST النهائي في التنسيق المطلوب باستخدام تحديد تصدير الصورة.
- إذا رغبت في العرض المرئي لـ MST، قم بتخصيص العينات للمجموعات الملونة (على سبيل المثال، وفقًا لسمة بيانات وصفية معينة) باستخدام الخيارات المختلفة المتوفرة في لوحة المجموعات.
Representative Results
بعد تعدد PCR كما هو موضح هنا، تظهر صورة جنرال إلكتريك النموذجية التي تتحقق من وجود أمبليكون متعددة من كل تفاعل PCR في الشكل 1. تحليل جزء CE المصب التي أجريت على منتجات PCR التحقق منها سوف يؤدي، لكل Y. ruckeri عزل فحصها، فياثنين من ملفات الكهربائي المستخدمة لحجم الدعوة من موضع VNTR المعنية (الشكل 2). من تحليل 484 عزل ة ر. روكر، لم يلاحظ أي تداخل في نطاق حجم amplicon بين موقع VNTR المسمى بنفس الصبغة في نفس التفاعل المتعدد (الجدول1)14. ولذلك، يمكن تحديد كل من القمم الكهروبورتيكية بشكل لا لبس فيه حسب اللون.
بعد استيراد ملفات MLVA والبيانات الوصفية ذات الصلة إلى البرمجيات المفضلة، يمكن إنشاء الرسوم البيانية MST على النحو الموصوف للتدقيق في أي أنماط وبائية من الفائدة على المواد. راجع الأدلة المناسبة للحصول على الخيارات الإضافية المتوفرة في البرنامج المعني. وعلى سبيل المثال، يبين الشكل 3 المقارنة بين MST وملامح MLVA لـ Y. ruckeri isolates المستردة من الأسماك المرتبطة بخمس مزارع مختلفة لسمك السلمون في النرويج.
وقد تم التحقق من أحجام تكرار متسقة من الموضع VNTR عشرة، فضلا عن استقرارها في المختبر وفي الجسم الحي، في الدراسة الأصلية على أساس هذا البروتوكول14. وباختصار، تم ذلك باستخدام تسلسل سانجر (حجم التكرار)، وعن طريق كتابة MLVA من عزلات متعددة بعد الممرات التسلسلية (في المختبر) ومن داخل تفشي الأمراض الفردية (في الجسم الحي). وعلاوة على ذلك، تم فحص الاستقرار البيئي للمكان مع مرور الوقت من خلال كتابة العديد من "سلالة المنزل" التي تم استردادها على مدى عدة سنوات من مواقع إنتاج المياه العذبة المصابة باستمرار لسمك السلمون الأطلسي.
الشكل 1 جل الكهربائي التحقق من وجود منتجات PCR متعددة. وتؤكد الصورة وجود العديد من الأمبيرPCR في جميع الممرات 12 التي تحتوي على عينات، مع الممر الأول الذي يمثل سلم الحمض النووي المستخدمة. وقد أشير إلى أحجام شظايا سلم مختارة، وكذلك التصنيف والإجهاد PCR (انظر الجدول S1 في Gulla et al. 201814)انتساب كل حارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 المخططات الكهروبية التي تظهر القمم المقابلة لـ VNTR amplicons. يشار إلى أسماء من المختلفة [فنتر] [لوك], مع صبغ تسميات ([فيك] =اللون الأخضر; NED = أسود; 6FAM = الأزرق) بين قوسين. اثنين من التهروسترول (PCR تحليل 1 أعلى; PCR اختبار 2 أسفل) تنشأ من كتابة واحد Y. روكر عزل. قمم البرتقال (صبغ LIZ) تمثل حجم القياسية المستخدمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 مثال الحد الأدنى لشجرة تمتد للتقييم الوبائي. ويستند الرسم البياني إلى ملامح MLVA من Y. ruckeri عزل اتُشأ من سمك السلمون الأطلسي في خمس مزارع نرويجية مختلفة (1-5؛ انظر الأسطورة) التي تعاني من فاشيات اليرينيوسيس المتكررة. ويمكن ملاحظة اتجاه تجميعي واضح مرتبط بأصل المزرعة. تُظهر الروابط المتقاطعة جميع الاتصالات الممكنة التي تنطوي على موقع VNTR غير متطابق (انظر الأسطورة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : تخطيط البُرّه تصور تلعثم وتقسيم القمم. في هذه الحالة، يحدث كلاهما في وقت واحد، وهو ليس هو الحال دائماً. الذروة أطول وأطول، التي تمثل TR 1070 VNTR موضع، يمكن تمييزها بسهولة. يتم تكبير العرض ويظهر فقط قمم صبغ الأزرق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: خصائص المركز VNTR. الخصائص ذات الصلة للمناطق العشر ة من Y. ruckeri VNTR المستهدفة في بروتوكول MLVA الحالي.
Discussion
وقد بدت كل من الـ PCRs المتعددة المعروضة هنا قوية نسبياً في مواجهة رداءة نوعية الحمض النووي القالب، ولكن لوحظ عدم تضخيم PCR في بعض الأحيان عند استخدام قوالب ذات تركيزات عالية للغاية من الحمض النووي. وقد تم حل هذه المسائل بسهولة عن طريق تخفيف القوالب قبل PCR. ويمكن أيضاً استخدام أساليب أخرى لاستخراج الحمض النووي غير تلك المستخدمة هنا (مثل المجموعات التجارية).
على الرغم من أنه من المتوقع خمسة amplicons من كل رد فعل PCR متعددة، لا ينبغي دائماً توقع خمسة نطاقات مميزة بصرياً من جنرال إلكتريك، كما أن بعض (وصفت بشكل مختلف) VNTR loci داخل نفس رد الفعل لها نطاقات حجم متداخلة. ويمكن تقصير وقت تمديد PCR النهائي من 60 دقيقة إذا لزم الأمر، ولكن من المرجح أن يؤدي إلى زيادة حدوث القمم الانقسام في المخططات الكهربائية CE اللاحقة (انظر أدناه). وتجدر الإشارة إلى أن الغرض من خطوة جنرال إلكتريك هو فقط للتحقق النوعي من amplicons PCR، يمكن تعديل وقت التشغيل والجهد و / أو وصفة هلام كما هو مفضل. وإذا لاحظت جنرال إلكتريك نطاقات ضعيفة بوجه خاص، فقد يكون من المستصوب تقليل عامل التخفيف من تلك العينات قبل CE.
في حين تم تشغيل بروتوكول CE الموضح هنا على جهاز كهربائي شعري تجاري محدد (انظر جدولالمواد)، قد يكون لأنظمة CE مختلفة متطلبات عينة مختلفة، والتي قد تؤدي بدورها إلى إدخال بعض التعديلات على البروتوكول . راجع دليل الشركة المصنعة لنظام CE المعنية للحصول على تعليمات حول الكواشف المناسبة / المعدات، والمعايرة وما إلى ذلك لتحليل الأجزاء. وهناك أيضا احتمال أن أنماط التنقل amplicon منحازة لوحظ خلال CE قد تختلف, نسبيا, عبر أنظمة CE و / أو الآلات, كما تم توثيقها سابقا لبروتوكولات MLVA الأخرى15,16. إذا حدث إلى حد حيث يتم تأثر عمليات تكرار VNTR النهائية (تقريبًا)، فهذا يعني أنه يجب إعادة معايرة المتغيرات الخاصة بالموقع s وi (الجدول1)،المستخدمة لتحديد عدد تكرار VNTR. وهذا ينطوي على الانحدار الخطي على المؤامرات مقارنة أحجام تسلسل دقيقة مقابل حجم CE المكالمات، كما هو موضح من قبل Gulla وآخرون 201814.
القمم المنقسمة وقمم التأتأة، وكلاهما من القطع الأثرية المعروفة في CE القائم MLVA كتابة17،يمكن ملاحظتها في تخطيط البهروهرخلال أثناء استدعاء الحجم (الشكل4). في حين ينبغي تجاهل قمم التأتأة، يجب اختيار الذروة الأطول باستمرار للتطبيقات المصب في حالة القمم المقسمة مفصولة بزوج أساسي واحد. وعلاوة على ذلك، فإن القمم الغائبة التي تشير إلى عدم وجود موضع VNTR معين نادرة، ولكن قد تحدث، وفي هذه الحالة ينبغي تعيين عدد مكرر من '0'. إذا كانت ثقافة البداية التي يتم استخراج الحمض النووي ليست نقية (أي، يحتوي على أكثر من نوع فرعي Y. ruckeri)، يمكن ملاحظة قمم طويلة متعددة المقابلة لأليليس مختلفة من نفس المكان / loci بعد CE. ثم يجب إجراء الزراعة الثانوية من مستعمرات واحدة قبل استخراج الحمض النووي الجديد لإعادة الكتابة.
كما هو مذكور في البروتوكول، يجب أن يتم استخراج الحمض النووي قالب لPCR افتراضيا من الثقافات النقية من Y. ruckeri. ومع ذلك، في حالات قليلة، تم بنجاح كتابة عينات سوائل البيض التي كانت إيجابية بالنسبة لـ Y. ruckeri بواسطة qPCR (Ct-values < 27) بشكل مباشر، دون زراعة مسبقة، باستخدام كمية متزايدة من الحمض النووي الجينومي (المستخرج ة مع مجموعة تجارية) كقالب. وعلى الرغم من أن هذا النهج لم يجر اختباره أو التحقق منه على نطاق واسع، فإنه يشير إلى إمكانية إجراء هذا الفحص من قبل الـ MLVA لفحص المصفوفات البيولوجية المعقدة التي تحتوي على الحمض النووي من مجموعة من الكائنات الحية المختلفة بالإضافة إلى Y. ruckeri.
يمكن إكمال إجراء الكتابة MLVA بأكمله المعروض هنا، من استخراج الحمض النووي إلى التقييم الحيواني، في يوم عمل واحد. ومع ذلك، فإن عدد العينات التي تم فحصها هو في علاقة دون خطية مع الوقت المطلوب لاستخراج الحمض النووي، PCR وCE، وبالتالي فإن الطريقة هي أكثر كفاءة من حيث الوقت عند تشغيل عينات متعددة في وقت واحد. ومع ذلك هذا هو الحال بالنسبة لمعظم الأساليب المستندة إلى المختبر، وكأداة للكتابة الفرعية الوبائية من Y. ruckeri،والجمع بين عالية الدقة والبساطة وقابلية النقل يجعل هذا الاختبار MLVA متفوقة على البروتوكولات المنشورة سابقا4 ،5. كما تم استخدامه للتحقق من الأهمية الوبائية المحدودة للY. ruckeri serotyping14.
من خلال دراسة سكانية شاملة قائمة على MLVA تشمل 484 Y. ruckeri عزل تعافى من مجموعة من الأصول والموائل spatiotime (الأسماك المضيفة، والبيئة، وما إلى ذلك)، فهمنا فيما يتعلق علم الحيوان والسكان تم زيادة هيكل هذا الممرض الأسماك الهامة إلى حد كبير14. ومكّنت كتابة الـ MLVA من تعقب الحيوانات المستنسخة التي تم نشرها عن طريق الإنسان البشري على مدى عقود، ويفترض أن يكون ذلك عن طريق نقل الأسماك، فضلا عن تحديد السلالات المحصورة محليا. وعلاوة على ذلك، في حين أن بعض المجمعات الكلونية للبكتيريا يمكن أن ترتبط بوضوح مع المرض على وجه الخصوص المضيفين الأسماك (سمك السلمون المرقط قوس قزح وسمك السلمون الأطلسي، على التوالي)، والبعض الآخر تم استردادها فقط من المصادر البيئية و / أو الأسماك غير المتأثرة سريريا العينات. وبالتالي، فإن تطبيق هذه الطريقة لا يقتصر على تتبع العدوى فحسب، حيث أنه قد يوفر أيضاً معلومات ذات صلة محتملة، مثل تطوير اللقاحات، وتقييم المخاطر، والحفاظ على الأمن البيولوجي الوطني. وهو يستخدم حاليا ً بشكل نشط في المعهد البيطري النرويجي كأداة للتحقيق في تشخيصات Y. ruckeri في تربية الأحياء المائية النرويجية.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من الصندوق النرويجي لبحوث المأكولات البحرية، FHF (المشروع رقم 901119 و901505). ونود أن نشكر جميع المساهمين في العزلات البكتيرية والعينات المستخدمة أثناء تطوير الأسلوب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22°C/15°C incubator | As preferred. | NA | |
| 5' Labeled Primer, 10K PMOL, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | 450007 | Sequences and labelling in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| Agarose, universal, peqGOLD | VWR | 732-2789P/732-2788 | Used during gel electrophoresis. |
| Avant 3500xL Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | A30469 | Used for capillary electrophoresis fragment analysis. |
| BioNumerics7 modules | Applied Maths | NA | Used for generating Minimum spanning trees from MLVA data. |
| Centrifuge(s) | As preferred. | NA | |
| Custom DNA Oligo, 25N, Desalted, Dry | Thermo Fisher Scientific | A15612 | Sequences in Table 1. Prepare working aliquouts in TE-buffer. |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Loading dye used during gel electrophoresis. |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Centrifuge tubes used during DNA extraction. |
| Freezer | As preferred. | NA | |
| Fume cupboard | As preferred. | NA | |
| Gel electrophoresis system | As preferred. | NA | |
| GelRed Nucleic Acid Stain, 10,000X in water | Biotium | 41003 | Fluorescent nucleic acid dye used during gel electrophoresis. |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | Used for reading electropherograms from capillary electrophoresis. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder, ready-to-use | Thermo Fisher Scientific | SM0373 | DNA ladder used during gel electrophoresis. |
| GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | Size standard used during capillary electrophoresis. |
| Heating block | As preferred. | NA | |
| Hi-Di Formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320/4440753 | Deionized formamide used during capillary electrophoresis. Prepare working aliquouts. |
| Milli-Q water | NA | NA | Purified water used during PCR and capillary electrophoresis. Standard recipe; produced in-house. |
| Multiplex PCR Plus Kit | Qiagen | 206151/206152 | |
| PCR thermal cycler | As preferred. | NA | |
| POP-7 Polymer for 3500 Dx/3500xL Dx Genetic Analyzers | Thermo Fisher Scientific | A26077/4393713/4393709 | Separation matrix used during capillary electrophoresis. |
| Pure culture Yersinia ruckeri | NA | NA | E.g. cryopreserved or fresh. |
| RNase-free water | Qiagen | NA | In: Multiplex PCR Plus Kit |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| Trypsine soy agar/bovine blood agar | NA | NA | Standard recipe; produced in-house. |
| UV-based gel imaging/visualisation system | As preferred. | NA | |
| Vortexer | As preferred. | NA |
References
- Barnes, A. C. Enteric redmouth disease (ERM) (Yersinia ruckeri). Fish Diseases and Disorders, Vol 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections. 3, 484-511 (2011).
- Barnes, A. C., et al. Whole genome analysis of Yersinia ruckeri isolated over 27 years in Australia and New Zealand reveals geographical endemism over multiple lineages and recent evolution under host selection. Microbial Genomics. 2 (11), 000095 (2016).
- Calvez, S., Mangion, C., Douet, D. G., Daniel, P. Pulsed-field gel electrophoresis and multi locus sequence typing for characterizing genotype variability of Yersinia ruckeri isolated from farmed fish in France. Veterinary Research. 46, 73 (2015).
- Bastardo, A., Ravelo, C., Romalde, J. L. Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environmental Microbiology. 14 (8), 1888-1897 (2012).
- Wheeler, R. W., et al. Yersinia ruckeri biotype 2 isolates from mainland Europe and the UK likely represent different clonal groups. Diseases of Aquatic Organisms. 84 (1), 25-33 (2009).
- Eyre, D. W., et al. Comparison of multilocus variable-number tandem-repeat analysis and whole-genome sequencing for investigation of Clostridium difficile transmission. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4141-4149 (2013).
- Sun, M., et al. Multiple Locus Variable-Number Tandem-Repeat and Single-Nucleotide Polymorphism-Based Brucella Typing Reveals Multiple Lineages in Brucella melitensis Currently Endemic in China. Frontiers in Veterinary Science. 4, (2017).
- Bouchouicha, R., et al. Comparison of the performances of MLVA vs. the main other typing techniques for Bartonella henselae. Clinical Microbiology and Infection. 15, SUPPL 2 104-105 (2009).
- Dahyot, S., et al. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Elberse, K. E. M., Nunes, S., Sá-Leão, R., van der Heide, H. G. J., Schouls, L. M. Multiple-locus variable number tandem repeat analysis for Streptococcus pneumoniae: Comparison with PFGE and MLST. PLoS ONE. 6 (5), (2011).
- Matejusova, I., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat genotyping of Renibacterium salmoninarum, a bacterium causing bacterial kidney disease in salmonid fish. BMC microbiology. 13, 285 (2013).
- Duodu, S., et al. An improved multiple-locus variable-number of tandem repeat analysis (MLVA) for the fish pathogen Francisella noatunensis using capillary electrophoresis. BMC Veterinary Research. 9, 252 (2013).
- Abayneh, T., Colquhoun, D. J., Austin, D., Sørum, H. Multilocus variable number tandem repeat analysis of Edwardsiella piscicida isolates pathogenic to fish. Journal of Fish Diseases. 37 (11), 941-948 (2014).
- Gulla, S., et al. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis of Yersinia ruckeri confirms the existence of host specificity, geographic endemism, and anthropogenic dissemination of virulent clones. Applied and Environmental Microbiology. 84 (16), (2018).
- Pasqualotto, A. C., Denning, D. W., Anderson, M. J. A cautionary tale: Lack of consistency in allele sizes between two laboratories for a published multilocus microsatellite typing system. Journal of Clinical Microbiology. 45 (2), 522-528 (2007).
- Lista, F., et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiology. 6, 33 (2006).
- Thermo Fisher Scientific DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/fragment-analysis-chemistry-guide.pdf (2014).
