Methodenartikel

Modifiziertes Heterotopisches Hindlimb Osteomyoskan Flap Model im Rat für translational Vasculariisierte Composite Allotransplantation Research

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DOI:

10.3791/59458

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26. April 2019

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1Christine M. Kleinert Institute for Hand and Microsurgery, 2Cardiovascular Innovation Institute, University of Louisville, 3Kentucky Spinal Cord Injury Research Center, University of Louisville, 4Department of Physiology, University of Louisville

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Vaskularisierte Verbundlegierung bietet den Transplantationsempfängern lebensverändernde Vorteile, aber die biologischen Ursachen für die Abstoßung von Transplantationen und die Vaskulopathie bleiben schlecht verstanden. Das hier vorgestellte Nagetier bietet ein reproduzierbares, klinisch relevantes Transplantationsmodell, das es Forschern ermöglicht, Abstoßungsereignisse und mögliche therapeutische Strategien zu bewerten, um deren Auftreten zu verhindern.

Zusammenfassung

Vaskularisierte Composite-Legierung (VCA) ist ein relativ neues Feld in der rekonstruktiven Chirurgie. Zu den klinischen Leistungen im menschlichen VCA gehören Hand-und Gesichtstransplantationen und in jüngerer Zeit auch Bauchwand-, Gebärmutter-und Urogenitaltransplantationen. Funktionale Ergebnisse haben die ursprünglichen Erwartungen übertroffen, und die meisten Empfänger genießen eine verbesserte Lebensqualität. Mit der häufenden klinischen Erfahrung müssen jedoch chronische Abstoßungen und Komplikationen durch die Immunsuppression angegangen werden. In vielen Fällen, in denen die Transplantationen fehlgeschlagen sind, ist die ursächliche Pathologie ischämische Vaskulopathie. Wichtige Forschungsfelder sind die biologischen Mechanismen der akuten und chronischen Abstoßung, die mit VCA verbunden sind, insbesondere die ischämische Vaskulopathie. Aufgrund der sehr geringen Zahl von VCA-Patienten wird die Bewertung der vorgeschlagenen Mechanismen jedoch in einem experimentellen Modell besser behandelt. Mehrere Gruppen haben Tiermodelle benutzt, um einige der relevanten ungelösten Fragen in der VCA-Ablehnung und Vaskulopathie zu behandeln. In der Literatur werden verschiedene Modellentwürfe mit verschiedenen Arten beschrieben. Hier stellen wir ein reproduzierbares Modell der VCA-heterotopischen Hinterbeine Osteomyohaue-Klappe in der Ratte vor, die für die translationale VCA-Forschung genutzt werden kann. Dieses Modell ermöglicht die serielle Auswertung des Transplantats, einschließlich Biopsien und verschiedener bildgebender Modalitäten, wobei ein geringes Maß an Morbidität beibehalten wird.

Einleitung

Die rekonstruktive Chirurgie für den katastrophalen Gewebeverlust durch Amputation, Strahlverletzungen, bösartige Erkrankungen und angeborene Defekte wird durch die Verfügbarkeit von Gewebe des Patienten und die zusätzliche Morbidität am Spenderstandort begrenzt. In einigen Fällen, wie zum Beispiel Verbrennungsopfer oder viereckige Amputierten, ist lebensfähiges Gewebe für die Rekonstruktion vom Patienten nicht vorhanden. 1964 wurde in Ecuador die erste moderne Handtransplantation durchgeführt. Obwohl dies ein technischer Erfolg war, reichte die damals verfügbare Immunsuppression nicht aus, um eine Abstoßung zu verhindern, und die Bestechungging in weniger als 3 Wochen 1 verloren. In den Jahren 1998 und 1999 wurden die ersten Transplantationen in der modernen Ära der Immunsuppression in Lyon, Frankreich2 und Louisville, Kentucky, USA 3durchgeführt. Zum ersten Mal könnten rekonstruktive Chirurgen wie mit Gleichem ersetzen. Die Gesichtstransplantation wurde 2005 zumersten Maldurchgeführt 4, und eine Reihe anderer VCA-Transplantationen werden nun routinemäßig durchgeführt, wie die Bauchwand5, die Gebärmutter und dieUrogenital-Transplantationen 6.

Im Gegensatz zu einer soliden Organtransplantation sind die meisten VCA-Techniken mit dem Vorhandensein der hochantigenen Spenderhaut verbunden. Die klinische Erfahrung hat ergeben, dass die akute Abstoßung der Haut relativ leicht zu kontrollieren ist, aber zur chronischen Abstoßung der zugrunde liegenden Gewebe und Gefäße beitragen kann, die nicht gut auf die Behandlung7reagieren. Die Gefäßfunktionsstörungen, die mit einer alloimmunischen Reaktion verbunden sind, sind ein unheilvolleres Hindernis für das Feld der VCA7. Makrovasculopathien führen zu Perfusionsdefiziten, verzögerter Heilung und entzündungshemmenden Zuständen. Sowohl die konfluent aggressive Großgefäßvaskulopathie als auch die fokale Intimhyperplasie tretenin Handtransplantationsempfängern 7 auf. Darüber hinaus können Mikrovaskulopathien wahrscheinlich auch zu VCA-Komplikationen beitragen und sogar zu Abstoßungsveranstaltungen führen. Während sowohl Immun-als auch nicht-immugefarbene Faktoren wahrscheinlich eine Rolle in der Vaskulopathie von Handtransplantationsempfängern spielen, sind die spezifischen Mechanismen zur Förderung der distalen Gefäßfunktionsstörungen in VCA nicht bekannt, insbesondere im Zusammenhang mit einer minderwertigen, chronischen Abstoßung. Diese unbeantworteten Fragen erfordern die Entwicklung eines tierischen VCA-Modells, das die serielle Beurteilung der Transplantation während des klinischen Kurses der VCA ablehnungspection/Pflege und Vaskulopathie ermöglicht. Ein solches Modell wird Einblicke in die Abstoßung und Vaskulopathieangesichtsvon Immunsuppression, infektiöser Herausforderung, and/oder anderen postoperativen traumatischen Verletzungen 8,9bieten.

Präsentiert wird hier ein allogeneisches Ratten-VCA heterotopisches Hindlim-Osteomyoskan-Klappen-Modell. Auf der Grundlage bereits veröffentlichter VCA-Modelle ist dieses Verfahren technisch einfach durchzuführen, in großer Zahl reproduzierbar und weist dem Empfängertier minimale Morbidität und Unbehagen auf. Dieses Modell wurde entwickelt, um klinische und histopathologische Einschätzungen der VCA-Akzeptanz vs. Abstoßung zu ermöglichen und bietet die Möglichkeit, die zugrunde liegenden Immun-und Nichtimmunmechanismen zu bewerten, die an der Abstoßung beteiligt sind.

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Protokoll

Alle Tieroperationen wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Louisville (IACUC-zugelassenes Protokoll 18198) und dem National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Nutzung von Labortiere 10. Viermonatiges Männchen Brown-Norwegen (RT1. An) und 4 Monate alter Rüde Lewis (RT1. A l) Ratten wurden als VCA-Spender bzw. Empfänger verwendet.

1. Spender Allograft Ernte

  1. Das Spendertier mit verdampftem Isoofluran, das durch eine Kammer aufgetragen wird, zu sezieren.
  2. Das Spendergebiet (Hinterglib) sowie die Leisten-und Bauchgebiete können gesäubt werden. Danach mit depilatorischer Creme behandeln, um die Menge an Fuzz zu reduzieren, die von den Clippers hinterlassen wird.
  3. Die Spendertiere werden mit intraperitoneal (IP) Kappamin (60 mg/kg)/xylazine (15 mg/kg)/acepromazine (2 mg/kg) betäubt. Administer eine Anfangsdosis von 0,2 mL/100 g Körpergewicht und zusätzliche Dosen von 0,2 mL pro h. Für Bequemlichkeit ist es optional, diesen Schritt vor Schritt 2 durchzuführen.
  4. Die Tiere während der Narkose ständig auf Atmung, Körpertemperatur und Anästhesietiefe überwachen, indem sie den Knöppen-Entzugsreflex-Test verwenden.
  5. Administer 30 U heparin Lösung subkutan (SC) im Schuppen Bereich vor der Operation, um Gerinnung zu verhindern.
  6. Tragen Sie eine Maske, eine Kopfbedeckung, ein Einweg-Isolierkleid und Einweghandschuhe.
  7. Das Spendertier supine auf ein Heizungspolster legen. Erzeugen Sie ein steriles chirurgisches Feld, indem Sie den Operationsbereich mit den ventralen und dorsalen Aspekten des Beines vorgeben, schrubben und entleeren. Don sterile Handschuhe.
  8. Machen Sie mit Hilfe #15 einen 3 cm großen Hautschnitt in der Leistengegend und reflektieren Sie den leisbeständigen Fettpolster seitlich mit Iris-Schere.
  9. Die gemeinsamen Oberschenkelgefäße auslegen und einen Drahthaken mit einem elastischen Band legen, um die Bauchmuskulatur zurückzuziehen.
  10. Mit Hilfe eines zerlegenden Mikroskops (40x) wird das Pediküre von der Entstehung der gemeinsamen Oberschenkelgefäße unter dem Leistenband quetschend getrennt und zum Zusammenfluss von poplitealen Gefäßen in die Transplantation abgetrennt.
  11. Mithilfe von Mikroclips und bipolaren Juwelierkippen, die die großen arteriellen und venösen Zweige, wie seitliche umlaufende Oberschenkelgefäße, oberflächliche kaudale epigastrische Gefäße, die saphenöse Arterie und proximale kaudale Oberschenkelgefäße, zu mobilisieren, um zu mobilisieren Die wichtigsten Oberschenkelgefäße. Mit feinen bipolaren Zangen alle kleinen Äste aukern.
  12. Machen Sie einen Hautschnitt von der Mitte der vorherigen Haut entlang der ventralen Seite der Hinterbeine geschnitten, um den Knöchelbereich mit Iris-Schere.
  13. Schneiden Sie den Gracilis-Muskel, wie auch die anderen darunter liegenden Adduktorenmuskulatur, senkrecht ab, um die medialen proximalen Genikulationsgefäße, tief verzweigten kleinen Gefäße und den Ischiasnerv zu entlarven und zu fesseln.
    NOTE: An dieser Stelle, auf einem separaten OP-Tisch, sollte der andere Chirurg intuitiv und Betäubung (2,5% – 3% isoflurane) das Empfängertier; Dies ermöglicht es den Chirurgen, den Operationsstandort des Empfängers rechtzeitig auf die Platzierung vorzubereiten und die ischämische Zeit der Transplantation zu minimieren.
  14. Auf dem Spendertier, machen umlaufende Hauteinschnitte auf der Ebene von Knie und Knöchel. Knie und Knöchel zerlegen, äußeren Muskeln und Gewebe entfernen und einen vertikalen Hautschnitt auf der Rückseite des Hinterbeines machen, um die Transplantation zu befreien. An dieser Stelle ist die Transplantation (bestehend aus Fibel und Tibia, bedeckt mit verwandten Muskeln und Hautinsel, die von ihren Perforatoren genährt wird) nur durch das Pedil verbunden.
  15. Kleine Klemmen möglichst nah auf die Oberschenkelarterie und die Vene legen und das Pediküre möglichst nah am Leistenband schneiden.
  16. Um den Blutvergieß zu spülen, spritzt hepariniertes Salz (30 U/mL) mit einer 27 G-Spülkanüle in die Oberschenkelarterie.
    NOTE: Die Vergrößerung der Arterie vor dem Heparin-Flush ermöglicht einen einfachen Zugang zum Einsetzen der Kanüle. Während der Spülung den Abfluss aus der Oberschenkelvene genau überwachen. Sobald die klare Flüssigkeit die Oberschenkelvene verlässt, stoppen Sie die Spülung.
  17. Den isolierten Transplant in warme, salzgetränkte Gaze wickeln und sofort zum Tisch des Empfängers transportieren. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Empfänger-Operationsort bereits auf eine vaskuläre Anastomose vorbereitet werden.
  18. Nach der Ernte die Spenderratte sofort per Pneumothorax euthanieren.

2. Empfängertransplantation Chirurgie

  1. Nach der Sedierungsinduktion mit verdampftem Isoofluran, das durch eine Kammer aufgetragen wird, wird das Empfängertier über ein ventilatorgesteuertes Endotrachealrohr und 2,5% – 3% Isofluran tief betäubt.
    NOTE: Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Spenderratte noch betäubt.
  2. Die Herzfrequenz, die Atemfrequenz, die Körpertemperatur und die Anästhesietiefe des Empfängertiers kontinuierlich überwachen, indem sie den Knopfe-Abzugsreflex-Test verwenden.
  3. Um Austrocknung und Hypoglykämie zu verhindern, injizieren Sie am Anfang 2 ml lactated Ringers Lösung und 2,5% dextrose subkutan am Anfang und weitere 2 ml am Ende der Operation.
  4. Die Leistengegend verrühren und mit depilatorischer Creme behandeln, um die Menge an Fuzz zu reduzieren, die von den Clippers hinterlassen wird.
  5. Tragen Sie eine Maske, eine Kopfbedeckung, ein Einweg-Isolierkleid und sterile Handschuhe.
  6. Das Tier auf ein Heizkissen legen. Die Augensalbe zur Vorbeugung von Hornhautabrieb während der Anästhesie auftragen. Erzeugen Sie ein steriles chirurgisches Feld, indem Sie den Operationsbereich vorsorgen, schrubben und entleeren.
  7. Machen Sie mit Hilfe #15 einen 3 cm großen Hautschnitt in der Leistengegend und reflektieren Sie den leisbeständigen Fettpolster seitlich mit Iris-Schere.
  8. Die gemeinsamen Oberschenkelgefäße auslegen und einen Drahthaken mit einem elastischen Band legen, um die Bauchmuskulatur zurückzuziehen.
  9. Ligattieren und teilen Murphy Zweige.
  10. Mit 10-0 Nylon unterbrochen Nähte, anastomose Spendergefäße zu Empfängergefäßen über venöse End-to-Seite-Technik und arterielle Ende-zu-Ende-Technik. Nach und nach die Klemmen aus der Arterie und dann die Vene. Überwachen Sie die anastomotischen Stellen für Blutungen und fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Nähte hinzu.
  11. Die vaskuläre Anastomose visuell beurteilen, um eine effektive Transplantation zu gewährleisten.
  12. Die Transplantation in die Leistenhauttasche einlegen und auf den Kopf stellen, wobei das Knöchelgelenk überlegen und das Kniegelenk unterlegen ist.
  13. Mit Hilfe von Schrägen sichern Sie die Transplantation an die angrenzenden Muskeln. Schließen Sie die Haut durch unterbrochene horizontale Matratzenhaut absorbierbaren 4-0 Nähte.
  14. Entfernen Sie das Empfängertier aus der Narkose und entfernen Sie es vom Ventilator. Legen Sie das Tier auf ein Heizungspolster für die thermische Unterstützung.
    NOTE: Die gesamte Operationszeit beträgt zwischen 3 und 4 Stunden, abhängig von der Erfahrung des Chirurgen und der Bekanntschaft mit dem chirurgischen Eingriff.
  15. Administer meloxicam (1 mg/kg) subkutan zur Schmerzunterdrückung und Überwachung, bis das Tier vollständig geborgen und mobil ist.

3. VCA Empfängerüberwachung

  1. Haus den Empfänger einzeln und überwachen sie täglich auf klinische Anzeichen von Schmerzen, Dehydrierung, Gewichtsverlust, und verminderte Aktivität zusätzlich zu chirurgischen Versagen (für die ersten 48 – 72 h) oder Ablehnung. Administer meloxicam subkutan (1 mg/kg) täglich für die ersten 3 Tage für Schmerzunterdrückung.
  2. Wählen Sie auf der Grundlage des Forschungs-Endpunktes ein immunsuppressives Medikament, das verabreicht werden soll.

4. Histologie

  1. Unter der eingeatmeten Isoofluranästhesie (2,5% – 3%) erhalten Sie die serielle Haut und die zugrundeliegenden Muskelbiopsien aus dem Spendergraft zu den gewünschten Zeitpunkten. Die Haut sollte vor der Biopsie geschrubbt und drapiert werden, und ein steriles Feld und eine sterile Technik sollte durchgeführt werden.
  2. Schließen Sie die Wunde mit ein bis zwei Stichen, mit absorbierbaren 4-0 Nähten. Bringe das Tier in seinen Käfig zurück und lasse es von der Narkose erholen.
  3. Reparieren Sie das biopsierte Gewebe in getrennten Röhren in 10% Formalin.
  4. Nehmen Sie am Endzeitpunkt und unter der eingeatmeten Isofluranästhesie (2,5% – 3%) eine größere Hautbiopsie, die die Donor/Empfängergrenze überspannt. Das Gefleerpaar am Fundort der Anastomosen sorgfältig lokalisieren; Der richtige Standort wird durch die Nähte sichtbar. Die gewünschten Gefäßproben aus der Arterie and/oder der Vene nehmen. Alle Proben separat in 10% Formalin fixieren. Nach der Sammlung von Gewebeproben, und während das Tier noch unter Isooflurane Anästhesie, sofort euthanieren das Tier via Pneumothorax.
  5. Mit einem Gewebeprozessor (oder einer anderen bevorzugten Einbetttechnik) wird jede Biopsie in einen eigenen Block eingebettet. Orienten Sie bei Hautproben das Gewebe so, dass alle epidermalen und dermalen Schichten in einer Scheibe zu sehen sind. Orientieren Sie für die Gefäßproben die Gefäße so, dass Querschnitte gewonnen werden können.
  6. Mit einem Mikrotom 6 μm dicke Abschnitte schneiden und auf Dias für Hämatoxylin und Eosin (H & E) auftragen.
  7. Verlassen Sie sich für H & E mit einem Standardprotokoll.
  8. Mit Brightfield-Mikroskopie-Techniken können Sie repräsentative Bilder aller gewünschten Gewebeproben erhalten.

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Ergebnisse

Das Ratten-VCA-Heterotopic hindlimb osteomyoskan Klappenmodell ermöglicht ein langfristiges allograft-Überleben unter Immunsuppression. Das Modell ist zuverlässig, reproduzierbar und einfach auszuführen. Die Klappe ist gut versteckt in der Leistengegend und stellt minimale Morbidität und Beschwerden für das Tier dar. Die Hautpräsentation ist eine klinische Manifestation des Überlebens und der Ablehnung der Allograft(Abbildung1). Das Klappendesign ermöglicht eine grobe klinische Überwachung u...

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Diskussion

Bei der Entwicklung dieses VCA-Modells wurden mehrere Schlüsselfragen berücksichtigt. Zunächst war es wichtig, intakte Knochen (Tibia und Fibel), Knochenmark und Haut in den Transplantation einzubinden. Während klinische Handtransplantationen von erwachsenen Spendern keine signifikanten Mengen von aktiv hämatopoetischen Knochenmark übertragen, werden Studien über die Rolle der Knochenmarknische besser gespiegelt mit einem intakten, vaskularisierten Knochen statt eines abgeschnittenen langen Knochens, was zu einem abgesch...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Büro des stellvertretenden Verteidigungsministers für Gesundheitsfragen durch das Congressionally Directed Medical Research Program unter dem Preis Nr. 1 unterstützt. W81XWH-13-2-0057. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcepromazinHenry Schein5700850
Adventitia SchereASSI 
Approximatorklemme (doppelt)ASSIABB2V, ABB22V
Approximatorklemme (einfach)FST00398-02
Klemme zum Anlegen einer PinzetteASSI CAF4
PräparierschereASSISDS18R8
Flushing stumpfe Nadel 27 GSAI
Heparin-Natrium-Sagent25021-400-30
IsofluranPatterson Veterinary14043-704-06
Juweliere BipolarASSI103000BPS03
Juwelierzange #3FST11231-30
Ketamin HCl 100 mg/mLZoetis043-304DEA Lizenz erforderlich
Laktat-RingerlösungHospira0409-7953-03
Laktat-Ringerlösung + 5% DextroseHospira0409-7953-09
MeloxicamHenry Schein11695-6925-2
MikrozangeASSI JFAL3
MikronadelhalterASSIB138
Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mLAstellas0469-3016-01
Nahtmaterial, 10-0 ProleneEthiconW2790oder 10-0 Ethilon (2830)
Nahtmaterial, 4-0 beschichtetes VicrylEthiconJ714D
GefäßdilatatorzangeASSID5AZ
XylazinVetOne13985-612-50
SAS15R8

Referenzen

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