Methodenartikel

Etablierung und Charakterisierung von drei Afatinib-resistenten Lungenadenokarzinom PC-9 Zelllinien entwickelt mit zunehmenden Dosen von Afatinib

DOI:

10.3791/59473

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26. Juni 2019

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1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurde ein Verfahren zur Etablierung von Afatinib-Resistenz-Zelllinien aus Lungenadenokarzinom-PC-9-Zellen entwickelt und resistente Zellen charakterisiert. Die resistenten Zellen können verwendet werden, um epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz-Mechanismen zu untersuchen, anwendbar für Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.

Zusammenfassung

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Erworbene Resistenz gegen molekulare Zielhemmer ist ein ernstes Problem in der Krebstherapie. Lungenkrebs ist in den meisten Ländern nach wie vor die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Die Entdeckung von "onkogenen Treibermutationen", wie epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR)-aktivierende Mutationen, und die anschließende Entwicklung molekularer gezielter Wirkstoffe von EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) (Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib) haben die Lungenkrebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten dramatisch verändert. Diese Medikamente sind jedoch immer noch nicht wirksam bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die EGFR-aktivierende Mutationen tragen. Nach erworbener Resistenz bleibt das systemische Fortschreiten von NSCLC ein erhebliches Hindernis bei der Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positivem NSCLC. Hier stellen wir eine stufenweise Dosiseskalationsmethode zur Etablierung von drei unabhängigen erworbenen Afatinib-resistenten Zelllinien aus NSCLC PC-9-Zellen vor, die EGFR-aktivierende Mutationen von 15-Basen-Paar-Deletionen in EGFR exon 19 enthalten. Methoden zur Charakterisierung der drei unabhängigen afatinib-widerstandsgebundenen Zelllinien werden kurz vorgestellt. Die erworbenen Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Daher müssen mehrere Zelllinien mit erworbener Resistenz gegen EGFR-TKIs untersucht werden. Zehn bis zwölf Monate sind erforderlich, um Zelllinien mit erworbenem Widerstand mit diesem schrittweisen Dosiseskalationsansatz zu erhalten. Die Entdeckung neuartiger resistenzmechanismen wird zur Entwicklung wirksamerer und sicherer therapeutischer Strategien beitragen.

Einleitung

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Fünf Tyrosinkinase-Inhibitoren, die auf epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) abzielen, einschließlich Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib, sind derzeit für die Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positiver nicht-kleinzelliger Lunge verfügbar. Krebs (NSCLC). In den letzten zehn Jahren haben sich Therapien für solche Patienten mit der Entdeckung neuer potenzieller EGFR-TKIs dramatisch entwickelt. Bei Patienten mit Lungenadenokarzinom wurden somatische Mutationen in EGFR bei etwa 50%der asiatischen und 15% der kaukasischen Patienten 1 identifiziert. Die häufigsten Mutationen in EGFR sind eine L858R-Punktmutation bei EGFR exon 21 und 15 Base pair (bp) Deletionen in EGFR exon 192. Bei EGFR-Mutations-positiven Patienten mit NSCLC verbessern EGFR-TKIs die Ansprechraten und klinischen Ergebnisse im Vergleich zum vorherigen Standard der Platin-Doppelchemotherapie3.

Gefitinib und Erlotinib waren die ersten zugelassenen kleinen Molekülinhibitoren und werden im Allgemeinen als EGFR-TKIs der ersten Generation bezeichnet. Diese EGFR TKIs blockieren die Tyrosinkinase-Aktivität, indem sie mit ATP konkurrieren und reversibel an ATP-Bindungsstellen binden4. Afatinib ist ein EGFR-TKI der zweiten Generation, das irreversibel und kovalent an die Tyrosinkinase-Domäne von EGFR bindet und als panhumaner EGFR-Familieninhibitor5charakterisiert ist.

Trotz des dramatischen Nutzens dieser Therapien bei Patienten mit NSCLC ist eine erworbene Resistenz unvermeidlich. Der häufigste Resistenzmechanismus gegen EGFR-TKIs der ersten und zweiten Generation ist die Entstehung der T790M-Mutation in EGFR exon20, die in 50-70% der Tumorproben 6,7,8vorhanden ist. Andere Resistenzmechanismen sind Bypass-Signale (zu MET, IGF1R und HER2), Transformation zu kleinzelligem Lungenkrebs und Induktion epitheliaal-mesenchymaler Übergang, die vorklinisch und klinisch9auftreten. Die Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Durch die Identifizierung neuartiger Resistenzmechanismen in präklinischen Studien kann es möglich sein, neuartige Therapeutika zu entwickeln, um Resistenzen zu überwinden. Optimale Sequenztherapien, die den klinischen Nutzen für die Patienten maximieren, müssen die Resistenzmechanismen und das therapeutische Ziel berücksichtigen.

Es ist zwingend notwendig, die richtige elterliche Zelllinie zu wählen, da sie die Grundlage aller nachfolgenden Experimente ist. Die Auswahlstrategien beginnen mit klinischer Relevanz; es ist notwendig, eine Chemotherapie und Bestrahlung naive Zelllinie zu wählen. Vorherige chemotherapeutische und/oder strahlungstechnische Behandlung kann die Veränderung der Resistenzwege und Veränderungen der Expression von Arzneimittelresistenzmarkern induzieren. In dieser Studie werden PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 tragen, für die Etablierung der erworbenen Resistenz gegen Afatinib eingesetzt. Diese Zelllinie wurde von einem japanischen NSCLC-Patienten abgeleitet, der keine vorherige Chemotherapie und Bestrahlung erhielt.

Da Afatinib täglich oral verabreicht wird, wäre eine kontinuierliche In-vitro-Behandlung, bei der die Zellen ständig in Gegenwart von Afatinib kultiviert werden, klinisch relevant. Die Dosis der Medikamente, die in den verschiedenen Schritten des Experiments verwendet werden, muss für die ausgewählte Elternzelllinie optimiert werden. Zur Bestimmung eines geeigneten Arzneimittelbereichs kann ein Zytotoxizitätstest verwendet werden, der mit den pharmakokinetischen Informationen des Arzneimittels vergleichbar sein sollte.

Während des gesamten Auswahlprozesses wird die gesamte Zellgesamtheit als eine einzige Gruppe beibehalten. Klonen oder andere Trennmethoden werden nicht verwendet. Die Zellen werden zunächst kontinuierlich einem niedrigen Niveau des Medikaments ausgesetzt. Anschließend, nachdem sich die Zellen anpassen, um in Gegenwart des Medikaments zu wachsen, wird die Dosis des Medikaments langsam auf die endgültige optimale Dosis des Medikaments10,11erhöht. Alternativ kann eine Pulsmedikamenten-Verabreichung oder Mutagenese zur Auswahl von Resistenzzellen verwendet werden, die auch vor der medikamentösen Behandlung durchgeführt werden 12,13. Leider werden Fälle, in denen sich die Arzneimittelresistenz nicht entwickelt, in der Regel nicht gemeldet. Die Selektionsstrategien werden mit dem Ziel entwickelt, die Bedingungen von Krebspatienten für den Wiederaufbau klinisch relevanter Resistenzen nachzuahmen. Manchmal wird eine hohe Arzneimittelkonzentration verwendet, um molekulare Veränderungen im Zusammenhang mit Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu identifizieren. Dieses Modell wird weniger klinisch relevant.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung von drei unabhängigen afatinibresistenten Zelllinien aus PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 enthalten, sowie die anfängliche Charakterisierung der afatinibresistenten Zelllinien.

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Protokoll

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1. Aufbau von drei unabhängigen Afatinib-resistenten PC-9-Zelllinien

  1. Bestimmung der anfänglichen Afatinib-Expositionskonzentration für PC-9-Zellen mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Test
    1. Kultur-PC-9-Zellen im Wachstumsmedium, die fetales Rinderserum (10%), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 g/ml) in einer 10 cm großen Zellkultur in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C behandelten Zellkultur-Schale enthalten.
    2. PC-9-Zellen bei 4 x 104 Zellen/ml im Wachstumsmedium aussetzen und dann in einer 96-Well-Mikroplatte bei 50 l/well aussaat. Die Endkonzentration der Zellen beträgt 2,0 x 103 Zellen/50 l/well. Über Nacht in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C inkubieren.
    3. Fügen Sie den Brunnen, die das Wachstumsmedium (50 ,L) enthalten, 50 L Afatinib-Lösung in unterschiedlichen Konzentrationen: 0, 0,002, 0,06, 0,06, 0,6, 2, 6 und 20 ,M bei. Das Endvolumen und die Konzentrationen von Afatinib betragen 100 l und 0, 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 und 10 M.
    4. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte für 96 h in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C.
    5. Fügen Sie jedem Brunnen 15 l der Farbstofflösung (siehe Materialtabelle) hinzu und in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C 4 h brüten, und fügen Sie dann 100 l Löslichkeit/Stop-Lösung (siehe Materialtabelle)zu jedem Brunnen hinzu und in kubieren Sie über Nacht in einem 5% CO. c10>2 Inkubator bei 37 °C.
    6. Messen Sie die optische Dichte bei 570 nm (OD570) mit einem Mikroplattenleser (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie 6-12 Replikationen vor und wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal.
    7. Verwenden Sie statistische Software (siehe Materialtabelle), um diese Daten grafisch als Halbprotokolldiagramm darzustellen und den IC50-Wert zu berechnen, d. h. die Arzneimittelkonzentration, die die Reaktion auf 50 % ihres Maximums reduziert (siehe Tabelle der Materialien). ).
  2. Kontinuierliche Exposition von PC-9-Zellen gegenüber dem irreversiblen EGFR-TKI, Afatinib, durch schrittweise Dosiseskalation in drei unabhängigen 10 cm-Schalen
    1. Kultur PC-9 Zellen in p100 Geschirr mit 10 ml Wachstumsmedium. Wenn die PC-9-Zellen das subkonfluente Stadium erreichen, übertragen Sie 1 ml Zellsuspension in drei neue p100-Schalen mit 9 ml Wachstumsmedium. Die 1:10 verdünnten PC-9-Zellen werden in 3-4 Tagen subkonfluent, mit einer Zellzahl von etwa 4-5 x 105 Zellen/ml.
    2. Am nächsten Tag 1/10 des IC50 Wertes von Afatinib in jedes der drei p100 Gerichte hinzufügen.
      HINWEIS: Afatinib wird in DMSO bei Bestandskonzentrationen von 1 m, 10 m, 100 m, 1 mM und 5 mM rekonstituiert. 1 bis 10 l Afatinib-Lösung wird gemäß den erforderlichen Endkonzentrationen in 10 ml Wachstumsmedium der Kultur zugegeben.
    3. Wenn die Zellen in den afatinibhaltigen p100-Schalen sub-konfluent werden, gut durch Aspiration mit einer 1 ml Pipette mischen und 1 ml der Zellsuspension zu 9 ml frischem Wachstumsmedium in einer neuen p100 Schale hinzufügen. Als nächstes fügen Sie der neuen Kultur 10-20% höhere Konzentrationen von Afatinib hinzu.
    4. Erhöhen Sie die Afatinib-Konzentration von 0,1 nM bis 1 m im Medium durch die schrittweise Dosiseskalation mit der Afatinib-Konzentration, die bei jedem Schritt über einen Zeitraum von 10-12 Monaten um 10-20 % erhöht wird.
      HINWEIS: Wenn sich die Afatinib-Konzentration demIC-50-Wert nähert, wird das Zellwachstum recht langsam. Wenn die Zellen 1:9 geteilt sind, können sie nicht wachsen, da diese Zellen durch höhere Konzentrationen von Afatinib getötet werden. Daher können die Zellen bei höheren Afanitib-Konzentrationen im Verhältnis 1:2 geteilt werden. Die widerstandsfähigsten Zellen wurden 3-14 Tage lang in Afatinib-enthaltenem Medium angebaut, und das Medium wurde erst verändert, wenn die resistenten Zellen durchgedrungen werden mussten.
    5. Die afatinibresistenten Zellen für 2-3 Monate in 1 'M Afatinib-haltigem Wachstumsmedium kulturieren. Bei einer Afatinib-Konzentration von 1 M sind 10-12 Monate erforderlich, um in diesem Modell eine Resistenz gegen Afatinib zu entwickeln. Führen Sie den MTT-Test durch, um zu bestätigen, dass die Zellen gegen Afatinib resistent sind. Die drei unabhängig etablierten Afatinib-Resistenzzelllinien wurden AFR1, AFR2 und AFR3 genannt.

2. Charakterisierung von drei unabhängigen Afatinib-resistenten Zellen

  1. Bestimmung der Wachstumskurve von elternden PC-9-Zellen und Etablierung von Afatinib-resistenten Zellen
    1. Kultur die PC-9, AFR1, AFR2 und AFR3 Zellen in Wachstumsmedium in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C.
    2. Setzen Sie die Zellen bei 5 x 103 Zellen/ml mit Wachstumsmedium und Samen 100 l/well in eine 96-Well-Mikroplatte aus, so dass die Endkonzentration der Zellen 500 Zellen/100 l/well beträgt.
      HINWEIS: Der MTT-Assay wird durchgeführt, um die OD570-Werte bei 0, 1, 2, 3, 5 und 7 Tagen zu messen. Für jeden Tag werden sechs 96-Well-Mikroplatten benötigt.
    3. Führen Sie den MTT-Test alle 24 h und dann an den Tagen 0, 1, 2, 3, 5 und 7 durch. Messen Sie die OD570-Werte und bereiten Sie 6-12-Replikationen vor. Wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal, und zeichnen Sie die Ergebnisse mit einer statistischen Software grafisch auf (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Identifizierung der genomischen DNA-Veränderungen in EGFR durch Echtzeit-PCR
    HINWEIS: Afatinib ist ein kleiner Molekülinhibitor, der auf EGFR-Tyrosinkinase abzielt. Der EGFR-Expressionsstatus wird auf DNA- und Proteinebene bestimmt.
    1. Die genomische DNA wird mit einem DNA-Reinigungskit (siehe Materialtabelle)nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Messen Sie die Konzentration der isolierten genomischen DNA mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) und passen Sie alle genomischen DNA-Proben auf 25 ng/L an.
    2. Amplify 50 ng of genomic DNA, which is equivalent to 2 'L of the 25 ng/'L stocks, using a SYBR Green master mix (siehe Table of Materials) and analyze the results by a fluorescence-based RT-PCR-detection system (siehe Tabelle of Materials).
      HINWEIS: Die PCR-Zyklusbedingungen begannen mit einem ersten Denaturierungsschritt bei 95 °C für 20 s, gefolgt von 40 Zyklen 95 °C Denaturierung für 3 s, 60 °C Glühen für 30 s. Die spezifischen Primer-Sets sind wie folgt: EGFR F: 5'-CAAGGCCATGGAATCTCTCA-3', R: 5'-CTGGAATGAGGTGGAGAGaACA-3'. Normalisationsgen LINE-1 F: 5'-AAAGCCGCTCAACTACATGG-3', R: 5'-TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG-3'.
  3. Bewertung der Auswirkungen von Proteinveränderungen auf EGFR-Ebene durch Western-Blot-Analyse
    1. Behandeln Sie die Zellen mit Afatinib kontinuierlich vor Denexperimenten für 24 h. Waschen Sie PC-9-, AFR1-, AFR2- und AFR3-Zellen zweimal mit PBS und säen Sie sie dann ohne Afatinib in Wachstumsmedien aus. Waschen Sie PC-9-, AFR1-, AFR2- und AFR3-Zellen zweimal mit 5 ml eiskaltem PBS.
    2. Lyse die Zellen in RIPA-Puffer mit 1% Protease-Hemmer-Cocktail (siehe Tabelle der Materialien) und Phosphatase-Hemmer-Cocktail II und III (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie diese Lösung bei 4 °C für 30 min. Zentrifugieren Sie die Lysate für 10 min bei 100 x g und 4 °C und die gereinigten Lysate einsammeln.
    3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Bicinchoninsäure-Assay (siehe Materialtabelle),passen Sie alle Proteinproben auf 0,5 oder 1 g/l mit 4x Probenpuffer (500 mM Tris (PH 6.8), 40% Glycerin, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% Bromphenolblau) und bei 96 °C für 5 min. Lagern Sie diese Proteinproben bei -80 °C, bis eine Western-Blot-Analyse durchgeführt wird.
    4. Separate gleiche Mengen an Proteinproben, vorzugsweise 20-30 l, um 8% SDS-Seite und übertragen die Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF).
      HINWEIS: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wird häufig im Labor zur Trennung von Proteinen auf basis ihres Molekulargewichts eingesetzt.
      1. Glasplatten mit Ethanol reinigen und die Glasplatte und Abstandshalter montieren. 8% Polyacrylamid-Gele mit 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8, 40% Bis-Acrylamid, 10% SDS, 10% APS und TEMED zubereiten. 30 min bei Raumtemperatur polymerisieren.
      2. Anschließend ein Stapelgel mit 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 40% Bis-Acrylamid, 10% SDS, 10% APS und TEMED zubereiten. Fügen Sie die Stapelgellösung hinzu, legen Sie den Kamm ein und polymerisieren Sie das Gel für 20-30 min bei Raumtemperatur.
      3. Legen Sie die Gele in das Elektrophoresegerät und füllen Sie den Tank mit Laufpuffer (0,25 M Tris, 1,92 m Glycin und 1% SDS). Laden Sie die gleiche Menge an Proteinproben (20-30 l) und führen Sie das Gel bei 180 V. Stoppen Sie die Elektrophorese, sobald die Farbstofffront aus dem Gel fließt, nach ca. 60 min.
      4. Waschen Sie das Gel 1-2 min mit TBST und übertragen Sie die Proteine dann auf eine PVDF-Membran durch halbtrockenes Blotting (siehe Tabelle der Materialien) für 1,5 h bei einem konstanten Strom von 300 mA.
    5. Blockieren Sie die Membranen mit 5% fettfreier Trockenmilch (siehe Materialtabelle), die mit TBST-Lösung (siehe Materialtabelle)für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt wird, und sonden Sie dann die Membranen mit Anti-EGFR, Anti-Phospho-EGFR (Y1068), Anti-HER2, Anti-HER3-, Anti-MET- und Anti-Actin-Antikörper (in TBST 1:3.000 verdünnt) (siehe Materialtabelle) bei 4 °C über Nacht.
    6. Waschen Sie die Membranen mit TBST dreimal für 10 min, und setzen Sie die Membranen dann dem sekundären Antikörper (verdünnt 1:200 in TBST) für 1-1,5 h bei Raumtemperatur aus. Waschen Sie die Membranen fünfmal mit TBST 10 min bei Raumtemperatur, setzen Sie sie der ECL-Lösung aus (siehe Tabelle derMaterialien), und visualisieren Sie die Signale mithilfe von Folien.
  4. Analyse von EGFR-Mutationen durch Sequenzierung
    1. Amplify genomic DNA using specific primer for EGFR exons 19-21. Die PCR-Zyklusbedingungen beginnen mit einem ersten Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 min, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 10 s, Glühen bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 1 min.
      HINWEIS: Die spezifischen Primer für EGFR exon 19: F: 5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3' R: 5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG-3', exon 20: F: 5'-CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC-3', R: 5'-CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC-3', und exon 21: F: 5'-ATGAACATGACCCTGAATTCGG-3', R: 5'- GCTCACCCAGAATGTCTGGAGA-3..
    2. Reinigen Sie die verstärkten PCR-Produkte mit einem PCR-Reinigungskit (siehe Materialtabelle) und sequenzieren Sie die Amplicons.

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Ergebnisse

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Das Schema zur Einrichtung von drei Afatinib-Resistenz-Zelllinien aus PC-9-Zellen mit einem schrittweisen Dosis-Eskalationsverfahren ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt eine Abnahme der Zellproliferation von elterlichen PC-9-Zellen, da die Konzentration von Afatinib erhöht ist, was darauf hindeutet, dass PC-9-Zellen empfindlich auf Afatinib-Exposition reagieren. Abbildung 3 zeigt die Afa...

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Diskussion

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Hier beschrieben wir ein Verfahren zur Etablierung von drei unabhängigen afatinibresistenten Zelllinien und charakterisierten diese Zellen im Vergleich zu elterlichen PC-9-Zellen. Durch schrittweise Dosiseskalationsexposition erhielten die elterlichen PC-9-Zellen über einen Zeitraum von 10-12 Monaten eine Resistenz gegen Afatinib. Klinisch sind die Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs heterogen, so dass PC-9-Zellen nach der Erstbehandlung mit Afatinib in drei unabhängige p100-Gerichte unterteilt und afatinib weiter ausge...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Mitglied des Advanced Cancer Translational Research Institute für ihre nachdenklichen Kommentare und Editage für ihre Unterstützung bei der englischsprachigen Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Zuschussnummer: 16K09590 an T.Y.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
afatinibSelleckS1011
monoklonaler Anti-EGFR-AntikörperZellsignalisierungstechnologie4267S
Bicinchoninc-Säure-AssaySigmaB9643
mit Zellkultur behandelte 10-cm-SchaleViolamo2-8590-03
CELL BANKER1 TakaRaCB011Kryokonservierungsmedium
CellTiter 96Promega  Nr. G4100  Proliferationsassay für nicht-radioaktive Zellen; Farbstofflösung und Solubilisierungs-/Stopplösung
DMSOWako043-07216
ECL-LösungPerkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700Applied Biosystemsfluoreszenzbasiertes RT-PCR-Detektionssystem
GraphPad Prism v.7 Software GraphPad, Inc.eine statistische Software
NanoDrop Lite SpektralphotometerThermo-Spektralphotometer
FettfreieTrockenmilchzelle Signaltechnologie9999S
Pen Strepgibco15140-163
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2SigmaP5726
Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3SigmaP0044
Powerscan HT Mikroplatten-ReaderBioTek
  Power SYBR Green Mastermix Applied BiosystemsSYBR Green Master Mix
Protease-Inhibitor-CocktailSigmaP8340
QIAamp DNA Mini KitQiagen51306DNA-Aufreinigungskit
QIAquick PCR-Aufreinigungskit QIAGENPCR-Aufreinigungskit
RPMI-1640 Wako189-02025mit L-Glutamin und Phenolrot
TBST-PulverSigmaT9039
Trans-Blot SD halbtrockene elektrophoretische TransferzelleBio-Radhalbtrockene t4ransfer-Vorrichtung
96-Well-MikroplatteThermo130188

Referenzen

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Schlagwörter

Afatinib ResistancePC 9 CellsEGFR MutationsStepwise Dose EscalationMTT AssayWestern Blot AnalysisEGFR SequencingGenomic DNA IsolationProtein Concentration AssayCell Growth Curve

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