Summary
在这里，我们描述了将定义的机械载荷应用于小鼠小腿和监测伴随的肌肉压力变化的协议。我们开发的实验系统对于研究体育锻炼和按摩的有益作用背后的机制非常有用。
Abstract
按摩被普遍认为有助于缓解疼痛和炎症。虽然以前的研究已经报道了按摩对骨骼肌肉的抗炎作用，但背后的分子机制却知之甚少。我们最近开发了一种简单的装置来应用局部周期性压缩（LCC），它可以产生不同振幅的肌肉压力波。使用该装置，我们已经证明LCC调节巨噬细胞的原位炎症反应，并减轻固定引起的肌肉萎缩。在这里，我们描述了LCC的优化和应用方案，作为一种按摩样干预固定引起的炎症和小鼠后肢骨骼肌肉萎缩。我们开发的协议可用于研究运动和按摩的有益作用的机理。我们的实验系统提供了分析方法的原型，以阐明肌肉平衡的机械调节，虽然需要进一步的发展，以进行更全面的研究。
Introduction
按摩被普遍认为对减轻疼痛和提高竞技运动员和非运动员的身体表现都是有益的。事实上，以前的研究表明，按摩抑制局部炎症3，并促使从运动后肌肉损伤4，5恢复。按摩有益作用的分子机制在很大程度上仍不为人所知。
按摩机械学调查的一个困难是，通过实验技术对按摩样干预进行试验的可重复性。在以前的研究中，模仿按摩的实验程序主要涉及使用练习者身体部位（如手掌和手指6、7、8）进行身体干预。这使得很难精确再现其大小、频率、持续时间和模式。
许多设备已被开发用于将定义的机械载荷应用于目标组织。例如，曾等人开发了一种气动系统，用于对大鼠的后肢进行长度机械加载，王等人也开发了一种机电一体化装置，可以将按摩般的机械载荷应用于大鼠和兔子的后肢。实时反馈控制10。与它们相比，我们的局部循环压缩 （LCC） 系统要简单得多，对施工成本的要求要低得多。尽管如此，我们可以重现在轻度肌肉收缩期间产生的肌肉压力变化。利用该装置，我们已经成功地证明，按摩样的机械干预调节局部间质流体动力学，缓解固定引起的肌肉萎缩11。
在这里，我们描述了我们的设备和协议的细节，这可能有助于探索运动和按摩的积极作用背后的分子机制。该协议的原理图作为补充图1提出。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验都是经国家残疾人康复中心动物护理和使用委员会批准进行的。
1. 固定小鼠双边后肢
注：雄性C57BL/6小鼠在适应后至少7天11-12周时用于实验。
- 使用五巴比妥钠（50毫克/千克i.p.）对小鼠进行充分麻醉。确保小鼠对后肢脚趾捏没有反应。
注：在上午10时至下午7时之间进行固定程序，以尽量减少对小鼠进食活动的可能影响。 - 将手术胶带涂在小鼠的双边后肢上，放在一个苏皮内位置，膝盖关节延长，踝关节弯曲。
- 在 L4-5 脊柱水平的树干上放置一根铝线（参见材料表），并在螺旋结构中绕后肢旋转导线，螺旋层每圈之间有 5 mm 的间隙（图 1A）。确保不要将导线卷得太紧，避免干扰当地的血流。
- 为了尽量减少从接线中逸出的可能性，通过手动调整铝线的配置，将髋关节固定在 90° 绑架的位置。
- 把老鼠送回原来的笼子里。3小时后，确保他们从麻醉中恢复，并像往常一样获得食物和水。
- 每个笼子3-6只固定小鼠，如固定前一样。
2. 小鼠胃内肌肉肌肉肌肉肌肉压力的测量
注：在与LCC结合的压力监测实验中，测试了几种不同重量的圆柱体单元（36克、66克和200克）。该测量与分析肌肉炎症和萎缩的实验分开进行（详情见步骤 3 - 5），即接受压力测量的小鼠未用于组织学分析。
- 由于压力测量涉及与后肢布线和LCC相比更具侵入性的程序（例如皮肤切口和针插入），因此使用三种麻醉剂的混合物（麦地霉胺0.75毫克/千克，中氨基4.0毫克/千克，丁醇5.0毫克/千克，i.p.）。确保小鼠对后肢脚趾捏合没有反应。
- 将鼠标放在易感位置，用电动刮刀脱毛后，用手术刀在后小腿上切开2毫米切口，用70%乙醇和氯西丁浸泡的吸水棉对皮肤表面进行半消毒。
- 将20G的插入针头以钝角（150°~170°）插入胃肠肌中，以钝角（150°~170°）插入皮肤表面。
- 以针的塑料护套为指导，在胃肠肌肉的中腹放置血压遥测仪的传感器（见材料表），然后从肌肉上取下护套。
- 用4-0尼龙缝合缝合皮肤后，在小鼠的小腿上涂上几个不同重量的圆柱形单位的LCC（详情见步骤3），并使用用于生物信号分析的软件监测肌肉压力（见表材料）。
- 把老鼠送回原来的笼子里。3小时后，确保他们从麻醉/麻醉中恢复，并像往常一样获得食物和水。
3. 小鼠小腿上的局部周期性压缩 （LCC）
- 除肌肉压力测量和安乐死（即宫颈脱位）外，使用五巴比妥钠（50毫克/千克i.p.）进行麻醉。
- 将鼠标从后肢接线中分离，并将其置于一个容易的位置，膝盖关节伸展，踝关节弯曲，使小腿朝上。不要在舞台上固定鼠标后肢。
- 通过垂直移动圆柱形重量单元（图1B），在1Hz（图1C）上，每天30分钟，7天，将LCC施加到小腿上。
- 每天每次LCC后，重新连接鼠标后肢。
4. 胃肠免疫性化学分析
- 在适当的麻醉/麻醉下，通过注射三种麻醉剂的混合物（麦地那米胺0.75毫克/千克，中子胺4.0毫克/千克，以及丁醇5.0毫克/千克），在适当的麻醉/麻醉下使小鼠安乐死。
- 脱毛后小腿表面，做皮肤切口，并解剖胃肠肌肉，通过分离从头骨纤维骨使用手术剪刀，并迅速冻结他们在一个最佳的切割温度复合溶液。
- 使用低温器，在玻璃滑梯上制备胃肠肌肉的低温截面样本。将样品储存在-80°C冷冻室中，直到分析。
- 从冷冻箱中取出胃肠冷冻部分样品，在室温下通过空气干燥脱水。
- 使用液体阻滞笔绘制包含幻灯片上所有低温部分的区域。圆圈将防止解决方案从幻灯片上流出。
- 将滑轨放入使用浸水纸布营造潮湿环境的托盘中，避免样品干燥。
- 在室温下涂抹100μL的阻断缓冲液（含0.25%卡辛、载体蛋白和0.015 M阿齐德钠的磷酸盐缓冲盐（PBS）。
- 用PBS-T（含有0.1%聚乙烯环一醇的PBS）冲洗幻灯片两次（见材料表）5分钟。
- 在每个样品上涂抹100μL原抗体，用PBS稀释，盖上盖子盖住托盘，在室温下孵育过夜。
- 用 PBS-T 洗涤 3 次（每次洗涤 5 分钟）。
- 在每个样品上涂抹100μL的二级抗体，用PBS稀释，并在室温下孵育1小时。
注：对于抗拉米宁染色，使用Alexa Fluor 568-结合二级抗体。对于抗F4/80、抗MCP-1和抗TNF-α，使用Alexa Fluor 568-或488偶发二次抗体。 - 用 PBS-T 洗涤 3 次（每次洗涤 5 分钟）。
- 在每个样品上涂抹100μL的DAPI溶液，用PBS-T稀释，并在室温下孵育3分钟。
- 用 PBS-T 洗涤 3 次（每次 5 分钟）。
- 使用安装介质安装样品，并盖上盖板。
5. 胃肠的形态分析
- 将样品幻灯片放在荧光显微镜上（见材料表），并使用带适当过滤器的 20° 物（DAPI-B、360/40 nm 用于激发和 460/50 nm 进行发射）查看样品;GFP-B，470/40 nm 用于激励，535/50 nm 用于排放;FRITC，540/25 nm 用于激励，605/55 nm 用于排放。
- 使用该软件进行图像分析（见材料表），测量每个肌纤维的横截面面积（CSA），并计算F4/80-、MCP-1-和TNF-β阳性细胞的数量。
注：通过跟踪基底膜的内缘，通过抗拉米宁-2免疫染色进行可视化，确定每个肌纤维的CSA。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
与我们以前的观察12一致，胃肠肌纤维的CSA因后肢固定而显著减少（图2A，B）。此外，我们的免疫荧光染色分析表明，表达MCP-1和TNF-α的细胞在调节炎症过程方面起着关键作用13，14，在胃肠肌中显著增加固定后肢组织（MCP-1：图2C，F，H;TNF-α：图2D，G，I。加上正染为F4/80的细胞的增加，巨噬细胞的标记物（图2C-E，H，I），后肢固定似乎刺激小腿肌肉萎缩，涉及局部炎症反应，包括巨噬菌体积累。然后，我们试图检查LCC，按摩一样的机械干预，调节这种固定引起的肌肉炎症和萎缩。
在通过改变圆柱单元重量测试的几个不同的LCC量中，一个对应于50 mmHg肌肉压力波（LCC，66 g，图3A）似乎最有效地缓解了肌纤维CSA的固定性降低和胃神经肌肉巨噬菌体积累的增加（图3B）。基于肌纤维CSA和巨噬菌体积累的结果，我们采用66gLCC进行进一步研究。值得注意的是，LCC引起的肌肉压力波的峰值幅度取决于圆柱体单位重量，高度均匀（图3A），表明LCC作为机械干预的一致性和可重现性。骨骼肌。
LCC（1赫兹，每天30分钟，7天）显著缓解胃肠肌肌肌纤维CSA的固定性下降（图4A，B）。此外，LCC部分缓和了三头肌收缩力的固定性降低（图4C）。此外，LCC还缓和了固定后肢胃肠肌肉组织中F4/80阳性、TNF-α阳性、F4/80-、MCP-1-和TNF-β阳性细胞的增加（F4/80，图4D，F;MCP-1，图4D，G;TNF-α，图4E，H）。总体而言，LCC产生振幅为50 mmHg的肌肉压力波，缓解固定引起的肌肉萎缩和局部炎症反应，包括巨噬细胞积累。
图1：鼠标双边后肢固定和局部周期性压缩（LCC）应用。
（A） 双边小鼠后肢被螺旋连接固定，髋关节被拐动，膝关节伸展，踝关节弯曲。（B） LCC 设备.（C） 小鼠小腿上 LCC 的实验设置.请点击此处查看此图的较大版本。
图2：小鼠后肢固定，导致小腿肌肉萎缩，引起局部炎症反应。
（A） 胃肠肌肉抗拉米宁-2免疫荧光染色的横截面微图图像。高放大倍率图像（右图）是指低放大率图像中矩形指示的区域（左图）。刻度条，100 μm. （B） 固定诱发肌肉萎缩.胃内肌纤维的CSA随后肢固定期而减少。为了量化CSA，随机选择了100种肌纤维。数据以均值形式显示 ， S.D. =， P < 0.05， 单向方差分析，带有后点位 Bonferroni 测试（n = 每组 3 个小鼠）。（C 和 D）抗MCP-1（绿色在C）和抗TNF-α（绿色在D）和抗F4/80（红色）免疫染色的微图图像。对于合并的演示文稿（绿色和红色），低倍率和高放大倍率图像的放置方式如下 （A）。箭头指向F4/80和MCP-1（C）或TNF-α（D）刻度条的双阳性细胞，100μm（E-I）定量抗MCP-1、抗TNF-α和抗F4/80免疫染色。结合双边后肢固定期，分析了固定的影响。根据"第0天"样本（未进行固定的小鼠的胃肠肌肉）进行了统计分析。数据以均值形式显示 ， S.D. =， P < 0.05， 单向方差分析，带有后点位 Bonferroni 测试（n = 每组 3 个小鼠）。此图已修改权限11。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：不同震级的LCC对固定性引起的肌肉萎缩和炎症反应的影响。
（A） 通过改变圆柱形单元的重量，应用不同幅度的LCC。刻度条、1 s. 36-g、66-g 和 200 g 圆柱形单位分别产生 45 mmHg、50 mmHg 和 140 mmHg 肌肉压力波。（B） LCC应用对固定后肢的影响与36g、66g和200克圆柱形单位进行比较。LCC应用小腿的胃链肌纤维（左）和F4/80阳性细胞（右）的CSA被量化为与对照后肢的相对值，后者未暴露在LCC下。数据以均值形式显示 ， S.D. =， P < 0.05， 单向方差分析，带有后点位 Bonferroni 测试（n = 每组 4 个小鼠）。此图已修改权限11。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：LCC衰减固定引起的肌肉萎缩和炎症反应。
（A，B）通过LCC应用缓解固定性引起的肌肉萎缩。胃肠肌纤维（B）的CSA分析如图2B所示。数据以方法形式呈现 = S.D. *，P < 0.05;*，P < 0.01，单向方差分析，带后点位 Bonferroni 测试（n = 每组 6 个小鼠）。（C） 三头肌收缩力在固定后减少，LCC部分恢复。数据以均值形式显示 = S.D. =， P < 0.05， 配对学生 t 测试 （n = 4 小鼠用于控制，n = 5 小鼠用于固定组）。（D，E）抗MCP-1（绿色在D）、抗TNF-α（E中绿色）和抗F4/80（红色）免疫荧光染色的微图图像，无（中）和（下）LCC应用的动员（上）和固定后肢的胃肠肌染色在图2C，D.刻度条，100 μm. （F-H） 抗 MCP-1、抗TNF-α和抗F4/80免疫染色的定量。我们比较了固定后肢的小腿肌肉，有和没有LCC应用。数据以方法形式呈现 = S.D. *，P < 0.05;*，P < 0.01，单向方差分析，带后点位 Bonferroni 测试（n = 每组 6 个小鼠）。此图已修改权限11。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1：实验协议的原理表。请点击此处下载图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们描述了一种应用按摩样机械刺激的方法，这种方法具有抗炎作用。与之前报告的系统相比，我们的系统具有以下优势。首先，以前的研究没有定量定义施加的机械力2或根据人体表面的测量确定其幅度，而不是组织10内。相比之下，我们使用血压遥测仪测量肌肉压力。其次，我们设备的简单结构（图1B）使我们能够以相对较低的成本构建具有高一致性和可重复性的系统（图3A）。第三，我们的干预（LCC）与肌肉压力变化（50毫米汞柱15）相关的身体活动（轻度肌肉收缩）我们的方法将提供一个科学的基础，按摩样的干预作为一个可能的治疗/预防程序，减少缺乏身体活动的缺点16。
我们协议中最关键的步骤是定位鼠标后肢（协议步骤3.3）。我们需要在垂直于小腿肌肉的方向应用LCC;否则，肌肉组织将被部分挤压和损坏，即使使用66g圆柱形单位。
LCC方法的局限性包括麻醉的要求，可能对肌肉代谢产生一定的影响。此外，我们不能完全排除在LCC应用期间作为对剧烈冲击的反射引起的微小肌肉收缩的影响。
最后，我们已经证明，间质流体运动调解LCC效应11。我们可以通过修改循环压缩模式，更有效地诱导间质流动。例如，与当前研究中使用的锐利笔触相比，正弦模式的压缩可能更好。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明，与手稿没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢中桥K.、Hamamoto、N.Kume和K.Tsurumi在整个项目过程中一贯给予的支持。这项工作部分得到了日本厚生劳动省内部研究基金的支持;日本科学促进协会提供的科学研究援助赠款;MEXT支持私立大学战略研究基金会项目，2015-2019年，由日本教育、文化、体育、科学和技术部（S1511017）提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum wire | DAISO JAPAN | B028 | An aluminum wire is used to avoid escaping restriction by the wire |
| Blood pressure telemeter | Millar | SPR-671 | A blood pressure telemeter is used to mesure intramuscular pressure. |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI is a fluorescent probe which is commonly used to stain DNA for fluorescent microscopy. |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Dilution ratio, 1:500) | Invitrogen | A11034 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 568 (Dilution ratio, 1:500)) | Invitrogen | A11077 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| ImageJ | NIH | N/A | Analysis software for image |
| LabChart8 | ADInstrumens | Analysis software for acquiring biological signals. | |
| Prolong gold | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Prolong gold is for mounting stained samples. |
| Protein Block Serum-Free | Dako | X090930-2 | For blocking non-specific background staining in immunohistochemical procedures. |
| Rat monoclonal anti-laminin-2 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Sigma Aldrich | L0663 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rat monoclonal anti-F4/80 antibody (Dilution ratio, 1:500) | Abcam | ab6640 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-MCP-1 antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab25124 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Rabbit polyclonal anti-TNF-α antibody (Dilution ratio, 1:1000) | Abcam | ab66579 | Antibody for immunohistochemical staining. |
| Surgical tape | 3M Japan | 1530EP-0 | Surgical tape is used to restrict joint movement. |
References
- Furlan, A. D., Imamura, M., Dryden, T., Irvin, E. Massage for low back pain: an updated systematic review within the framework of the Cochrane Back Review Group. Spine. 34 (16), 1669-1684 (2009).
- Robertson, A., Watt, J. M., Galloway, S. D. R. Effects of leg massage on recovery from high intensity cycling exercise. British Journal of Sports Medicine. 38 (2), 173-176 (2004).
- Waters-Banker, C., Butterfield, T. A., Dupont-Versteegden, E. E. Immunomodulatory effects of massage on nonperturbed skeletal muscle in rats. Journal of Applied Physiology. 116 (2), 164-175 (2014).
- Haas, C., et al. Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model. Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (6), 1105-1112 (2013).
- Crane, J. D., et al. Massage therapy attenuates inflammatory signaling after exercise-induced muscle damage. Science Translational Medicine. 4 (119), 119ra113 (2012).
- Bove, G. M., Harris, M. Y., Zhao, H., Barbe, M. F. Manual therapy as an effective treatment for fibrosis in a rat model of upper extremity overuse injury. Journal of the Neurological Sciences. 361, 168-180 (2016).
- Andrzejewski, W., et al. Increased skeletal muscle expression of VEGF induced by massage and exercise. Folia Histochemica et Cytobiologica. 53 (2), 145-151 (2015).
- Mantovani Junior, N., et al. Effects of massage as a recuperative technique on autonomic modulation of heart rate and cardiorespiratory parameters: a study protocol for a randomized clinical trial. Trials. 19 (1), 459 (2018).
- Zeng, H., Butterfield, S., Agarwal, F., Haq, T., Zhao, Y. An engineering approach for quantitative analysis of the lengthwise strokes in massage therapies. Journal of Medical Devices. 2 (4), (2008).
- Wang, Q., et al. A mechatronic system for quantitative application and assessment of massage-like actions in small animals. Annals of Biomedical Engineering. 42 (1), 36-49 (2014).
- Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
- Onda, A., et al. A New mouse model of skeletal muscle atrophy using spiral wire immobilization. Muscle Nerve. 54 (4), 788-791 (2016).
- Luster, A. D.
- Reid, M. B., Li, Y. P. Tumor necrosis factor-α and muscle wasting: a cellular perspective. Respiratory Research. 2 (5), 269-272 (2001).
- Baumann, J. U., Sutherland, M. D., Hangg, A. Intramuscular pressure during walking: An experimental study using the wick catheter technique. Clinical Orthopaedics Related Research. 145, 292-299 (1979).
- Lee, I., et al. Effect of physical inactivity on major non-communicable diseases worldwide: an analysis of burden of disease and life expectancy. Lancet. 380, 219-229 (2012).
