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Summary

Patienten-abgeleitete Xenograft -Modelle (PDX) rekapitulieren die molekularen und biologischen Merkmale des Melanoms robuster und sind prädiktiver für die Therapiereaktion im Vergleich zu herkömmlichen auf Kunststoffgewebekulturen basierenden Assays. Hier beschreiben wir unser Standard-Betriebsprotokoll für die Etablierung neuer PDX-Modelle und die Charakterisierung/Experimentierung bestehender PDX-Modelle.

Abstract

Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass sich molekulare und biologische Eigenschaften in Melanomzellen unterscheiden, die in traditionellen zweidimensionalen Gewebekulturgefäßen angebaut werden, im Vergleich zu in vivo bei menschlichen Patienten. Dies ist auf die Engpassauswahl von klonalen Populationen von Melanomzellen zurückzuführen, die in Abwesenheit physiologischer Bedingungen in vitro robust wachsen können. Darüber hinaus spiegeln die Reaktionen auf die Therapie in zweidimensionalen Gewebekulturen insgesamt nicht die Reaktionen auf die Therapie bei Melanompatienten wider, wobei die Meisten klinischen Studien die Wirksamkeit therapeutischer Kombinationen nicht Vitro. Obwohl die Xenogtransplantation von Melanomzellen in Mäuse den physiologischen In-vivo-Kontext liefert, der in zweidimensionalen Gewebekultur-Assays fehlt, haben die für die Engraftmentierung verwendeten Melanomzellen bereits eine Engpassauswahl für Zellen durchlaufen, die unter zweidimensionale Bedingungen, wenn die Zelllinie festgelegt wurde. Zu den irreversiblen Veränderungen, die als Folge des Engpasses auftreten, gehören Veränderungen der Wachstums- und Invasionseigenschaften sowie der Verlust bestimmter Teilpopulationen. Daher können Modelle, die den menschlichen Zustand in vivo besser rekapitulieren, therapeutische Strategien besser vorhersagen, die das Gesamtüberleben von Patienten mit metastasierendem Melanom effektiv erhöhen. Die vom Patienten abgeleitete Xenograft-Technik (PDX) beinhaltet die direkte Implantation von Tumorzellen vom menschlichen Patienten zu einem Mausempfänger. Auf diese Weise werden Tumorzellen konsequent unter physiologischen Belastungen in vivo angebaut und erleiden nie den zweidimensionalen Engpass, der die molekularen und biologischen Eigenschaften bewahrt, die beim menschlichen Patienten vorhanden sind. Bemerkenswerte PDX-Modelle, die von Organstandorten von Metastasen (d. h. Gehirn) abgeleitet wurden, zeigen eine ähnliche metastasierende Kapazität, während PDX-Modelle, die von therapienaiven Patienten und Patienten mit erworbener Therapieresistenz (d. h. BRAF/MEK-Hemmertherapie) abgeleitet wurden, ähnliche Empfindlichkeit gegenüber der Therapie.

Introduction

Präklinische Modelle sind entscheidend für alle Aspekte der translationalen Krebsforschung, einschließlich der Charakterisierung von Krankheiten, der Entdeckung umsetzbarer Schwachstellen, die für Krebs im Vergleich zu normalen Zellen einzigartig sind, und der Entwicklung wirksamer Therapien, die diese Schwachstellen, um das Gesamtüberleben der Patienten zu erhöhen. Im Melanombereich wurden Zehntausende von Zelllinienmodellen stark für das Arzneimittelscreening genutzt, wobei >4.000 von unserer Gruppe allein beigesteuert wurden (WMXXX-Serie). Diese Zelllinienmodelle wurden von Melanompatienten mit verschiedenen Formen des kutanen Melanoms (d. h. acral, uveal und oberflächliche Ausbreitung) und verschiedenen Genotypen (d. h. BRAF^V600-mutant und Neuroblastom RAS viralen Onkogenhomolog [ NRAS ^Q61R-mutant]), die das Spektrum derKrankheit in der Klinik 1^,2.

Die erfolgreichste, zielgerichtetese Therapiestrategie im Melanombereich ist eindeutig aus der genomischen Charakterisierung von Tumoren von Patienten hervorgegangen, die BRAF-Mutationen bei 50 % der Melanome³ und aus 2) präklinischen Untersuchungen identifiziert. Nutzung der Melanom-Zelllinienmodelle⁴. Die KOMBINATION braF/MEK-Hemmer wurde 2014 von der Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von Patienten zugelassen, deren Melanome braF^{V600E/K-Mutationen} aktivieren und eine Ansprechrate von >75%^{von 5}aufweisen. Trotz dieser anfänglichen Wirksamkeit entsteht in fast jedem Fall eine Resistenz durch vielfältige intrinsische und erworbene Resistenzmechanismen und intratumorale Heterogenität. Leider rekapitulieren Zelllinienmodelle keine repräsentative biologische Heterogenität, wenn sie in zweidimensionaler Kultur in Kunststoffgefäßen angebaut werden, was ihr klinisch vorausschauendes Potenzial verschleiert, wenn Forscher versuchen, experimentell zu bestimmen Therapien, die bei Patienten mit einer bestimmten Form oder einem Genotyp des Melanoms wirksam sein könnten⁶. Das Verständnis, wie die intratumorale Heterogenität von Patienten am besten modelliert werden kann, wird es den Forschern ermöglichen, bessere therapeutische Modalitäten zu entwickeln, die therapieresistente Subpopulationen abtöten können, die das Scheitern aktueller Standardtherapien antreiben.

Der begrenzte Vorhersagewert von Zelllinienmodellen ist die Art und Weise, wie sie ursprünglich festgelegt werden. Irreversible Veränderungen treten in der klonalen Tumorlandschaft auf, wenn eine einzellige Suspension eines Patiententumors auf zweidimensionalen, plastischen Gewebekulturgefäßen angebaut wird, einschließlich Veränderungen des proliferativen und invasiven Potenzials, die Eliminierung spezifischer Subpopulationen und die Veränderung der genetischen Information⁷. Xenografts in Mäuse dieser Melanom-Zelllinienmodelle stellen die am häufigsten verwendete In-vivo-Plattform für präklinische Studien dar; Diese Strategie leidet jedoch auch unter der schlechten Rekapitulation komplexer Tumorheterogenität, die klinisch beobachtet wurde. Um dieses Manko zu überwinden, besteht ein wachsendes Interesse an der Integration ausgefeilterer präklinischer Melanommodelle, einschließlich des PDX-Modells. PDX-Modelle werden seit >30 Jahren verwendet, wobei wegweisende Studien an Lungenkrebspatienten eine Übereinstimmung zwischen dem Ansprechen der Patienten auf zytotoxische Wirkstoffe und der Reaktion des PDX-Modells vom selben Patienten 8 zeigten. In jüngster Zeit gab es den Antrieb, PDX-Modelle als Werkzeug der Wahl für präklinische Untersuchungen sowohl in der Industrie als auch in akademischen Zentren zu nutzen. PDX-Modelle sind aufgrund ihrer überlegenen Rekapitulation der Tumorheterogenität bei menschlichen Patienten klinisch relevanter für die Therapieoptimierung als Zelllinien-Xenografts⁹. Bei Melanomen gibt es immense Hürden, die das therapeutische Management fortgeschrittener Krankheiten stumpf machen¹⁰. Klinisch relevante PDX-Modelle wurden verwendet, um klinische Resistenzen zu modellieren und therapeutische Strategien mit klinisch verfügbaren Wirkstoffen zur Behandlung therapieresistenter Tumoren zu identifizieren^11,12. Kurz gesagt, das hier vorgestellte Protokoll zur Generierung von PDX-Modellen erfordert die subkutane Implantation von frischem Gewebe aus primären oder metastasierenden Melanomen (die durch Biopsie oder Operation gesammelt werden) in NOD/scid/IL2-Receptor NULL (NSG) Mäuse. Verschiedene Variationen des methodischen Ansatzes werden von verschiedenen Gruppen verwendet; es existiert jedoch ein grundlegender Kern¹³.

Protocol

Die folgenden Tierprotokolle folgen den Richtlinien der humanen Ethikkommission des Wistar-Instituts und den Richtlinien für Tierpflege. 1. Melanom-Tumorgewebe-Sammlung Sammeln Sie Tumorgewebe (als Passage 0 bezeichnet) von Melanompatienten durch eine der folgenden Chirurgischen oder Biopsiemethoden. Für chirurgisches Exzisionsgewebe mindestens 1 g Gewebe (Resektemetastasen und primäre Läsionen) in Transportspeichermedien (RPMI 1640 + 0,1% Pilzzone + 0,2% Gentamicin) bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren. Für chirurgisches Biopsiegewebe weniger als 1 g Gewebe (oft Punchbiopsien von subkutanen [s.c.] Metastasen und Lymphknotenmetastasen) in Transportspeichermedien bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren. Für Kernbiopsiegewebe einen Zylinder (Kern) gewebevon ca. 10 mm x 1 mm (oft Leberbiopsien) in ein 15 ml-Rohr mit 5 ml Transportspeichermedien bei 4 °C oder auf Eis auswaschen. Für Feinnadel-Aspirat (FNAs) Gewebe, halten Sie eine sehr kleine Menge an Gewebe (weniger als 1 mm größe) direkt vom Patienten in einer Nadel und Spritze bei 4 °C oder auf Eis genommen. Liefern Sie das Gewebe in Transportspeichermedien bei 4 °C oder auf Eis am selben Tag oder mit Übernachtversand nach chirurgischer Exzision oder Biopsie. Verarbeiten Sie das Gewebe innerhalb von 1-2 h der Lieferung. 2. Tumorgewebeverarbeitung für die Mausimplantation Chirurgische Exzision oder chirurgische Biopsiegewebeverarbeitung Übertragen Sie das Gewebe auf eine sterile Petrischale und trennen Sie das Tumorgewebe so weit wie möglich vom umgebenden normalen Gewebe. Entfernen Sie nekrotisches Gewebe (in der Regel als blass-weißliches Gewebe identifiziert, das sich zentral im Tumor befindet) aus dem verbleibenden Tumor so weit wie möglich. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen anfänglichen Tumorbrocken in etwa gleiche Stücke (3 mm x 3 mm) für die chirurgische Mausimplantation zu unterteilen (Abbildung2). Optional, wenn genügend Tumorgewebe verfügbar ist, schnappen Sie das Gewebe für nachgeschaltete Assays (RNA-Sequenzierung [RNASeq], ganze Exome-Sequenzierung [WES], etc.). Machen Sie eine Tumorschlämme, indem Sie das Tumorgewebe mit einer Kreuzklingentechnik mit zwei Skalpellklingen schneiden. Die Tumorbrocken so fein wie möglich zerkleinern, um eine Gülle zu bilden, die nun für die chirurgische Mausimplantation bereit ist. Alternativ, wenn das Tumorgewebe zu hart für die mechanische Dissoziation ist, verwenden Sie ein Verdauungsdissoziationsverfahren, um gelartige Gülle und eine einzellige Suspension für die Implantation und/oder Injektion zu bilden. Die Tumorbrocken so fein wie möglich zerkleinern, um Gülle zu bilden. Die Gülle in ein 50 ml Rohr mit kalter Hank-Ausgewogenheinlösung (HBSS)legen -/- (ohne Ca++ und Mg++); zentrifugieren und pellet bei 220 x g für 4 min bei 4 °C. Die Gülle in 10 ml erwärmtem frischverdautem Medium (200 U/ml Kollagenase IV + 5 mM CaCl2 + 50 U/mL DNase in HBSS-/-) pro 1 g Tumorgewebe wieder aufsetzen. Das Rohr 20 min in ein 37 °C-Wasserbad geben und alle 5 min mit einer Einwegpipette kräftig mischen. Waschen mit bis zu 50 ml HBSS-/-; zentrifugieren Sie dann bei 220 x g für 4 min bei 4 °C. Fügen Sie 5 ml vorgewärmtes TEG (0,025% Trypsin + 40 g/mL Ethylenglykol-bis(-Aminoethylether)-N,N,N’,N’-Tetraessigsäure [EGTA] + 10 g/ml Polyvinylalkohol [PVA]) pro 1 g Tumorgewebe hinzu, sanft wieder aufhängen/schütteln und das Rohr ohne Mischen 2 min bei 37 °C platzieren. Fügen Sie mindestens 1 gleiches Volumen kalter Färbungsmedien (1% Rinderserumalbumin [BSA] + 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure [HEPES] + 1x Penicillin-Streptomycin in L15-Medien hinzu, um Trypsin und Zentrifuge bei 220 x g für 4 min bei 4 ° c. Setzen Sie die Probe in 10 ml Färbemittel pro 1 g Tumorgewebe wieder auf und filtern Sie sie durch ein 40-m-Zell-Sieb, um eine einzellige Suspension für die Mausinjektion zu erhalten (Abbildung 2). Gülle, die auf dem Zellsieb verbleibt, kann auch für die chirurgische Mausimplantation gesammelt werden. C Erzbiopsie Gewebeverarbeitung Gießen Sie das Kernzylindergewebe in Gewebetransportrohr in eine 5 cm Petrischale. Überschüssige Flüssigkeit entfernen, Gewebe an den Rand der Petrischale kratzen, das Tumorgewebe fein zerkleinern, 100–150 L HBSS-/- auf das Tumorgewebe geben und die HBSS/Tumorgewebesuspension schnell in die 1 ml Spritze ziehen. Befestigen Sie eine 23 G Nadel an der 1 ml Spritze, übergeben Sie die HBSS/Tumorgewebesuspension durch die Nadel in ein 1,5 ml Spinrohr. Ziehen Sie die Tumorsuspension mit eingeschalteter Nadel in die Spritze, bis sie reibungslos durch die Nadel passieren kann. Ziehen Sie schließlich die Tumorsuspension wieder in die Spritze und lösen Sie die 23 G Nadel. Befestigen Sie eine 27 G Nadel und ziehen Sie ein gleiches Volumen (ca. 100–150 L) künstlicher extrazellulärer Matrix (siehe Materialtabelle)in die Spritze. Fügen Sie ein gleiches Volumen der künstlichen extrazellulären Matrix langsam in das 1,5 ml Spin-Rohr mit dem Tumor /HBSS-/- Suspension, sorgfältig die Bildung von Blasen zu vermeiden. Ziehen Sie ein letztes Mal zurück in die Spritze und das Kernbiopsietumorgewebe ist nun bereit für die Mausinjektion. FNA-Gewebeverarbeitung Legen Sie die Spritze mit den FNA-Proben (in der Nadel eingeschlossen) auf Eis. Trennen Sie die Nadel (mit FNA-Gewebe) von der Spritze und entfernen Sie den Kolben aus der Spritze, fügen Sie der Oberseite der Spritze 150–200 l HBSS-/- hinzu. Setzen Sie den Kolben wieder in die Spritze und die Nadel (mit FNA-Gewebe) und schieben Sie den HBSS-/- durch die Nadel in ein 1,5 ml Spinrohr. Dieser Schritt entfernt den FNA-Tumor aus der Nadel. Wiederholen Sie Schritt 2.3.3mit der HBSS-/- /FNA-Suspension zweimal mit derselben Spritze, um die Rückgewinnung von Tumorgewebe aus der Nadel zu maximieren. Fügen Sie dem 1,5 ml Spinröhrchen, das die HBSS/FNA-Suspension enthält, ein gleiches Volumen (ca. 100–150 l) künstlicher extrazellulärer Matrix hinzu. Durch langsames Aufzeichnen der künstlichen extrazellulären Matrix/HBSS-/-/FNA Suspension zurück in die 23 G Nadel mischen und zweimal wiederholen. Ziehen Sie die gesamte künstliche extrazelluläre Matrix/HBSS-/-/FNA-Volumen zurück in die Spritze, ersetzen Sie die 23 G Nadel durch eine 27 G Nadel, und die FNA-Probe ist nun für die Mausinjektion bereit. 3. Tumorimplantation und Injektion bei Mäusen Implantation von chirurgischer Exzision oder chirurgischem BiopsiegewebeHINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren oder die Verwendung von vorsterilisierten Einweginstrumenten steril sind. Rasieren Sie Haare von der unteren Rückseite von NSG 6-8 Wochen männlichen oder weiblichen Mäusen und hinterlassen Sie eine ca. 1,5 cm x 3 cm Fläche ohne Haare. Anästhesisieren Sie Mäuse mit Isofluran, und bestätigen Sie, indem Sie den Fuß sanft als Test der Reaktionsfähigkeit drücken. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf ihren Augen, um Trockenheit zu verhindern. Legen Sie einzelne Mäuse auf ein Heatpad in den Nasenkegel der Anästhesiemaschine, schrubben Sie den rasierten Bereich mit Chlorhexidin. Dann mit 70% Ethanol dosieren und verdampfen lassen. Bereiten Sie Stücke vor oder teilen Sie Tumorschlämme in einer Petrischale in einzelne Hügel für die chirurgische Implantation auf (d. h. in drei gleiche Hügel, wenn sie in 3 Mäuse implantiert werden sollen). Mit dem Skalpellklinge, machen Sie einen Schnitt von etwa 5 mm lang auf der Mitte der Rückseite der Maus, nehmen Sie ein Paar Zange und heben Sie die Haut auf der Seite des Schnittes gegenüber dem Bediener. Nehmen Sie die Schere in die andere Hand und trennen Sie die Haut von der Muskelschicht, indem Sie die Faszienmembran mit kleinen Scherenschnitten sanft schneiden und so eine “Tasche” für das Tumorgewebe schaffen. Nehmen Sie einen Tumorbrocken oder einen einzelnen Hügel tumorgüllegewebe mit der Skalpellklinge auf und legen Sie das Gewebe vorsichtig in die erstellte Tasche. Verabreichen Sie 100 l künstliche extrazelluläre Matrix auf dem Tumorgewebehügel in der Tasche. Ziehen Sie mit zwei Zangenpaaren den Schnitt an beiden Enden hoch, so dass die Wundkanten nahe beieinander liegen, und schließen Sie die Wunde, indem Sie ein oder zwei Wundclips auftragen. Subkutane Injektion 1-5 mg/kg Meloxicam als Schmerzmittel bei Mäusen nach der Operation. Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel und legen Sie sie wieder in ihren ursprünglichen Käfig, beobachten Sie die Maus beim Aufwachen. Kehren Sie nicht in einen Käfig zurück, bis er vollständig geborgen ist. Entfernen Sie Diewundclips nach ca. 7 Tagen. Wenn die Heilung nach 7 Tagen nicht abgeschlossen ist, lassen Sie den Wundclip für weitere ein oder zwei Tage ein.HINWEIS: Bei Verwendung einer einzelzelligen Suspension aus chirurgischer Exzision oder chirurgischer Biopsiegewebeverarbeitung mischt sie sich mit künstlicher extrazellulärer Matrix (im Verhältnis 1:1) für die Injektion von Mäusen. Injektion von FNA- oder Kernbiopsiegewebe Legen Sie eine NSG-Maus auf ein Stahlgitter, halten Sie die Maus fest am Schwanz und ziehen Sie die Maus vorsichtig zurück. Es wird das Gitter mit seinen Vorderbeinen fest greifen. Alternativ können Sie eine Maus in der nicht-dominanten Hand zurückhalten und den Flankenbereich sichtbar machen. Desinfizieren Sie die Haut der Flanke mit Alkohol-Prep-Tupfer, langsam und stetig injizieren Den Inhalt der Spritze unter die Haut der Maus. Ziehen Sie die Nadel heraus und legen Sie die Maus wieder in ihren Käfig. 4. Überwachung des Tumorwachstums Überwachen Sie Mäuse einmal wöchentlich, um auf spürbare Tumore zu überprüfen. Sobald Die Tumoren eine messbare Größe haben (ca. 50 mm3), verwenden Sie einen Bremssattel, um Tumorabmessungen aufzuzeichnen. Verwenden Sie die folgende Formel, um Tumorvolumen zu berechnen: (Breite x Breite x Länge) / 2. Erntetumor, sobald das Tumorvolumen etwa 1,5 cm3 (ca. 4–10 Wochen) erreicht. Der Tumor wird jetzt Mausdurchgang 1 (MP1) genannt. 5. Erntetumor für Bankgewebe, Reimplantation und Experiment/Charakterisierung Euthanisieren Sie die Maus in einer CO2-Kammer, überprüfen Sie Vitalzeichen, um den Tod zu bestätigen, und tauchen Sie die Maus dann in eine Virkon-Lösung ein, um die Haut für 30 s im Bio-Schrank zu sterilisieren. Verwenden Sie gekrümmte Scheren und chirurgische Zangen, um die Haut neben dem Tumor zu heben und einen horizontalen Schnitt zu machen. Verwenden Sie eine stumpfe Trenntechnik, um die Haut auf beiden Seiten des Tumors und über den Tumor zu mobilisieren und den Tumor freizulegen. Verwenden Sie eine Schere oder eine Skalpellklinge, um den Tumor von der Faszie zu trennen. Resektieren Sie den Tumor und übertragen Sie den Tumor auf eine sterile Petrischale, schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke und entfernen Sie nekrotisches Gewebe aus dem Tumor. Banktumorgewebe für zukünftige Implantation. Nehmen Sie 2-3 kleine Tumorstücke kleiner als 10 mm x 10 mm und zerkleinern Sie sie in Stücke kleiner als 1 mm x 1 mm. Übertragen Sie das gesamte gehackte Gewebe in eine 2 ml kryogene Durchstechflasche, fügen Sie 1 ml Gefriermedium (10% DMSO + 90% FBS) hinzu. Gut mischen und kryogene Fläschchen in einen vorgekühlten Isopropanol-basierten Zellgefrierbehälter auf Trockeneis legen. Behälter in -80 °C Gefrierschrank über Nacht lagern und dann kryogene Fläschchen in flüssigen Stickstoff (LN2) Lagerung übertragen. Snap-Freeze-Gewebe für nachgeschaltete Assays (RNASeq, WES, etc.). Tumorgewebestücke (ca. 3 mm x 3 mm) in eine kryogene Durchstechflasche geben und die kryogene Durchstechflasche sofort in LN2 legen. Fläschchen in -80 °C Gefrierschrank lagern. 6. PDX-Therapiestudien HINWEIS: Es wird zwei Expansionsphasen dauern, um genügend Tumorgewebe zu wachsen, um die notwendige Anzahl von PDX-tragenden Mäusen für die Therapiestudie zu erzeugen. Nehmen Sie ein Kryovial mit bankiertem PDX-Gewebe von LN2auf und legen Sie den Kryovial in ein 37 °C-Wasserbad, bis das gefrierende Medium, das das Tumorgewebe enthält, gerade zu schmelzen beginnt. Leeren Sie den Inhalt des Kryovials in vorgewärmte HBSS-/- in einem 50 ml Rohr und waschen Sie Gewebe. Pelletgewebe durch Zentrifugation für 5 min bei 1.200 U/min. Entfernen Sie HBSS-/- aus der Tumorprobe durch Vakuumaspiration mit einer Pasteur Pipette. Das PDX-Gewebe aus dem 50 ml-Rohr in eine 5 cm oder 10 cm Petrischale schieben und auf nasses Eis legen. Folgen Sie dem obigen Implantationsprotokoll, um bankiertes Gewebe aus einer kryogenen Durchstechflasche in 5 NSG-Mäuse für die erste Runde der PDX-Tumorexpansion zu implantieren. Sobald Die Tumoren 600–800 mm3erreichen, ernten Sie 1-2 Tumoren, um eine einzellige Suspension mit dem obigen Protokoll für die Tumorgewebeverarbeitung zu erhalten: mechanische Dissoziation, Kollagenase-Verdauungsdissoziation. Pelletzellen und Resuspend in 6 ml HBSS-/-/künstliche extrazelluläre Matrix (1:1 Verhältnis), subkutane Injektion 50 NSG-Mäuse, mit 100 l Zellmischung pro Maus für die zweite Runde der PDX-Tumorexpansion. Messen Sie die Tumorgröße mit Sätteln alle zwei Wochen. Warten Sie in 3-5 Wochen auf eine Tumorgröße von 100 mm 3, randomisieren Sie Mäuse in Gruppen und beginnen Sie mit der Behandlung. Wenn die Tumorgröße das maximale IACUC-zugelassene Volumen erreicht, beenden Sie die Behandlung. Folgen Sie dem obigen Erntetumor-Protokoll, um Snap-gefrorene Tumorstücke, Tumorstücke für Paraffinblöcke zu sammeln.

Representative Results

Tumorgewebe für Melanom-PDX-Modelle kann aus einer Vielzahl unterschiedlicher Quellen stammen und kann auch pro Wachstumsdynamik einzelner Modelle und der gewünschten Verwendung des PDX-Gewebes verarbeitet werden. Die Priorität bei der Erstellung eines PDX-Modells besteht darin, über genügend Material für die zukünftige Verwendung und DNA für die Charakterisierung zu verfügen (Abbildung 1). Sobald genügend Material auf der Bank liegt, kann Tumorgewebe in…

Discussion

Wir haben hier in beschrieben, dass PDX-Modelle von Melanomen mit Patientengewebe aus primären und metastasierenden Tumoren, Kernbiopsien und FNAs generiert werden. Bei direkter Eindringung in NSG-Mäuse stellen Tumoren ähnliche morphologische, genomische und biologische Eigenschaften dar wie die beim Patienten beobachteten. In dem Fall, in dem den Forschern nur eine geringe Menge Gewebe zur Verfügung steht, wie es bei FNAs häufig der Fall ist, ermöglicht die PDX-Technik die Erweiterung des Tumorgewebes für die DNA…

Materials

1 M Hepes	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Cat # 15140163
1x HBSS-/- (w/o Ca++ or Mg++)	MED	Cat # MT21-023-CV
2.5% Trypsin	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # T4549-100ML	10 mL aliquots stored at –20oC
BSA	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # A9418-500G
Chlorhexidine	Fisher Scientific	Cat# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	Worthington	Cat #4189	make up in HBSS-/- from Collagenase IV powder stock (Worthington #4189, u/mg indicated on bottle and varies with each lot); freeze 1
DMSO	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # C6295-50ML
DNase	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # D4527
EGTA (ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N’N’-tetraacetic acid)	Merck	Cat # 324626.25
FBS	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 16000-044
Fungizone	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	Cat # 15290-018
Gentamicin	FISHER SCIENTIFIC	Cat # BW17518Z
Isoflurane	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH	Cat # 050031
Leibovitz's L15 media	Invitrogen	Cat # 21083027
Matrigel	Corning	Cat # 354230	Artificial extracellular matrix
Meloxicam	HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # ::Henry Schein	Cat # 025115	1-5mg/kg, as painkiller
NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG) Mice	The Wistar Institute, animal facility		breeding
PVA (polyvinyl alcohol)	SIGMA-ALDRICH CORPORATION	Cat # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine	Fisher Scientific	Cat# MT10041CM
Scalpel	Feather	Cat # 2976-22
Virkon	GALLARD-SCHLESINGER IND	Cat # 222-01-06
Wound clips	MikRon	Cat #427631