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Methodenartikel

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

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DOI:

10.3791/59519

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16. Mai 2019

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1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Kultivierte Primär-oder etablierte Zelllinien werden häufig verwendet, um grundlegende biologische und mechanistische Fragen als ersten Ansatz anzugehen, bevor tierische Modelle verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie ganze Zellextrakte und subzelluläre Bruchteile für Studien über Zink (Zn) und andere Spurenelemente mit atomarer Absorbationsspektroskopie vorbereitet werden.

Zusammenfassung

Transition Metalle sind essenzielle Mikronährstoffe für Organismen, können aber für Zellen in hohen Konzentrationen giftig sein, indem sie mit physiologischen Metallen in Proteinen konkurrieren und redox-Stress erzeugen. Pathologische Zustände, die zu Metallverkleidungen oder Anhäufungen führen, sind ursächliche Mittel verschiedener menschlicher Krankheiten. Einige Beispiele sind Anämie, Akrodermitis enteropathica und Wilsons und Menkes ' Erkrankungen. Daher ist es wichtig, in der Lage zu sein, das Niveau und den Transport von Übergangsmetallen in biologischen Proben mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit zu messen, um die Forschung zu erleichtern, um zu untersuchen, wie diese Elemente zu normalen physiologischen Funktionen beitragen und Toxizität. Zink (Zn) etwa ist ein Kofaktor in vielen Säugetierproteinen, nimmt an Signalveranstaltungen teil und ist ein sekundärer Bote in Zellen. Im Übermaß ist Zn giftig und kann die Aufnahme anderer Metalle hemmen, während es ein Defizit hat, kann es zu einer Vielzahl potenziell tödlicher Bedingungen führen.

Die atomare Absorptionsspektroskopie des Graphitofens (GF-AAS) bietet eine hochsensible und effektive Methode zur Bestimmung von Zn und anderen Übergangsmetallkonzentrationen in verschiedenen biologischen Proben. Die elektrothermische Atomisierung über GF-AAS quantifiziert Metalle, indem sie kleine Mengen von Proben für die anschließende selektive Absorptionsanalyse mit einer Wellenlänge der Anregung des Elementes des Interesses atomisiert. Im Rahmen der Linearität des Beer-Lambert-Gesetzes ist die Aufnahme von Licht durch das Metall direkt proportional zur Konzentration des Analyten. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Bestimmung des Zn-Gehalts erkennt GF-AAS sowohl freie als auch komplexe Zn in Proteinen und möglicherweise in kleinen intrazellulären Molekülen mit hoher Empfindlichkeit in kleinen Probenvolumina. Darüber hinaus ist GF-AAS auch leichter zugänglich als induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) oder synchrotronbasierte Röntgenfluoreszenz. In dieser Methode wird die systematische Probenvorbereitung verschiedener kultierter Zelllinien für Analysen in einem GF-AAS beschrieben. Variationen dieses Spurenelementes wurden sowohl in ganzen Zelllysaten als auch in subzellulären Bruchteilen von vermehrenden und differenzierten Zellen als Beweis für das Prinzip verglichen.

Einleitung

Transition und Schwermetalle wie Zn, Cu, Mn und Fe finden sich naturgemäß in der Umwelt sowohl bei Nährstoffen in Lebensmitteln als auch bei Schadstoffen. Alle Lebewesen benötigen unterschiedliche Mengen dieser Mikronährstoffe; Die Exposition gegenüber hohen Werten ist jedoch schädlich für Organismen. Die Metallergewinnung erfolgt vor allem über die Diät, aber Metalle können auch über die Haut1,2, 3,4,5 eingeatmet oder aufgenommen werden. Es ist wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein von Metallen in atmosphärischen Partikeln zunimmt und weitgehend mit Gesundheitsrisiken in Verbindung gebracht wurde. Aufgrund von anthropogenen Aktivitäten wurden erhöhte Schwermetallwerte wie Ag, As, Cd, Cr, Hg, Ni, Fe und Pb in atmosphärischen Feinstaub, Regenwasser und Boden6,7festgestellt. Diese Metalle haben das Potenzial, mit wesentlichen physiologischen Spurenelementen, insbesondere Zn und Fe, zu konkurrieren, und sie führen zu toxischen Effekten, indem sie grundlegende Enzyme für biologische Prozesse inaktivieren.

Das Spurenelement Zn ist redox-neutral und verhält sich als Lewis-Säure in biologischen Reaktionen, was es zu einem grundlegenden Kofaktor macht, der für die Proteinfaltung und Katalysatoraktivität inüber 10% der Säugetierproteine 8,9 notwendig ist. 10; Daher ist es für die verschiedenen physiologischen Funktionen8,11unerlässlich. Wie bei vielen Spurenelementen gibt es jedoch ein empfindliches Gleichgewicht zwischen diesen Metallen, das eine normale physiologische Funktion ermöglicht und Toxizität verursacht. Bei Säugetieren führen Zn-Mängel zu Anämie, Wachstumsverzögerung, Hypogonadismus, Hautanomalien, Durchfall, Alopezie, Geschmacksstörungen, chronischen Entzündungen und beeinträchtigten Immun-und neurologischen Funktionen11, 12, 13,14, 15, 16,17,18. Darüber hinaus ist Zn zytotoxisch und beeinträchtigt die Aufnahme anderer essentieller Metalle wie Kupfer19, 20,21.

Darüber hinaus haben einige Metalle wie Cu und Fe das Potenzial, an schädlichen Reaktionen teilzunehmen. Die Produktion von reaktiven Sauerstoffarten (ROS) über die Fenton-Chemie kann die Ansammlung von Eisenglupelclubproteinen stören undden Fettstoffwechsel 22,23,24verändern. Um diesen Schaden zu verhindern, nutzen Zellen metallbindende Begleitpersonen und Transporter, um toxische Wirkungen zu verhindern. Zweifellos muss die Metall-Homöostase streng kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass bestimmte Zelltypen das richtige Niveau der Metalle beibehalten. Aus diesem Grund ist es wichtig, Techniken zur genauen Messung von Spurenmetallen in biologischen Proben voranzutreiben. In Entwicklungs-und Reifungsorganismen besteht ein differenzierter biologischer Bedarf an Spurenelementen auf zellulärer Ebene, in verschiedenen Entwicklungsstadien und in normalen und pathologischen Bedingungen. Daher ist eine genaue Bestimmung des Gewebes und der systemischen Metallwerte notwendig, um die organisatorische Metall-Homöostase zu verstehen.

Graphitofen Atomabsorptionsspektrometrie (GF-AAS) ist eine hochempfindliche Technik, die für kleine Probenmengen verwendet wird, so dass sie ideal ist, um Übergänge und Schwermetalle zu messen, die in biologischen und ökologischen Proben 25,26 vorhanden sind. , 27 , 28. Außerdem hat sich aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Technik gezeigt, dass sie geeignet ist, die Feintransporteigenschaften von Na+/-ATPase und Mage H+/ATPase mit Xenopus zu untersuchen. Eizellen als Modellsystem29. In GF-AAS absorbieren die atomisierten Elemente innerhalb einer Probe eine Wellenlänge der Strahlung, die von einer Lichtquelle emittiert wird, die das Metall von Interesse enthält, wobei die absorbierte Strahlung proportional zur Konzentration des Elements ist. Die elementare elektronische Erregung erfolgt bei der Aufnahme von ultravioletter oder sichtbarer Strahlung in einem quantisierten Prozess, der für jedes chemische Element einzigartig ist. In einem einzigen Elektronenprozess besteht die Aufnahme eines Photons durch ein Elektron, das sich von einem niedrigeren Energieniveau auf eine höhere Ebene innerhalb des Atoms bewegt, und GF-AAS bestimmt die Menge der Photonen, die von der Probe absorbiert werden, was proportional zur Anzahl der Strahlung ist, die absorbiert. Elemente, die im Graphitrohr zerstäubt sind.

Die Selektivität dieser Technik beruht auf der elektronischen Struktur der Atome, in denen jedes Element eine spezifische absorption/emissionsspektrale Linie hat. Bei Zn beträgt die Absorbance-Wellenlänge 213,9 nm und kann sich exakt von anderen Metallen unterscheiden. Insgesamt kann GF-AAS verwendet werden, um Zn mit adäquaten Grenzen der Erkennung (LOD) und hoher Empfindlichkeit undSelektivität 25 zu quantifizieren. Die Veränderungen in der absorbierten Wellenlänge werden integriert und als Spitzen der Energieaufnahme an bestimmten und isolierten Wellenlängen dargestellt. Die Konzentration des Zn in einer bestimmten Probe wird in der Regel aus einer Standardkurve bekannter Konzentrationen nach dem Beer-Lambert-Gesetz berechnet, in der die Absorption direkt proportional zur Zn-Konzentration in der Probe ist. Die Anwendung der Beer-Lambert-Gleichung auf GF-AAS-Analysen stellt jedoch auch einige Komplikationen dar. So können beispielsweise Schwankungen in der Atomisierung und in den nicht-homogenen Konzentrationen der Proben die Metallmessungen beeinflussen.

Die für die Elementaranalyse der GF AAS-Spur erforderliche Metallatomisierung besteht aus drei grundlegenden Schritten. Der erste Schritt ist die Verwüstung, bei der das flüssige Lösungsmittel verdampft wird; Trockene Verbindungen nach dem Ofen erreichen eine Temperatur von etwa 100 ° C. Dann werden die Verbindungen verdampft, indem sie von 800 bis 1.400 ° C (je nach zu analysierendes Element) erhitzt werden und zu einem Gas werden. Schließlich werden die Verbindungen im gasförmigen Zustand mit Temperaturen von 1.500 bis 2.500 ° C atomisiert. Wie bereits erwähnt, werden die zunehmenden Konzentrationen eines Metalls von Interesse proportional auf die vom GF-AAS festgestellte Absorption steigen, aber der Ofen reduziert den dynamischen Analysebereich, der den Arbeitsbereich der Konzentrationen darstellt, die sein können. Vom Instrument bestimmt. So erfordert die Technik niedrige Konzentrationen und eine sorgfältige Bestimmung des dynamischen Bereichs der Methode, indem die LOD und die Grenze der Linearität (LOL) des Bier-Lambert-Gesetzes festgelegt werden. Die LOD ist die Mindestmenge, die für die Erkennung eines Stoffes benötigt wird, definiert als das Dreifache der Standardabweichung von Zn in der Matrix. Die LOL ist die maximale Konzentration, die mit Beer-Lambert-Gesetz erkannt werden kann.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Standardmethode zur Analyse der Zn-Werte in ganzen Zellextrakten, zytoplasmatischen und nuklearen Brüchen und in der Vermehrung und Differenzierung kultivierter Zellen (Abbildung1). Wir haben die schnelle Isolierung des Kernprotokolls an verschiedene Zellsysteme angepasst, um den Metallverlust während der Probenvorbereitung zu verhindern. Die verwendeten zellulären Modelle waren primäre Myoblasten, die von Satellitenzellen der Maus abgeleitet wurden, Murine neuroblastoma-Zellen (N2A oder Neuro2A), Murine 3T3 L1-Adipozyten, eine menschliche nicht-tumorische Brustepithelzelllinie (MCF10A) und epitheliale Madin-Darby-Kaninchen-Niere ( MDCK) Zellen. Diese Zellen wurden aus verschiedenen Linien hergestellt und sind gute Modelle für die Untersuchung von linearahmen spezifischen Variationen von Metallstufen in vitro.

Primäre Myoblasten, die von Maus-Satelliten abgeleitet werden, stellen ein gut geeignetes In-vitro-Modell dar, um die Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen. Die Proliferation dieser Zellen ist schnell, wenn sie unter hohen Serumbedingungen kultiviert werden. Die Differenzierung in die muskuläre Abstammung wird dann durch niedrige Serumbedingungen 30 induziert. Das Murin-Neuroblastom (N2A), das eine Zelllinie festgestellt hat, wurde aus dem neuronalen Kamm der Maus abgeleitet. Diese Zellen präsentieren neuronale und amoeboide Stammzellmorphologie. Bei Differenzierungsreizen weisen die N2A-Zellen mehrere Eigenschaften von Neuronen auf, wie Neurofilamente. N2A-Zellen werden zur Untersuchung der Alzheimer-Krankheit, des Neuriten-Auswuchsesundder Neurotoxizität 31,32,33eingesetzt. Die 3T3-L1-Murin-Pre-Adipozyten etablierte Zelllinie wird häufig verwendet, um die metabolischen und physiologischen Veränderungen zu untersuchen, die mit der Adipogenese verbunden sind. Diese Zellen stellen eine fibroblast-ähnliche Morphologie dar, die aber einmal zur Differenzierung angeregt wurde, und eine enzymatische Aktivierung, die mit der Fettsynthese und der Ansammlung von Triglyceriden einhergeht. Dies kann als morphologische Veränderungen beobachtet werden, um zytoplasmatische Lipidtröpfchen 34,35zu produzieren. MCF10A ist eine nicht-tumormammäre Epithelzelllinie, die von einer prämenopausalen Frau mit einer fünflimafibrozystischen Erkrankung 36 abgeleitet wird. Es wurde für biochemische, molekulare und zelluläre Studien im Zusammenhang mit Säugetierkarzinogenese wie Proliferation, Zellmigration und Invasion verwendet. Die Ipithelzelllinie der Madin-Darby-Kaninchen-Niere (MDCK) wurde ausgiebig verwendet, um die Eigenschaften und molekularen Ereignisse zu untersuchen, die mit der Etablierung des epithelialen Phenotyps verbunden sind. Nach dem Erreichen des Zusammenflusses werden diese Zellen polarisiert und stellen Zellzelle-Klebstoffe, Eigenschaften des Säugetierepithelgewebes 37, her.

Um die Fähigkeit von AAS zu testen, die Zn-Werte in Säugetierzellen zu messen, analysierten wir ganze und subzelluläre Bruchteile (Cytosol und Kern) dieser fünf Zelllinien. AAS-Messungen zeigten unterschiedliche Konzentrationen von Zn in diesen Zelltypen. Die Konzentrationen waren bei der Vermehrung und Differenzierung der primären Myoblasten (4 bis 7 nmol/mg Eiweiß) geringer als bei den vier etablierten Zelllinien (von 20 bis 40 nmol/mg Eiweiß). Bei der Differenzierung von primären Myoblasten und Neuroblastom-Zellen im Vergleich zu den sich vermehrenden Zellen wurde ein kleiner, nicht signifikanter Anstieg des Zn-Niveaus festgestellt. Der gegenteilige Effekt wurde bei differenzierten Adipozyten festgestellt. Die sich vermehrenden 3T3-L1-Zellen wiesen jedoch im Vergleich zu den differenzierten Zellen höhere Konzentrationen des Metalls auf. Wichtig ist, dass in diesen drei Zelllinien die subzelluläre Fraktionierung zeigte, dass Zn je nach Stoffwechselzustand dieser Zellen differenziert im Zytosol und Kern verteilt ist. Bei der Vermehrung von Myoblasten, N2A-Zellen und 3T3-L1-Voradipozyten ist beispielsweise ein Großteil des Metalls auf den Kern lokalisiert. Bei der Induktion der Differenzierung durch spezifische Zellbehandlungen lokalisierte sich Zn in diesen drei Zelltypen auf das Zytosol. Interessanterweise zeigten beide epithelialen Zelllinien während der Proliferation höhere Konzentrationen von Zn im Vergleich zu beim Erreichen des Zusammenflusses, bei dem sich ein charakteristisches, enges Monolayer bildete. Bei sich vermehrenden Epithelzellen hatte die Säugetierzelllinie MCF10A eine gleichmäßige Zn-Verteilung zwischen Zytosol und Kern, während sich in der nierieabgeleiteten Zelllinie der größte Teil des Metalls im Zellkern befand. Bei diesen beiden Zelltypen, als die Zellen den Zusammenfluss erreichten, befand sich Zn vorwiegend bis zum Zytosol. Diese Ergebnisse zeigen, dass GF-AAS eine hochsensible und präzise Technik ist, um Elementaranalysen in ertragreichen Proben durchzuführen. GF-AAS gekoppelt mit subzellulärer Fraktionierung und kann angepasst werden, um die Ebenen von Spurenmetallelementen in verschiedenen Zelllinien und Geweben zu untersuchen.

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Protokoll

1. Säugetierzellkultur

  1. Allgemeine Überlegungen
    1. Befolgen Sie die aseptischen Techniken für Säugetierzellkultur, die zuvor überprüft38.
    2. Halten Sie alle Zelllinien in einem befeuchteten 5% CO2 Inkubator bei 37 ° C. Die Bedingungen für die Zellkultur variieren für jeden Zelltyp. Es ist wichtig, für jede verwendete Zelllinie angemessene Kulturbedingungen zu erhalten, da Variationen dieser Verfahren zu aberwitzigen Phenotypen und zum Scheitern der Zellkultur führen.
    3. Stellen Sie sicher, dass Sie mit der Zelllinie des Interesses vertraut sind, und folgen Sie den Protokollen, die für jeden Zelltyp vorgesehen sind, der für bestimmte Experimente ausgewählt wurde (siehe einige Beispiele unten).
  2. Allgemeines Verfahren für Trypsinierung und Durchlauf von anhaftenden Zellen
    1. Entfernen Sie die Zellkulturmedien von der Kulturplatte aus, indem Sie sie begreifen.
    2. Die Zellen mit PBS schonend ohne Kalzium und Magnesium waschen (5 mm pro 10 cm 2 Kulturfläche) . Fügen Sie die Waschlösung an der Seite des Tellers hinzu, um zu vermeiden, dass sich die Zelle Monolayer ablöst; Wirbeln Sie die Platte, um die Abdeckung der Lösung zu maximieren. Für Epithelzellen ist es notwendig, die Zellen 10 bis 15 Minuten im Inkubator bei 37 ° C in PBS zu inkubieren, um die Zelldissoziation in den folgenden Schritten zu erleichtern.
    3. Entfernen Sie die Waschlösung nach Aspiration.
    4. Fügen Sie der Platte genügend Dissoziationsreagenz (0,25% Trypsin) hinzu (ca. 0,7 ml pro10 cm 2). Die Platte wird sanft geschwirrt, um eine vollständige Abdeckung des Zellmonolayers zu erhalten.
    5. Die Kultur bei Raumtemperatur 2 bis 5 min beleben. Die tatsächliche Inkubationszeit variiert mit der verwendeten Zelllinie, bei Epithelzellen wird empfohlen, 10 bis 15 Minuten im Inkubator bei 37 ° C zu inkubieren. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop für die Zellablösung.
    6. Wenn sich die meisten Zellen gelöst haben, können Sie die Zellaufhängung in 5 mL des vorgewärmten Platten-oder Wachstumsmediums zurückgewinnen (siehe unten für einige Beispiele). Die Zellklumpen mechanisch trennen, indem man den Zellmonolayer mehrmals kippt.
    7. Die Zellaufhängung auf ein 15 mL konisches Rohr übertragen und mit 1.000 x g für 2 bis 5 min zentrifugen. Die Zentrifugation Geschwindigkeit und Zeit variieren je nach Zelltyp. Entfernen Sie die Medien durch sanfte Aspiration, wobei darauf geachtet wird, das Zellpellet nicht zu berühren. Das Zellpellet in 5 bis 10 ml des entsprechenden vorgewärmten Wachstumsmediums wiederverwenden und eine Probe zum Zählen mit einem Hämodizytometer oder einem automatischen Zellzähler entfernen.
    8. Nutzen Sie das entsprechende Volumen der Zellaufhängung, um die empfohlene Dichte für jede bestimmte Zelllinie zu säen (siehe unten für einige Beispiele). Ergänzen Sie mit dem entsprechenden Volumen der Kulturmedien je nach Größe des Kulturgerichts und legen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.
  3. Primäre Myoblasten, die von den Satellitenzellen der Maus abgeleitet werden
    1. Vor dem Start, bereiten Sie collagenbeschichtete Platten für das primäre Myoblast-Wachstum vor. Eine Lösung, die 0,02% Kollagen und 0,05 M Essigsäure im deionisierten Wasser enthält, muss durch Filtration mit einem 0,22 μm sterilen Filtergerät sterilisiert werden. Inkubieren Sie die Kulturplatten mit der Kollagen-Lösung über Nacht bei 37 ° C.
    2. Am nächsten Tag die Kollagenlösung absaugen, die Platten im sterilen Schrank trocknen lassen und bis zum Gebrauch bei 4 ° C aufbewahren.
      Hinweis: Die minimalen Kollagenmengen sind: Für 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.
    3. Saatgutprimär Myoblasten bei 1 x 104 Cells/2 in 55 cm2 mit Kollagen-beschichteten Kulturplatten. Die Proliferationsmedien sind Dulbeccos Modified Eagle es Medium (DMEM)/Ham es F12 Nährstoffmischung Culture Medien, die 20% fetalen Rinderserum (FBS) enthalten, 25 ng/mL rekombinanter, faserstilvoller Wachstumsfaktor (FGF) und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin.
      NOTE: Vermehrung und Lagerzellen sollten unter 50% der Durchflusses gehalten werden. Der Zellkontakt führt dazu, dass sich die Zellen der myogenen Differenzierung verpflichtet fühlen und die Wachstumsfähigkeit der Kultur beeinträchtigen.
    4. Für die Differenzierung der primären Myoblasten, lassen Sie die Zellen zu 80% bis 100% Konfluenz, die in der Regel nach 48 h der Beschichtung auftritt. Dann ändern Sie sich zu Differenzierungsmedien (DMEM, 2% Pferdeserum, 1% Insulin, Transferrin, Selen A-Zuschlag, und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin). Erfrischen Sie die Medien täglich bis zur Ernte.
  4. Murine neuroblastoma (N2A)
    1. Platte N2A Zellen mit einer Dichte von 2 x 104 cells/cm2 in Wachstumsmedien, Enthalten eine Mischung aus reduziertem Serum medium/DMEM mit hoher Glukose und L-Glutamin (1:1, v:v), ergänzt mit 10% FBS und 100 U/mL Penicillin/streptomycin. Die Aktienkultur unter 50% Verwirrung halten.
    2. Die Instierdifferenzierung der N2A-Zellen erreichte einst die Durchflusskretion von 25% bis 40%. Umstellung auf Differenzierungsmedien, die eine Mischung aus reduziertem Serum medium/DMEM, 1% FBS und 20 μM Retinosäure für 7 bis 10 Tage enthalten. Erfrischen Sie die Medien jeden zweiten Tag bis zur Zellernte.
      NOTE: Wenn sich N2A-Zellen unterscheiden, werden einige Zellen rund, lösen sich leicht auf und können sich einer Apoptose unterziehen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Kulturmedien auf die Teller setzen.
  5. 3T3 L1 murine vor adipozyten
    1. Pfalten Sie die Maus 3T3/L1-Zellen in DMEM mit hoher Glukose, ergänzt mit 10% FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin. Der adipogene Prozess ist abhängig vom Zusammenfluss der Zellen; Lassen Sie daher nicht zu, dass die Aktienkultur zu mehr als 50% der Konfluenz wächst, da ein höherer Zusammenfluss die Fähigkeit der Zellen beeinträchtigt, sich zu differenzieren.
    2. Platzieren Sie die Zellen auf 2 x 104 Cells/cm 2. Bei dieser Dichte erreichen die Zellen den Zusammenfluss in 3 Tagen.
    3. Die adipogene Differenzierung zwei Tage nach Erreichen der Zellen zu 100%. Induktionsmedien bestehen aus DMEM, die 10% FBS, 10 μg/mL Insulin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-Methyxanthine, 1 μM Dxamethason und 10 μM Troglitazone enthält.
    4. Ersetzen Sie die Induktionsmedien nach 48 Stunden Inkubation zu Differenzierungsmedien (DMEM mit 10% FBS und 5 μg/mL Insulin). Erfrischen Sie die Medien alle zwei Tage bis zur Ernte. Repräsentative Proben der vollständigen Differenzierung werden in der Regel zwischen 7 und 10 Tage nach adipogener Induktion gesammelt.
      NOTE: Mit fortschreitender Adipogenese werden die Zellen rund und neigen dazu, sich leicht zu lösen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Kulturmedien auf die Teller setzen.
  6. MCF10A Zellen
    1. Platte MCF10A Zellen in DMEM/F12 (1:1, v:v), ergänzt um 5% FBS, 100 U/mL penicillin/streptomycin, 0,5 μg/mL Hydrocortison, 10 μg/mL Insulin, und 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF). Die empfohlene Saatdichte beträgt 1 x 105 Cells/.2. Unter diesen Bedingungen werden die Zellen innerhalb von 4 Tagen 100% Durchfluss erreichen. Erfrischen Sie die Medien alle 2 bis 3 Tage bis zur Ernte.
      NOTE: MCF10A-Zellen sind schwer zu lösen. Es wird empfohlen, die Zellen 10 bis 15 min bei 37 ° C in PBS kalziumfrei mit 0,5 MB EDTA vor der Trypsinierung zu inkubieren.
  7. Madin-Darby-Canin-Nierenzellen (MDCK)
    1. Platte MDCK-Zellen in DMEM ergänzt mit 10% FBS und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin. Die empfohlene Saatdichte beträgt 1 x 105 Cells/cm2, wobei die Zellen innerhalb von 3 Tagen 100% Konfluenz erreichen. Erfrischen Sie die Medien alle 2 Tage bis zur Ernte.
      NOTE: MDCK-Zellen sind schwer zu lösen. Es wird empfohlen, die Zellen vor der Trypsinierung für 5 bis 10 min bei 37 ° C in PBS zu inkubieren. Um das Klumpen von Zellen zu verhindern, werden die Platten nicht durch Aufprall oder Schütteln der Flasche während des Wartens auf die Zellablösung aufgebracht.

2. Säugetierzellkulturen-Probenvorbereitung für AAS: Ganzkörper-und subzelluläre Fraktionierung

  1. Kultur die Zellen von Interesse in 55 cm 2 Platten. Der Einsatz kleinerer Kulturplatten kann unter den Nachweisgrenzen des GF-AAS Proben mit Metallwerten ergeben.
  2. Ganzkörperextrakt
    1. Aspirieren Sie die Kulturmedien mit einer Vakuumfalle. Achten Sie darauf, alle Spuren der Medien zu entfernen. Spülen Sie die Zellen dreimal aus den gewünschten Zeitpunkten oder Kulturbedingungen mit eiskaltem PBS frei von Kalzium und Magnesium.
    2. Die Zellen sofort mit einem neuen Kunststoffzellenschrott in 1 ml PBS kratzen, der frei von Kalzium und Magnesium ist. Die Probe auf ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr und Zentrifuge 2 min bei 2.000 x g übertragen und das Supernatant absaugen. Das Protokoll kann hier pausiert werden. Pelletsproben bei-20 ° C aufbewahren oder auf Schritt 2,4 gehen.
  3. Subzelluläre Fraktionierung
    1. Aspirieren Sie die Kulturmedien mit einer Vakuumfalle. Achten Sie darauf, alle Spuren der Medien zu entfernen. Spülen Sie die Zellen dreimal aus den gewünschten Zeitpunkten oder Kulturbedingungen mit eiskaltem PBS frei von Kalzium und Magnesium. Krabbeln Sie die Zellen von der Platte mit 1 mL eiskalter PBS frei von Kalzium und Magnesium.
    2. Die Proben auf ein 1,5 ml mikrozentrifuge Rohr übertragen und auf Eis halten. Zentrifuge für 10 s bei 10.000 x g. Die schnelle Isolierung der Kerne fortsetzen, wenn eine Metallanalyse von zytoplasmatischen und nuklearen Brüchen gewünscht wird. Mit diesem Verfahren wird der mögliche Verlust von Metallen durch die Zellgewinnung39,40 minimiert.
    3. Entfernen Sie den Supernatant durch Aspiration und erneuern Sie das Zellpellet in 400 μL eiskalter PBS frei von Kalzium und Magnesium, das 0,1% Nonidet P-40 (NP-40) enthält, ein nicht-ionisches Reinigungsmittel. Übertragen Sie 100 μL auf ein neues Mikrozentrifugenrohr und betrachten Sie es als die gesamte Zellprobe. Dieser Aliquot macht 25% der Stichprobe aus.
    4. Isolieren Sie Kerne, indem Sie die Zellaufhängung 5 bis 10 Mal auf Eis mit einer P1000-Mikropipette-Spitze pipettieren. Die Nuchell-Isolierung der Epithelzellen erfordert eine Konzentration von 0,5% NP-40. Die Zelltrennung wird durch eine 26 3/4 G-Nadel 10 bis 15 Mal erreicht, gefolgt von 10 bis 15 Durchgängen durch eine 30 1/2 G-Nadel.
      Hinweis: Überprüfen Sie die Nukle-Integrität durch Lichtmikroskopie mit einem 40x-Ziel.
    5. Zentrifugen Sie die restliche Zell-Lysat-Federung (300 μL) für 10 s auf 10.000 x g. Das Supernatant wird die zytosolische Fraktion enthalten. Übertragen Sie die 300 μL auf ein neues Mikrozentrifugenrohr.
    6. Spülen Sie das Pellet, das die Kernfraktion in 500 μL PBS enthält, frei von Kalzium und Magnesium, mit 0,1% NP-40, dann Zentrifuge für 10 s bei 10.000 x g. Entfernen Sie das Supernatant und erneuern Sie das Pellet, das die Kerne in 100 μL der gleichen Lösung enthält.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Proben können bei-20 ° C gelagert werden.
  4. Lyse die Zellen durch drei Schallzyklen (30 s on/30 s aus, bei 50 kHz, 200 W) für 5 min. Quantisiere den gesamten Proteingehalt in der Probe durch Bradford41.
  5. Führen Sie die Qualitätskontrolle der Reinheit der Bruchteile durch Western Blot durch, wobei Antikörper verwendet werden, die sowohl für die Kernkraft (Histone, Chromatin-Entferner, nukleare Matrixproteine) als auch für zytosolische Bruchteile (β-Tubbulin, β-actin) spezifisch sind (Abbildung2).
    Hinweis: Keine Soundatoren mit Metallspitze verwenden. Diese können die Probe mit Metallen verunreinigen.

3. Zn-inhaltliche Analyse ganzer Zell-und subzellulärer Brüche von Säugetierzellkulturen durch atomare Absorbationsspektroskopie

  1. Mineralisieren Sie die Zellkultur-Proben (Vollzell-oder Kernfraktionen) durch Säureverdauung mit einem gleichen Volumen an konzentrierter HNO 3-Spur-Metall-Klasse (CAUTION) für 1 h bei 80 ° C, dann über Nacht bei 20 ° C.
  2. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30% des Reaktionsvolumens von H2 O 2hinzufügen. Bringen Sie das Probenvolumen auf 500 μL mit 18 mm reinigtem Wasser.
    Hinweis: Das Handling von HNO 3 sollte mit einer chemischen Sicherheitsbrille, einem Gesichtsschild für Spritzschutz, Handschuhen und einem zugelassenen Dampfatsapparat durchgeführt werden, wenn keine ausreichende Belüftung (Rauchhaube) vorhanden ist. Das Protokoll kann hier pausiert werden. Proben können bei Raumtemperatur gelagert werden. (RT)
  3. Bereiten Sie Standardlösungen und Versuchsproben für Zn-Messungen von AAS mit einem Graphitofen vor.
    1. Verwenden Sie 2% (v/v) HNO-3-Lösung in deionisiertem Wasser, die aus der gleichen Charge stammt, die für die Standardkurve verwendet wird, wie die leere Lösung für die Kalibrierung. Verwenden Sie Analysegeräten, die in 18 Min gereinigtem Wasser verdünnt werden.
    2. Bereiten Sie einen Standard von 1.000 ppb Zn aus einer kommerziell erhältlichen 1.000 ppm Zn-Lagerösung mit 2% (v/v ) HNO 3-Lösung in deionisiertem Wasser vor. Bereiten Sie Arbeitslösungen aus dem Standard 100 ppb vor, indem Sie ihn auf 5, 8, 10, 15, 20 und 25 ppb direkt mit 2% (v/v) HNO3-Lösung in deionisiertes Wasser verdünnen. Bereiten Sie die Zn-Standards und den Rohling mit einem 0,1% (1 g/L) Mg (NO3) 2-Matrix-Modifikator vor.
      Hinweis: Die LOD von Zn ist 0,01 ppb (μg/L). Durch die Erhöhung der Normkonzentration wurde die Grenze der Linearität von Zn auf 20 ppb festgelegt (Abbildung3).
    3. Messstandard und Proben unter den gleichen optimierten Bedingungen: Einführungsgeschwindigkeit von 250 mL/min, Einspritztemperatur von 20 ° C und GF-Temperatur von 1.800 ° C.
      Hinweis: Die GF-Temperatur wurde für Reinigungsschritte auf 2450 ° C erhöht, bevor eine neue Probe oder Norm eingesprit wurde.
    4. Optimieren Sie die Lampe (C-HCL) auf einen Strom von 20 A, Wellenlänge von 213,9 nm und Schlitz von 0,7 nm.
    5. Messen Sie die mineralisierten Proben mit der Zn-Standardkurve, um den Metallgehalt zu bestimmen. Da kleine Mengen gemessen werden, können die Proben verdampfen, wenn die Messungen lange dauern. Daher empfiehlt es sich, den Proben Wasser hinzuzufügen. Die Proben mit 18 °-Reinigungswasser, das mit 0,01% HNO 3 (Analysegrad) behandelt wird, verdünnen, wenn die gewonnenen Daten über die LODhinausgehen .
      Hinweis: In der Regel werden Proben auf ein Volumen von 500 μL verdünnt, die direkt nach der Standardkurve im automatisierten Autosampler des AAS platziert werden. Das erforderliche Volumen sollte vom Anwender bestimmt werden und die abschließenden Berechnungen der Konzentrationen berücksichtigen. Es wird empfohlen, die Zn-Bestimmungen von AAS eines kompletten Experiments in einem Versuch zu beenden. Das eln der Messungen kann zu großen experimentellen Variationen und Ungereimtheiten führen.
  4. Wandeln Sie die ppb-Messungen in Molarität um, wie sie von Zn gewonnen werden, die über AAS gemessen werden. Man denke an die Masse von Zn (65,39 amu). Teilen Sie die Menge der ppb, die von AAS erhalten wird, um 63,390.000. In Zellen reichen die Zn-Konzentrationen von Pmool-Einheiten bis μmol.
    1. Teilen Sie die Konzentration von Zn (pmol oder μmol) durch die anfängliche Masse des Proteins in der von Bradford ermittelten Probe (Schritt 2.4). Bei dieser Berechnung wird die Menge an Metall (pmol oder μmol Zn) pro mg Eiweiß der Probe enthalten.
      NOTE: Es ist wichtig, die Verwässerungsfaktoren zu berücksichtigen, die bei den Metallfeststellungen verwendet werden.

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Ergebnisse

Wir haben die Fähigkeit des GF-AAS getestet, winzige Zn-Werte in Säugetierzellen zu erkennen (Abbildung1). So kultivierten wir primäre Myoblasten, die von Maus-Satelliten abgeleitet werden, und die etablierten Zelllinien N2A (Neuroblastoma abgeleitet), 3T3 L1 (Adipozyten), MCF10A (Brusepithel) und MDCK-Zellen (Hund Nierenepithel). Zunächst isolierten wir ganze Zell-, Zytosolisch-und Kernfraktionen all dieser Zelltypen und bewerteten die Reinheit der Bruchteil...

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Diskussion

Die Atomabsorbanzspektroskopie ist eine hochempfindliche Methode zur Zn-Quantifizierung in kleinen Mengen/massenhaft biologischer Proben. Die beschriebene Optimierung der Zn-Messung macht die Anwendung dieser Methode einfach und garantiert optimale analytische Bedingungen. Hier haben wir mit Hilfe von GF-AAS die Konzentration von Zn in ganzen Zellen und in zytoolischen und nuklearen Brüchen aus verschiedenen Zelllinien bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Technik vergleichbar ist mit denen von Leuchtstoffsonden un...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Fakultäts-und Diversity Scholars Award der University of Massachusetts Medical School an T.P.-B. unterstützt. N.N.-T. Unterstützt wird von SEP-CONACYT, gewähren 279879. J.G.N wird von der National Science Foundation Grant DBI 0959476 unterstützt. Die Autoren danken Dr. Daryl A. Bosco für die Bereitstellung der N2A-Zelllinie und Daniella Cangussu für ihre technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3-Isobutyl-1-methylxanthinSigma AldrichI5879
EssigsäureSigma Aldrich1005706
Anti-Brg1-Antikörper (G7)Santa Cruz biotechnologiessc-17796
Anti-b-Tubulin-Antikörper (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
BradfordBiorad5000205
DexamethasonSigma AldrichD4902
Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)ThermoFischer-Gibco11320033
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
Epidemaler Wachstumsfaktor (EGF)Sigma AldrichE9644
Fötales Rinderserum (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
Fibroblastischer Wachstumsfaktor-Basic (FGF) (AA 10-155)ThermoFischer-GibcoPHG0024
PferdeserumThermoFischer-Gibco16050122
HydrocortisonSigma AldrichH0888
Wasserstoffperoxid (H2O2)Sigma Aldrich95321
InsulinSigma Aldrich91077C
Insulin-Transferrin-Selen-AThermoFischer51300044
Salpetersäure (HNO3)Sigma Aldrich438073
Nonidet P-40 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (Reduzierte Serummedien)ThermoFischer-Gibco31985070
Penicillin-StreptomycinThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (Kollagen)Advanced BioMatrix5005
RetionsäureSigma AldrichPHR1187
TroglitazoneSigma Aldrich648469-M
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotThermoFischer-Gibco25200056
Zink (Zn) Reines Einzelelement Standard, 1.000 & Mikro; g/ml, 2% HNO3Perkin ElmerN9300168
Established Cell Lines
3T3-L1American Type Culture CollectionCL-173
MCDKAmerican Type Culture CollectionCCL-34
MCF10AAmerican Type Culture CollectionCRL-10317
N2AAmerican Typ Culture CollectionCCL-131
Equipment
Atomic Abssortion SpektralphotometerPerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200

Referenzen

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