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Methodenartikel

Murine Modell der zentralen venösen Stenose mit Aortocaval Fistel mit einem Abfluss Stenose

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DOI:

10.3791/59540

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11. Juli 2019

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1Department of Surgery, Yale University, 2Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale University, 3Department of Vascular Surgery, University of Tokyo, 4Department of Diagnostic Radiology, Tokai University School of Medicine, 5Department of Cardiovascular Surgery, Tokyo Medical University, 6Department of Vascular Surgery, VA Connecticut Healthcare Systems

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine aortocavale Fistel wurde durch Daspunktieren der murinen Infra-Nieren-Aorta durch beide Wände in die untere Vena cava geschaffen und es folgte die Schaffung einer Stenose in ihrem Abfluss durch partielle Ligation der unteren Vena cava. Dieses reproduzierbare Modell kann verwendet werden, um zentrale venöse Stenose zu studieren.

Zusammenfassung

Zentrale venöse Stenose ist eine wichtige Einheit, die zum Versagen der arteriovenösen Fisteln (AVF) beiträgt. Ein murines AVF-Modell wurde modifiziert, um eine partielle Ligation der unteren Vena cava (IVC) im Abfluss der Fistel zu erzeugen, die zentrale venöse Stenose imitiert. Technische Aspekte dieses Modells werden eingeführt. Die Aorta und IVC sind nach einem Bauchschnitt exponiert. Die infrarenale Aorta und IVC werden für die proximale Klemmung seziert, und die distale Aorta wird für die Punktion ausgesetzt. Das IVC in der Mitte zwischen der linken Nierenvene und der Aortenverzweigung wird sorgfältig seziert, um eine 8-0 Unter dem IVC. Nach dem Spannen der Aorta und IVC entsteht ein AVF, indem die infrarenale Aorta durch beide Wände mit einer 25 G Nadel durch beide Wände in das IVC punktiert wird, gefolgt von der Zusammenligaung eines 22 G intravenösen (IV) Katheters und IVC. Der Katheter wird dann entfernt, wodurch eine reproduzierbare venöse Stenose ohne Okklusion entsteht. Die Aorta und IVC werden nach der Bestätigung der primären Hämostase nicht eingeklemmt. Dieses neuartige Modell der zentralen Venenstenose ist einfach durchzuführen, reproduzierbar und erleichtert Studien über AVF-Versagen.

Einleitung

Arteriovenöse Fisteln (AVF) sind die häufigsten Zugänge für Hämodialyse, mit überlegener Durchgängigkeit und reduzierter Infektion im Vergleich zu anderen Zugängen wie Transplantaten oder zentralen Venenkathetern. Jedoch, bis zu 60% der AVF nicht reifen1,2,3; eine kürzlich durchgeführte systematische Überprüfung hat berichtet, dass die Primärdurchgängigkeitsraten bei 1 Jahr nur 60%4betrugen. Stenose entlang des venösen Abflusses verursacht überwiegend das Versagen der AVF-Reifung5,6. Es gibt bestimmte charakteristische Stellen, die anfällig für Stenose proximal für die Fistel sind: das juxtaanastomotische Schwungsegment für die radiozephale Fistel, der cephalische Bogenbereich für die brachiocephale Fistel und die zentrale Vene für die Fistel mit platzierte ipsilaterale subklavische oder interne Jugularvenenkatheter7,8.

Zentrale venöse Stenose ist oft asymptomatisch bei Patienten ohne AVF, kann aber ipsilaterale Extremitätödem durch venöse Hypertonie sowie Versagen der Fistelreifung verursachen, wenn sie durch Fistelfluss herausgefordert wird9. Die Pathophysiologie der zentralen venösen Stenose hängt höchstwahrscheinlich mit Entzündungen und der aktivierten Gerinnungskaskade nach der Geräteplatzierung zusammen. Darüber hinaus können eine konstante Bewegung der Katheterspitze sowie ein erhöhter Durchfluss aus der Fistel die Scherspannung verändern, was zu Thrombozytenablagerungen und venöser Wandverdickung10führt. Um die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, die aVF-Versagen durch zentrale venöse Stenose verursacht werden, ist ein Tiermodell erforderlich, das zentrale venöse Stenose mit einem AVF imitiert.

Wir haben ein murines aortokasvales Fistelnmodell etabliert, das leicht durchzuführen und den klinischen Verlauf der menschlichen AVF zu meistern und zu meistern und zu rekapitulieren. 11 Wir haben die Konzepte und die Technik mehrerer zuvor etablierter muriner Modelle angewendet, um ein neuartiges murinisches AVF-Modell mit venöser Stenose zu erstellen. Wir führen ein murines aortokasvales Fistelmodell mit einer IVC-Stenose in der Abflussfistel ein, die für die Untersuchung der zentralen venösen Stenose verwendet werden kann.

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Protokoll

Alle Experimente wurden mit Genehmigung des Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Anästhesie und präoperative Verfahren

  1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Materialien durch Autoklavieren. Schalten Sie die Wärmeunterstützungsvorrichtung ein, um sicher zu sein, dass es warm ist (40–42 °C).
  2. Legen Sie eine 9–11 Wochen alte C57BL/6-Maus in eine Acryl-Induktionskammer und befeuchten Sie sie mit verdampftem 2,5% Isofluran und 0,8 l/min Sauerstoff. Anästhesie Induktion dauert ca. 3 min.
  3. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer. Bestätigen Sie eine tiefe Anästhesieebene durch eine Zehenklemme, eine Ohrzange und eine Schwanzprise. Legen Sie die Maus in Supine-Position auf den chirurgischen Bereich und liefern 2,5% Isofluran e mit Silikonmaske. Buprenorphin bei 0,1 mg/kg Schmerz anbringen und ophthalmologische Salbe auf die Augen auftragen.
  4. Entfernen Sie Fell von der ventralen Seite des Halses in den Unterbauch mit Nair, einem Haarentferner.
  5. Reinigen und desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit einem zweistufigen Peeling mit 10% Povidon-Jod und 70% Isopropanol. Tragen Sie einen chirurgischen Vorhang auf.

2. Operative Verfahren

  1. Belichtung der Klemm- und Punktionsstellen
    1. Bereiten Sie sterile Instrumente vor und tragen Sie sterile Handschuhe, um die Sterilität während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten.
    2. Machen Sie einen hauttiefen Mittellinien-Bauchschnitt mit einem Skalpell von der Ebene der unteren Leberkante bis knapp über dem Schambein. Schneiden Sie die Muskulatur mit einer Schere durch, um die Bauchhöhle zu öffnen.
    3. Setzen Sie einen Retraktor in den Bauch und ziehen Sie die Eingeweide auf die rechte Seite. Halten Sie sie feucht, indem Sie in eine salinegetränkte Gaze wickeln. Retreive die Blase und die Samenbläschen (bei männlichen Mäusen) und ziehen Sie sie auf die kaudale Seite. Sezieren Sie die Mesenterie zwischen Dem Rektum und Retroperitoneum mit einem Mikronadelhalter, um einen vollständigen Blick auf die Aorta und IVC zu erhalten.
    4. Sezieren Sie die infrarenale Aorta und IVC en bloc aus dem seitlichen und dorsalen umgebenden retroperitonealen Geweben mit einem Mikronadelhalter, um sie miteinander zu kreuzen.
    5. Sezieren Sie die umgebenden Gewebe, um die aortenförmige Punktionsstelle in etwa drei Vierteln des Abstands von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation freizulegen.
  2. IVC-Sektion
    1. Sezieren Sie zwischen der infrarenalen IVC und Aorta sofort distal auf die linke Nierenvene. Dehnen Sie die Sezieren distal auf die Hälfte zwischen der linken Nierenvene und der aortenförmigen Bifurkation, so dass die infrarenale IVC, sowohl vor- als auch nachderhin der Stenose, postoperativ beobachtet werden kann.
      HINWEIS: Eine stumpfe Zerlegung zwischen IVC und Aorta sollte von der unmittelbar distalen zur linken Nierenvene durchgeführt werden, wobei das Bindegewebe zwischen DEM IVC und der Aorta relativ locker ist.
    2. Machen Sie ein Fenster, um das IVC von der Aorta auf dieser Ebene zu trennen und sezieren Sie das IVC vom umgebenden Gewebe. Platzieren Sie eine 8-0 Polyamid-Monofilament-Nähte zuerst unter der IVC und Aorta (Abbildung 1A), dann positionieren Sie die Naht unter nur der IVC (Abbildung 1B), indem Sie die Nahtende durch das Fenster ziehen.
      HINWEIS: Da das IVC zerbrechlich ist, ist das Sezieren entlang der aortenartigen Adventitia nützlich, um ein Fenster zu machen, um zu verhindern, dass die IVC sowie kleine IVC- oder Aortenzweige beschädigt werden. Wenn Blutungen auftreten, ist es wahrscheinlich unkontrollierbar. Wenn der IVC unterschiedliche Seitenzweige hat, legen Sie eine 8-0 Naht distally zu den Zweigen.
  3. AVF-Erstellung
    1. Biegen Sie eine 25 G Nadel in einen 45-60°-Winkel an einem Punkt von 4 mm von der Nadelspitze.
    2. Klemmen Sie die infrarenale Aorta und IVC, indem Sie einen mikrochirurgischen Clip auftragen.
    3. Drehen Sie die Aorta medial und kauarisch, indem Sie das Bindegewebe, das die Bifurkation umgibt, erfassen, um die Punktionsstelle der Aorta freizulegen, die sie leicht auf die ventrale Seite streckte.
    4. Halten Sie die Aorta in einer geeigneten Position, punktieren Sie durch die Aorta in die IVC mit der vorbereiteten 25 G Nadel (Abbildung 1C).
    5. Lassen Sie die Aorta los und bedecken Sie die Punktionsstelle mit dem umgebenden Gewebe, das von der linken Seite der Aorta nach oben gezogen wird. Nehmen Sie die Nadel heraus und drücken Sie die Punktionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen für Hämostase.
  4. Erstellung der IVC-Stenose
    1. Legen Sie eine Spitze eines 22 G IV Katheters (siehe Materialtabelle) längs auf das IVC. Ligate den IV-Katheter und IVC zusammen mit einem 8-0 (Abbildung1D) und entfernen Sie dann den IV-Katheter.
    2. Bestätigen Sie die primäre Hämostase (Abbildung1E) und entklemmen Sie dann die Aorta und IVC. Bedecken Sie die Punktionsstelle 1 min mehr, um die Hämostase zu gewährleisten.
      HINWEIS: Nicht zu lange klemmen, um IVC Thrombose distal zur Stenose zu vermeiden.
    3. Bringen Sie die Organe in ihre ursprüngliche Position zurück und schließen Sie den Bauch mit 6-0 Nähten.

3. Postoperative Verfahren

  1. Nach Dem Endes der Bauchwunde, isoflurane Inhalation abbrechen. Legen Sie die Maus in einen individuellen, bettläktfreien Käfig und legen Sie den Käfig auf eine thermische Stützvorrichtung, um Unterkühlung zu verhindern.
    HINWEIS: Die Maus wird beobachtet, bis sie die Brustbehebung erreicht und aufrechterhält. Wenden Sie postoperative Versorgung einschließlich Analgesie und Wundversorgung gemäß den Empfehlungen des lokalen IACUC an. Für Analgesie verwenden wir Buprenorphin bei 0,1 mg/kg intramuskulär alle 12 h für 48 h nach den chirurgischen Eingriffen und danach nach Bedarf.
  2. Bestätigen Sie die AVF-Patenz postoperativ mit Doppler-Ultraschall (siehe Materialtabelle). Messen Sie außerdem je nach Bedarf andere Behälter- und Fließeigenschaften.

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Ergebnisse

Männliche Mäuse unterliefen der oben genannten Operation, um sowohl eine AVF- als auch eine IVC-Stenose zu erzeugen. Kontrollmäuse wurden nur laparotomie und Zerlegung des Gewebes rund um das IVC, z. B. ein Scheinverfahren, oder nur die Schaffung einer IVC-Stenose ohne gleichzeitige Schaffung einer AVF.

Das IVC wurde mit Doppler-Ultraschall am 7. Tag nach dem chirurgischen Eingriff beobachtet (Abbildung 2

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Diskussion

Das murine AVF-Modell wurde verwendet, um die grundlegenden Mechanismen und molekularen Ereignisse zu untersuchen, die zur AVF-Reifung13,14führen. In dieser Studie modifizierten wir ein etabliertes murines AVF-Modell, um ein neuartiges murines aortokasvales Fistelmodell mit einer IVC-Stenose im Abflusstrakt der Fistel zu erstellen. Unser Ligationsmodell ähnelt mehreren zuvor beschriebenen murinen Modellen, die Gefäßligation verwenden. Ein murines Modell der tiefe...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom US National Institute of Health (NIH) Grant R01-HL128406 unterstützt; das United States Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory Research and Development Program Merit Review Award I01-BX002336; sowie mit den Ressourcen und der Nutzung von Einrichtungen im VA Connecticut Healthcare System, West Haven, CT.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
20-60 Mhz ScankopfVisualSonics Inc.RMV-704
8-0 Steriles Mikronaht, 6 mm (140 & Mikro;), 3/8 Kreis, TAP Point NadelAROSutureT06A08N14-13Polyamid Monofil Nahtmaterial
Induktionskammer, 2 Liter
3,75" B x 9,00" T x 3,75" H		VetEquip941444
Isoflo, Isofluran flüssigZoetis26675-46-7
Mäuse, C57BL/6JDer Jackson Labor664
Haustierbett Mikrowellen-HeizkissenSnuggle Safe6250
PrecisionGlide Nadel 25GBD305122
Surflo I.V. Katheter 22GTerumoSR-OX2225CA0,85 mm Außendurchmesser
GefäßklemmeRoboz Chirurgisches InstrumentRS-5424
Vevo770 Hochauflösendes BildgebungssystemVisualSonics Inc.770

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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