Methodenartikel

Navigieren in MARRVEL, einem webbasierten Tool, das Informationen zur Humangenomik und Modellgenetik integriert

DOI:

10.3791/59542

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15. August 2019

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1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 6Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 7Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um effizient auf viele Datenbanken für menschliche und Modellorganismen zuzugreifen und diese zu analysieren. Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von MARRVEL zur Analyse von Krankheitsverursachenden Varianten, die bei Sequenzierungsbemühungen der nächsten Generation identifiziert wurden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durch die Sequenzierung von Ganzexom/Genom identifizieren Humangenetiker seltene Varianten, die sich mit Krankheitsphänotypen trennen. Um zu beurteilen, ob eine bestimmte Variante pathogen ist, muss man viele Datenbanken abfragen, um festzustellen, ob das Gen von Interesse mit einer genetischen Krankheit in Verbindung steht, ob die spezifische Variante bereits berichtet wurde und welche funktionellen Daten im Modellorganismus verfügbar sind. Datenbanken, die Hinweise auf die Funktion des Gens beim Menschen liefern können. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration) ist ein Tool zur Datenerfassung aus einer Zwischenstation für menschliche Gene und Varianten und deren orthologous Gene in sieben Modellorganismen, darunter in Dermaus, Ratte, Zebrafisch, Fruchtfliege, Nematodenwurm, Spalt Hefe und aufkeimende Hefe. In diesem Protokoll geben wir einen Überblick darüber, wofür MARRVEL verwendet werden kann, und diskutieren, wie verschiedene Datensätze verwendet werden können, um zu beurteilen, ob eine Variante unbekannter Bedeutung (VUS) in einem bekannten krankheitserregenden Gen oder eine Variante in einem Gen von ungewisser Bedeutung (GUS) Pathogenen. Dieses Protokoll führt einen Benutzer durch die Suche mehrerer menschlicher Datenbanken gleichzeitig beginnend mit einem menschlichen Gen mit oder ohne eine Variante von Interesse. Wir besprechen auch, wie Daten von OMIM, ExAC/gnomAD, ClinVar, Geno2MP, DGV und DECHIPHER genutzt werden können. Darüber hinaus veranschaulichen wir, wie eine Liste von Ortholog-Kandidatengenen, Expressionsmustern und GO-Begriffen in Modellorganismen interpretiert wird, die mit jedem menschlichen Gen assoziiert sind. Darüber hinaus besprechen wir die bereitgestellten Wertproteinstrukturbereichsanmerkungen und erklären, wie die Proteinausrichtungsfunktion mehrerer Arten verwendet werden kann, um zu beurteilen, ob eine Variante von Interesse eine evolutionär konservierte Domäne oder Aminosäure beeinflusst. Abschließend werden wir drei verschiedene Anwendungsfälle dieser Website besprechen. MARRVEL ist eine leicht zugängliche Open-Access-Website, die sowohl für klinische als auch für Grundlegende Forscher entwickelt wurde und als Ausgangspunkt für die Entwicklung von Experimenten für funktionelle Studien dient.

Einleitung

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Der Einsatz der Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation wird sowohl in der Forschung als auch in den klinischen genetischen Laboratorien erweitert1. Whole-Exom (WES) und Whole-Genome-Sequenzierung (WGS) Analysen zeigen zahlreiche seltene Varianten von unbekannter Bedeutung (VUS) in bekannten krankheitserregenden Genen sowie Varianten in Genen, die noch mit einer Mendelian-Krankheit in Verbindung gebracht werden müssen (GUS: Gene von ungewisser Bedeutung). Mit einer Liste von Genen und Varianten in einem klinischen Sequenzbericht vorgestellt, müssen medizinische Genetiker manuell mehrere Online-Ressourcen besuchen, um mehr Informationen zu erhalten, um zu beurteilen, welche Variante für einen bestimmten Phänotyp verantwortlich sein kann, der beim Patienten von Interesse gesehen wird. . Dieser Prozess ist zeitaufwändig und seine Wirksamkeit hängt stark von der Expertise des Einzelnen ab. Obwohl mehrere Leitpapiere veröffentlicht wurden2,3, erfordert die Interpretation von WES und WGS eine manuelle Kuration, da es noch keine standardisierte Methodik für die Variantenanalyse gibt. Für die Interpretation von VUS wird das Wissen über die zuvor berichtete Schrift-Phänotyp-Beziehung, die Vererbungsart und die Allelfrequenzen in der allgemeinen Bevölkerung wertvoll. Darüber hinaus kann das Wissen darüber, ob die Variante eine kritische Proteindomäne oder einen evolutionär konservierten Rückstand betrifft, die Wahrscheinlichkeit einer Pathogenität erhöhen oder verringern. Um all diese Informationen zu sammeln, muss man in der Regel durch 10-20 Datenbanken für menschliche und Modellorganismen navigieren, da die Informationen über das World Wide Web verstreut sind.

In ähnlicher Weise sind Modellorganismenwissenschaftler, die an bestimmten Genen und Pfaden arbeiten, oft daran interessiert, ihre Erkenntnisse mit menschlichen Krankheitsmechanismen zu verbinden, und möchten das Wissen nutzen, das im Bereich der menschlichen Genomik generiert wird. Aufgrund der raschen Erweiterung und Weiterentwicklung von Datensätzen in Bezug auf das menschliche Genom war es jedoch schwierig, Datenbanken zu identifizieren, die nützliche Informationen liefern. Da die meisten Modellorganismus-Datenbanken für Forscher konzipiert sind, die täglich mit dem spezifischen Organismus arbeiten, ist es beispielsweise für einen Mausforscher sehr schwierig, nach spezifischen Informationen in einer Drosophila-Datenbank zu suchen und umgekehrt . Ähnlich wie bei der Varianteninterpretation spioniert die Suche von medizinischen Genetikern, ist die Identifizierung nützlicher Informationen über menschliche und andere Modellorganismen zeitaufwändig und stark vom Hintergrund des Modellorganismusforschers abhängig. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration)4 ist ein Tool, das für beide Benutzergruppen entwickelt wurde, um ihren Workflow zu optimieren.

MARRVEL (http://marrvel.org) wurde als zentrale Suchmaschine entwickelt, die Daten systematisch und konsistent für Kliniker und Forscher sammelt. Mit Informationen aus 20 oder mehr öffentlich zugänglichen Datenbanken ermöglicht dieses Programm Benutzern, schnell Informationen zu sammeln und auf eine große Anzahl von Datenbanken für menschliche und Modellorganismen zuzugreifen, ohne dass eine wiederholungsative Suche durchgeführt wird. Die Suchergebnisseiten enthalten auch Hyperlinks zu den ursprünglichen Informationsquellen, die es Einzelpersonen ermöglichen, auf die Rohdaten zuzugreifen und zusätzliche Informationen zu sammeln, die von den Quellen bereitgestellt werden.

Im Gegensatz zu vielen der Variantenpriorisierungstools, die eine große Sequenzierung von Daten in Form von VCF- oder BAM-Dateien und Installationen von oft proprietärer/kommerzieller Software erfordern, arbeitet MARRVEL an jedem Webbrowser. Es kann kostenlos verwendet werden und ist mit tragbaren Geräten (z.B. Smartphones, Tablets) kompatibel, solange man mit dem Internet verbunden ist. Wir haben uns für dieses Format entschieden, da viele Kliniker und Forscher in der Regel ein oder mehrere Gene und Varianten gleichzeitig suchen müssen. Beachten Sie, dass wir Batch-Download- und API-Funktionen (Application Programming Interface) für MARRVEL entwickeln, um es Benutzern schließlich zu ermöglichen, Hunderte von Genen und Varianten gleichzeitig durch benutzerdefinierte Abfragetools zu kuratieren.

Aufgrund der breiten Palette von Anwendungen werden wir in diesem Protokoll einen weit gefassten Ansatz beschreiben, wie man durch verschiedene Datasets navigiert, die MARRVEL anzeigt. Gezieltere Beispiele, die auf die spezifischen Bedürfnisse der Nutzer zugeschnitten sind, werden im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben. Es ist wichtig zu beachten, dass die Ausgabe von MARRVEL immer noch ein gewisses Maß an Hintergrundwissen in der Humangenetik oder Modellorganismen erfordert, um wertvolle Informationen zu extrahieren. Wir verweisen die Leser auf die Tabelle, die Primärpapiere auflistet, die die Funktion der einzelnen ursprünglichen Datenbanken beschreiben, die von MARRVEL kuratiert werden (Tabelle 1). Das folgende Protokoll gliedert sich in drei Abschnitte: (1) Wie man eine Suche beginnt, (2) wie man die Ergebnisse der MARRVEL-Humangenetik interpretiert und (3) wie man Modellorganismusdaten in MARRVEL nutzt. Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse werden gezieltere und spezifischere Ansätze beschrieben. MARRVEL wird aktiv aktualisiert, daher lesen Sie bitte die FAQ-Seite der aktuellen Website für Details zu Datenquellen. Wir empfehlen den Nutzern von MARRVEL dringend, sich anzumelden, um Aktualisierungsbenachrichtigungen über das E-Mail-Einreichungsformular am Ende der MARRVEL-Homepage zu erhalten.

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Protokoll

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1. Wie man eine Suche beginnt

  1. Für die menschliche Gen- und Variantensuche gehen Sie zu den Schritten 1.1.1.-1.1.2. Für die menschliche genbasierte Suche (keine Varianteneingabe) fahren Sie mit Schritt 1.2 fort. Die genbasierte Suche nach Modellorganismen finden Sie in den Schritten 1.3.1.-1.3.2.
    1. Gehen Sie auf die Homepage von MARRVEL4 auf http://marrvel.org/. Beginnen Sie mit der Eingabe eines menschlichen Gensymbols. Stellen Sie sicher, dass die Kandidatengennamen unter dem Eingabefeld mit jedem Zeicheneintrag aufgeführt sind. Wenn die Suche negativ zurückkommt, stellen Sie sicher, dass das verwendete Gensymbol auf der Website des HUGO Gene Nomenclature Committee5 (HGNC; https://www.genenames.org/) auf dem neuesten Stand ist.
    2. Geben Sie eine menschliche Variante ein. Die Suchleiste ist mit zwei Variantennomenklaturarten kompatibel: Genomposition ähnlich wie Varianten auf ExAC und GnomAD6 und Transkriptebasierte Nomenklatur nach HGVS-Richtlinien. Beispiele für solche Formate werden in grauem Text im Suchfeld angezeigt. Für die Nomenklatur der genomischen Lage verwenden Sie die Koordinaten nach hg19/GRCh37. Fahren Sie mit Schritt 2 fort.
      HINWEIS: Wenn eine Suche einen Fehler zurückgibt, sind die häufigsten Probleme entweder das Gensymbol ist nicht auf dem neuesten Stand oder die Variantennomenklatur ist falsch. In diesen Fällen sind die Websites HGNC (https://www.genenames.org/), Mutalyzer7 (https://www.mutalyzer.nl/) und TransVar8 (https://bioinformatics.mdanderson.org/transvar/) großartige Ressourcen, um den Fehler zu beheben. HGNC liefert offizielle Gensymbole und deren Aliasnamen für alle menschlichen Gene.
    3. Wenn nach der Bestätigung des Gennamens immer noch Fehlermeldungen angezeigt werden, verwenden Sie Mutalyzer und TransVar, um die Variantennomenklatur zu überprüfen und zu konvertieren.
    4. Versuchen Sie in einigen Situationen, wie z. B. einer kürzlichen Änderung des Gensymbols in HGNC, die Verwendung eines Synonyms für das Gen und wenden Sie sich bitte über die Registerkarte "Feedback" an das MARRVEL-Betriebsteam, um die Quelldaten zu aktualisieren, da MARRVEL aufgrund einer Verzögerung der Daten möglicherweise nicht die richtigen Informationen liefert. datum.
  2. Geben Sie ein menschliches Gensymbol ein und lassen Sie die Suchleiste der menschlichen Variante leer. Wenn ein Fehler auftritt, gehen Sie zu HGNC (https://www.genenames.org/), um nach dem offiziellen Gensymbol zu suchen, oder versuchen Sie es mit einem älteren Gensymbol.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte Modellorganismensuche auf dem oberen Banner (Abbildung 1) oder gehen Sie zu http://marrvel.org/model. Wählen Sie den Modellorganismus der Wahl aus und geben Sie ein Modellorganismus-Gensymbol ein. Klicken Sie auf das Gensymbol, da der Name automatisch vervollständigt wird, und klicken Sie dann auf Suchen. Wenn das Suchergebnis negativ ist, überprüfen Sie das offizielle Gensymbol, das in Datenbanken für Modellorganismen verwendet wird (Tabelle 1).
    2. Wenn das Suchergebnis immer noch negativ ist, greifen Sie auf DIOPT (DRSC Integrative Ortholog Prediction Tool, https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl) und HCOP (https://www.genenames.org/tools/hcop/) zu, um zu beurteilen, ob es keine guten vorhergesagten Orthologs für das Gen von Interesse. DIOPT ist eine Ortholog-Vorhersage-Suchmaschine, die vom DRSC (Drosophila RNAi Screening Center) betrieben wird und HCOP ist eine ähnliche Suite, die von HGNC entwickelt wurde.
      HINWEIS: Zusätzliche Suchvorgänge mit BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) können es Benutzern ermöglichen, Orthologs zu finden, die von Vorhersagealgorithmen, die in DIOPT und HCOP verwendet werden, übersehen werden können.
    3. Klicken Sie auf den MARRVEL es unten für die vorhergesagte menschliche Ortholog der Wahl. Überprüfen Sie die DIOPT-Punktzahl9 und die beste Punktzahl vom menschlichen Gen zum Modellorganismus? für die Auswahl des menschlichen Gens. Fahren Sie mit Schritt 2 fort.
      HINWEIS: DIOPT-Score9 (https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl) ist ein Wert dafür, wie viele Ortholog-Vorhersagealgorithmen ein Paar Gene in zwei Organismen vorhersagen, um sich gegenseitig ortholog zu sein. Weitere Informationen zu diesen Werten und den spezifischen Algorithmen, die zur Berechnung dieser Punktzahl verwendet werden, finden Sie unter Hu et al9. Wenn die beste Punktzahl vom menschlichen Gen zum Modellorganismus? Jaist, zeigt es an, dass das menschliche Gen eher ein echter menschlicher Ortholog des Gens von Interesse ist, aber es könnte Ausnahmen geben, besonders wenn mehrere menschliche Gene orthologus sind, um mehrere Modellorganismusgene aufgrund von Genduplizierungsereignissen während der Evolution. Wenn das Gen von Interesse ein Mitglied einer komplexen Genfamilie ist, die bei mehreren Arten eine divergierende Evolution durchlaufen hat, sollten Benutzer eine Publikation identifizieren, die eine umfassende phylogenetische Analyse der Genfamilie von Interesse durchgeführt hat, um die wahrscheinliches Ortholog-Kandidatengen.

2. Wie interpretiert man DIE OUTPUTs der MARRVEL-Humangenetik für eine Gen- und Variantensuche

HINWEIS: Auf der Ergebnisseite werden sieben menschliche Datenbanken angezeigt (Tabelle1, Abbildung 1). Für jedes Ausgabefeld gibt es eine Schaltfläche "Externe Verknüpfung" (kleinesFeld mit einem diagonalen Pfeil) in der oberen rechten Ecke, die mit der ursprünglichen Datenbank verknüpft wird, um weitere Details zu erhalten.

  1. Klicken Sie auf OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, https://www.omim.org/)10, die erste Datenbank, die angezeigt wird.
    HINWEIS: OMIM ist eine manuell kuratierte Datenbank, die Informationen über genetische Krankheiten und Merkmale im Menschen aggregiert und zusammenfasst.
    1. Verwenden Sie die Box Human Gene Description von OMIM für eine kurze Zusammenfassung dessen, was über das Gen- und Genprodukt bekannt ist.
    2. Verwenden Sie die Box Gene-Phenotype Relationships, um festzustellen, ob es sich bei diesem Gen um ein bekanntes krankheitserregendes Gen handelt oder nicht. Diese Box bietet manuell kuratierte bekannte Krankheit sanieren oder Phänotyp Assoziationen mit dem Gen von Interesse.
    3. Verwenden Sie die Liste der gemeldeten Alleles aus der OMIM-Box, um eine Liste der pathogenen Varianten zu erhalten, die von OMIM kuratiert wurden.
      HINWEIS: Da die manuelle Kuration einer Veröffentlichung über eine neue Krankheitsgenentdeckung notwendig ist, damit eine Gen-Krankheit-Assoziation in OMIM auftritt, können eine gewisse Zeitverzögerung und/oder verpasste Veröffentlichungen zu Missverständnissen führen. Es wird empfohlen, dass Benutzer PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)-Suchen durchführen, um auch aktuelle Literatur zu untersuchen (siehe 4.1.2.). Weitere Informationen in OMIM finden Sie unter Amberger10,11.
  2. klickenExAC(Exome Aggregation Consortium, http://exac.broadinstitute.org/)6und gnomAD(Genome Aggregation Database, http://gnomad.broadinstitute.org/), große Populationsgenomik-Datenbanken auf der Grundlage von WES und WGS von Menschen, die ausgewählt werden, um schwere pädiatrische Erkrankungen auszuschließen.
    HINWEIS: ExAC enthält 60.000 WES, während gnomAD 120.000 WES und 15.000 US-Dollar WGS enthält. Sowohl ExAC als auch gnomAD können als Kontrollpopulationsdatenbank verwendet werden, insbesondere bei schweren pädiatrischen Erkrankungen, aber ihre Interpretation erfordert ein gewisses Maß an Vorsicht. Im Allgemeinen kann gnomAD als eine aktualisierte und erweiterte Version von ExAC betrachtet werden, da die meisten Kohorten, die in ExAC enthalten sind, auch in gnomAD enthalten sind. Da es jedoch einige Ausnahmen gibt (siehe Kohorteninformationen in http://exac.broadinstitute.org/about bzw. http://gnomad.broadinstitute.org/about), zeigt MARRVEL Daten aus beiden Quellen an.
    1. Verwenden Sie das Feld "Kontrolle Population Gene Summary", um Statistiken auf Genebene zu erhalten, z. B. die Wahrscheinlichkeit, den Funktionsverlust (LOF)-Allele in der allgemeinen Population zu finden. Dies wird in ExAC als pLI-Score (Wahrscheinlichkeit der LOF-Intoleranz) bezeichnet und kann verwendet werden, um abzuleiten, wie wahrscheinlich eine einzelne Kopie eines LOF-Alleels für ein bestimmtes Gen eine dominante Erkrankung durch haplounzureichende Mechanismen verursachen kann.
      HINWEIS: Der Blick auf den pLI-Score eines Gens hat einen Wert, insbesondere wenn es um dominante Erkrankungen geht, die als schwere pädiatrische Erkrankungen im Zusammenhang mit de novo-Varianten vorkommen. Wenn ein Gen einen pLI-Wert von 0,00 hat, bedeutet dies, dass es sehr tolerant gegenüber LOF-Varianten ist, so dass das Gen unwahrscheinlich ist, dass es eine Krankheit über einen dominanten Haploinsuffizienzmechanismus verursacht. Dies schließt jedoch nicht notwendigerweise aus, dass andere dominante Funktionsgewinne (GOF) oder dominante negative vermittelte Mechanismen Krankheiten verursachen können. Darüber hinaus können Gene, die die rezessiven Krankheiten verursachen, niedrige pLI-Werte haben, da Karrieren in der allgemeinen Bevölkerung erwartet werden. Andererseits ist es möglich, dass der Verlust einer Kopie dieses Gens für die menschliche Gesundheit schädlich ist, wenn ein Gen einen pLI-Wert von 1,00 hat. Zusätzliche Suchanfragen in Websites wie DOMINO (https://wwwfbm.unil.ch/domino/) können auch in Kombination verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Variante in einem bestimmten Gen zu beurteilen, die eine dominante Störung verursacht.
    2. Verwenden Sie die nächsten beiden Boxen, um die Allelfrequenzen der Variante von Interesse an ExAC bzw. gnomAD zu erhalten, bzw. um zu interpretieren, ob die Variante pathogen sein kann, je nachdem, ob der Patient die dominante oder rezessive Erkrankung hat. Dieses Feld wird nur angezeigt, wenn der Benutzer beim Einieren der Suche Varianteninformationen eingibt.
      HINWEIS: Wenn man ein rezessives Krankheitsszenario vermutet und der pLI-Score des Gens von Interesse niedrig ist, sollte man auf die hier aufgeführte Allelhäufigkeit achten. Einige Genetiker können einen Cut-off-Punkt von 0,005 bis 0,0001 als maximale Allelhäufigkeit für pathogene Varianten festlegen, die eine schwere rezessiv vererbte Krankheit verursachen können2. Auf der anderen Seite, wenn man ein dominantes Krankheitsszenario vermutet, ist es weniger wahrscheinlich, die identische oder ähnliche Variante in einer Kontrollpopulation zu finden. Auch dies erfordert Vorsicht, da Personen mit spät auftretenden Störungen, Krankheiten mit leichter Darstellung, psychiatrischestörungen oder Krankheiten, die nicht von den ExAC/gnomAD-Forschern untersucht werden, immer noch einbezogen werden können und die Variante immer noch eine dominante pathogene variante. Auch gab es einige Fälle von Varianten im Zusammenhang mit pädiatrischen Bedingungen in einigen Personen in diesen Datenbanken gefunden12,13,14, möglicherweise aufgrund unvollständiger Penetranz oder somatischer Mosaikismus13 , 15 , 16. Darüber hinaus werden ExAC und gnomAD zwar Varianten anzeigen, die in einem homozygoten Zustand gefunden werden, aber es wird nicht angegeben, ob eine der Varianten in einem zusammengesetzten heterozygoten Zustand gefunden wird. Schließlich werden einige Varianten, die in diesen Datenbanken gefunden werden, aufgrund technischer Herausforderungen bei der Sequenzierung als wenig vertraulich markiert (z. B. geringe Sequenzabdeckung, sich wiederholende Sequenz). Um diese Datensätze genauer zu untersuchen, wird Benutzern empfohlen, die schaltfläche externer Links zu verwenden, um die ursprünglichen ExAC- und gnomAD-Websites zu besuchen, um zusätzliche Informationen zu erhalten.
  3. Klicken Sie auf Geno2MP (Genotype to Mendelian Phenotype Browser, http://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/), eine Sammlung von WES-basierten Daten vom University of Washington Center for Mendelian Genetics. Es enthält etwa 9.600 Exome (Stand: 18.11.2019) betroffener Personen und nicht betroffener Verwandter mit einigen phänotypischen Beschreibungen (Abbildung 1).
    1. Verwenden Sie das Feld Krankheitspopulation, um die Allelhäufigkeit der Variante des Interesses an dieser Kohorte zu erhalten.
    2. Verwenden Sie die Feld Gene-Phenotype-Beziehungen, um HPO (Human Phänotyp Ontologie)17 Begriffe für die Personen mit der Variante von Interesse zu erhalten. Dies ist eine von vielen Möglichkeiten für einen, nach Patienten zu suchen, die die gleiche Krankheit haben können.
      HINWEIS: Wenn ein Gen von Interesse im Verdacht steht, mit der Krankheit eines Patienten in Verbindung gebracht zu werden, und es Übereinstimmungen in Geno2MP gibt, können zusätzliche wichtige Informationen in der Datenquelle vorhanden sein, die über das angezeigte hinausgeht.
      1. Klicken Sie auf die schaltfläche externer Link zur genspezifischen Seite auf Geno2MP, filtern Sie nach Mutationen, die denen des Patienten ähneln (z. B. Missense, LOF), und überprüfen Sie sorgfältig die Variantenlisten. Notieren Sie sich die Varianten mit hohen CADD 18-Scores und klicken Sie in die HPO-Profile. Beispielsweise liegen CADD-Werte, die höher als 20 sind, innerhalb der obersten 1 % aller Varianten, die als schädlich vorhergesagt werden, CADD-Werte, die höher als 10 sind, innerhalb der oberen 10 %. HPO-Begriffe bieten eine standardisierte Beschreibung menschlicher Phänotypen. Stellen Sie hier sicher, ob die Variante bei einer betroffenen Person oder in einem Verwandten identifiziert wurde.
      2. Wenn Varianten bei Patienten gefunden werden, die im selben Organsystem wie der Patient betroffen sind, sollten Sie das E-Mail-Formular verwenden, um den Arzt zu kontaktieren, der diese Fälle mit der auf der Geno2MP-Website bereitgestellten Funktion an Geno2MP übermittelt hat.
        HINWEIS: Nicht alle Ärzte reagieren auf solche Fragen, daher sollte man andere Wege der Patienten-Matchmaking erkunden. Eine andere Möglichkeit, eine Kohorte von Patienten zu sammeln, die von denselben Krankheiten betroffen sind, ist die Verwendung von Tools wie GeneMatcher19 (https://www.genematcher.org/) und anderen Datenbanken, die Teil der Matchmaker Exchange19,20 ( https://www.matchmakerexchange.org/). Weitere Informationen zum Matchmaking finden Sie im begleitenden JoVE-Artikel21.
  4. Verwenden Sie die Von den National Institutes of Health (NIH) unterstützte Datenbank ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)22, in der Forscher und Kliniker Varianten mit oder ohne Bestimmung der Pathogenität einreichen, Single Nukleotidvarianten (SNV), kleine Indels und größere Kopiernummernvariationen (CNV).
    1. Verwenden Sie die oberste Zeile, um eine Zusammenfassung der Anzahl der einzelnen in ClinVar gemeldeten Variantentypen zu überprüfen (Abbildung 1).
    2. Überprüfen Sie die Liste der Varianten unten im Feld Gemeldete Alleles von ClinVar.
      HINWEIS: Wenn eine Variante in die erste Suche einbezogen wurde, sind die hervorgehobenen Varianten in Petrol alle Varianten, die die genomische Position der Variante von Interesse [einschließlich großer CNVs, die oft als; genomische Koordinate... x1 (Löschen) und ... x3 (Duplizierung)].
  5. Verwenden Sie DGV23 (Datenbank genomischer Varianten, http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home) und DECIPHER24 (DatabasE der GenomiC-VarIation und des Phänotyps beim Menschen mit Ensembl-Ressourcen, https://decipher.sanger.ac.uk/), beide DGV ist die größte öffentlich zugängliche Sammlung von Strukturvarianten von mehr als 54.000 Personen. Diese Datenbank enthält Proben von angeblich gesunden Personen, zum Zeitpunkt der Feststellung, aus bis zu 72 verschiedenen Studien. Ebenso enthalten die von DECIPHER angezeigten Daten allgemeine Varianten aus der Steuerelementpopulation.
    HINWEIS: Da MARRVEL nicht über die Berechtigung verfügt, von DECIPHIER abgeleitete Patientendaten anzuzeigen, wird den Benutzern empfohlen, direkt die DECIPHER-Website zu besuchen, um auf potenziell pathogene CNV-Informationen zuzugreifen.
    1. Klicken Sie auf das Feld Kopiernummernvariation in der Kontrollpopulation (DGV-Datenbank), um Varianten zu erhalten, die das betreffende Gen enthalten. Informationen wie Größe, Untertyp und Verweis auf die Änderung der Kopiernummer finden Sie im selben Feld.
    2. Klicken Sie auf das Feld Allgemeine Kopiernummernvarianten (DECIPHER-Datenbank), um Varianten zu erhalten, die den genomischen Standort der Interessenvariante enthalten. Diese Informationen können helfen festzustellen, ob das Gen in den Kontrollpersonen dupliziert oder gelöscht wird.
      HINWEIS: Wenn das Gen von Interesse bei vielen Individuen in der Kontrollpopulation gelöscht wird, bedeutet dies, dass dieses Gen wahrscheinlich sehr tolerant gegenüber LOF-Varianten ist. Wie niedrige pLI-Werte deutet dies darauf hin, dass ein einzelner Kopierverlust dieses Gens weniger wahrscheinlich eine schwere Krankheit über einen Haploinsuffizienzmechanismus verursacht. Dies schließt jedoch nicht notwendigerweise andere dominante Funktionsgewinne oder dominante negative Mechanismen (z. B. antimorphe, hypermorphe und neomorphe Allele) aus, die durch spezifische Fehlsinnen und Schnittallele verursacht werden.  Mögliche Einschränkungen dieser Daten sind die Variation der Quelle und der Methode der erfassten Daten, der Mangel an Informationen über unvollständige Penetranz pathogener CNVs und die Frage, ob Einzelpersonen nach der Datenerhebung bestimmte Krankheiten entwickelt haben.

3. Verwendung von Modellorganismusdaten in MARRVEL

  1. Verwenden Sie die Gene Function Table, um die folgenden Informationen für acht Modellorganismen zu erhalten, einschließlich Mensch, Ratte, Maus, Zebrafisch, Drosophila, C elegans,angehende Hefe und Spalthefe):
    1. Genname: Da jeder Genname mit Genseiten in den jeweiligen Modellorganismus-Datenbanken verknüpft ist, klicken Sie auf diese Links, um mehr über die phänotypischen Informationen und Ressourcen zu erfahren, die für jeden Modellorganismus verfügbar sind. Auf FlyBase25 (http://flybase.org/) wird es beispielsweise eine Liste aller alleLe geben, die generiert wurden, ihre jeweiligen Phänotypen und die Verfügbarkeit jedes Alleels aus öffentlichen Lagerzentren.
    2. PubMed Link: Klicken Sie auf den PubMed-Link, um zu einer Liste von Publikationen zu gehen, die sich auf das Gen von Interesse in jedem Organismus beziehen. Ohne diese Links zu verwenden, kann die Suche nach dem menschlichen Gen direkt in PubMed dazu führen, dass einige Publikationen fehlen, die einen alten Genalias verwendet haben, um auf das menschliche Gen zu verweisen. In ähnlicher Weise können Modellorganismus-Gennamen historisch schwankt haben.
    3. DIOPT 9 Punktzahl: Überprüfen Sie diese Spalte auf eine Bewertung, wie viele Ortholog-Vorhersagealgorithmen vorhersagen, dass das Gen wahrscheinlich ein Ortholog des menschlichen Gens von Interesse ist. Man kann eine DIOPT-Punktzahl von 3 oder höher als angemessene Cut-off verwenden, um solide Ortholog-Kandidaten zu identifizieren. Es gibt jedoch Fälle, in denen echte Orthologs aufgrund der begrenzten Homologie nur einen DIOPT-Score von 1 haben. An der Spitze der Genfunktionstabelle, deaktivieren Sie die "Nur bestes DIOPT-Score-Gen anzeigen" und zeigen Sie alle Kandidaten an, die typischerweise homologe Gene enthalten, die nicht unbedingt Orthologs sind.
    4. Expression: Überprüfen Sie in dieser Spalte die Liste der Gewebe, bei denen das Gen oder Protein von Interesse in Datenbanken für menschliche oder Modellorganismen exprimiert wurde. Die Daten der menschlichen Gen- und Proteinexpression stammen aus GTEx26 (https://gtexportal.org/) bzw. Human Protein Atlas27 (https://www.proteinatlas.org/). Einige haben eine Schaltfläche mit Pop-up-Links, z. B. für Mensch und Für fliegen, die das Ausdrucksmuster mit einer Heatmap anzeigen, während andere zu den entsprechenden Seiten der Modellorganismus-Datenbanken verlinkt sind.
    5. Gene Ontologie 28 (GO)-Begriffe: Filtern Sie nach experimentellen Beweiscodes und beziehen Sie diese aus den jeweiligen Datenbanken für menschliche oder Modellorganismen. GO-Begriffe, die auf "Datenanalyse-Beweiscodes" und "elektronischen Anmerkungsbeweiscodes" (Vorhersagen) basieren, werden nicht angezeigt. Bitte besuchen Sie jede Website des Modellorganismus, um diese Informationen bei Bedarf zu sammeln.
    6. Weitere Links wie Monarch Initiative29 (https://monarchinitiative.org/) und IMPC30 (http://www.mousephenotype.org/): Verwenden Sie den Hyperlink monarch Initiative, um zur Phenogrid-Seite zu navigieren für das spezifische menschliche Gen ein Diagramm, das einen schnellen Vergleich zwischen den Phänotypen bietet, die mit dem Gen von Interesse zu bekannten menschlichen Krankheiten verbunden sind, und Modellorganismus-Mutanten, die phänotypische Überlappungen aufweisen. Wenn ein Maus-Gen eine Knockout-Maus hat, die vom International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC) hergestellt oder geplant wurde, verweist das "IMPC" auf die Seite, die den Phänotyp der Knockout-Maus und ihre Verfügbarkeit von öffentlichen Lagerzentren beschreibt.
  2. Human Protein-Domains: Verwenden Sie die Box für menschliche Genproteindomänen, um vorhergesagte Proteindomänen des menschlichen Gens zu erhalten. Die Daten werden von DIOPTabgeleitet, das Pfam (https://pfam.xfam.org/) und CCD (Conserved Domains Database, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml) verwendet. Ein einzelner Rückstand wurde möglicherweise mehr als einmal durch einige Überschneidungen in Domänen, die in den beiden Quellen mit Anmerkungen anmerkungiert wurden, mit Anmerkungen.
  3. Verwenden Sie die Feld Multiple Protein Alignment, um die von DIOPT9 erzeugte Aminosäure-Mehrfachausrichtung zu erhalten, die menschliche (hs), Ratte (rn), Maus (mm), Zebrafische (dr), Fruchtfliegen (dm), Wurm (ce) und Hefen (sc und sp) umfasst. Um die Aminosäure von Interesse hervorzuheben, scrollen Sie nach unten in der Box und geben Sie die Aminosäurenummern unten ein und die Aminosäuren von Interesse werden in Petrol hervorgehoben. Die Ausrichtung wird von DIOPT bereitgestellt und verwendet MAFFT Aligner (Multiple Alignment Program for amino acid or nukleotide sequences, https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/31).
    HINWEIS: Wenn die Aminosäure, die basierend auf der Zahl hervorgehoben wird, nicht diejenige ist, die erwartet wird, kann dies auf verschiedene Spleißisoformen zurückzuführen sein, die für die Ausrichtung verwendet werden. Im Prinzip verwendet DIOPT die längste Isoform, um in diesem Feld angezeigt zu werden. Auch für Segmente von Genen, die nicht gut konserviert sind, ist die Ausrichtung von Sequenzen mit mehreren Arten unter Verwendung von Standardparametern möglicherweise nicht optimal. Wir empfehlen die Verwendung anderer Websites und Software wie Clustal Omega und ClustalW/X (http://www.clustal.org/)32, um die Ausrichtungsparameter und Matrizen entsprechend zu optimieren.

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Ergebnisse

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Humangenetiker und Modellorganismus-Wissenschaftler verwenden JEWEILS MARRVEL auf unterschiedliche Weise, jeder mit unterschiedlichen gewünschten Ergebnissen. Im Folgenden sind drei Vignetten der möglichen Verwendungsmöglichkeiten für MARRVEL.

Bewertung der Pathogenität einer Variante bei einer dominanten Krankheit
Die meisten Benutzer, die MARRVEL besuchen, nutzen diese Website, um die Wahrscheinlichkeit zu analysieren, dass eine seltene menschliche Variante eine bestimmte...

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Diskussion

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Zu den kritischen Schritten in diesem Protokoll gehören die anfängliche Eingabe (Schritte 1.1-1.3) und die anschließende Interpretation der Ausgabe. Der häufigste Grund, warum Suchergebnisse negativ sind, ist aufgrund der vielen Möglichkeiten, wie ein Gen und/oder eine Variante beschrieben werden kann. Während MARRVEL planmäßig aktualisiert wird, können diese Aktualisierungen zu Trennungen zwischen den verschiedenen Datenbanken führen, zu denen MARRVEL verknüpft ist. Der erste Schritt bei der Fehlerbehebung besteht daher...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Wir danken Drs. Rami Al-Ouran, Seon-Young Kim, Yanhui (Claire) Hu, Ying-Wooi Wan, Naveen Manoharan, Sasidhar Pasupuleti, Aram Comjean, Dongxue Mao, Michael Wangler, Hsiao-Tuan Chao, Stephanie Mohr und Norbert Perrimon für ihre Unterstützung bei der Entwicklung und Wartung von MARRVEL. Wir danken Samantha L. Deal und J. Michael Harnish für ihren Beitrag zu diesem Manuskript.

Die erste Entwicklung von MARRVEL wurde teilweise durch das Undiagnosed Diseases Network Model Organisms Screening Center durch den NIH Commonfund (U54NS093793) und durch das NIH Office of Research Infrastructure Programs (ORIP) (R24OD022005) unterstützt. JW wird vom NIH Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development (F30HD094503) und der Robert and Janice McNair Foundation McNair MD/PhD Student Student Program am BCM unterstützt. Die HJB wird weiterhin vom NIH National Institute of General Medical Sciences (R01GM067858) unterstützt und ist EinForscher des Howard Hughes Medical Institute. ZL wird vom NIH National Institute of General Medical Science (R01GM120033), dem National Institute of Aging (R01AG057339) und der Huffington Foundation unterstützt. SY erhielt zusätzliche Unterstützung vom NIH National Institute on Deafness and other Communication Disorders (R01DC014932), der Simons Foundation (SFARI Award: 368479), der Alzheimer es Association (New Investigator Research Grant: 15-364099), Naman Family Fund for Basic Research und Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
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HumangenetikDECIPHERPMID: 19344873 https://decipher.sanger.ac.uk/
HumangenetikDGVPMID:  24174537http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home
Orthologie VorhersageDIOPTPMID: 21880147 https://www.flyrnai.org/cgi-bin/DRSC_orthologs.pl
Nomenklatur des menschlichen Gens/TranskriptsEnsemblPMID: 29155950 https://useast.ensembl.org/
HumangenetikExAC PMID: 27535533http://exac.broadinstitute.org/
Primäre Modellorganismus-DatenbankenFlyBase (Drosophila)PMID:26467478http://flybase.org
Modellorganismus-Datenbank-IntegrationstoolsGene2FunctionPMID: 28663344http://www.gene2function.org/search/
HumangenetikGeno2MPN/Ahttp://geno2mp.gs.washington.edu/Geno2MP/
HumangenetikgnomADPMID: 27535533http://gnomad.broadinstitute.org/
Gene OntologyGO CentralPMID: 10802651, 25428369 http://www.geneontology.org/
Humane Gen-/ProteinexpressionGTExPMID: 29019975, 23715323 https://gtexportal.org/home/
Nomenklatur des menschlichen GensHGNCPMID: 27799471 https://www.genenames.org/
Primäre Datenbanken für ModellorganismenIMPC (Maus)PMID: 27626380http://www.mousephenotype.org/
Primäre Datenbanken für ModellorganismenMGI (Maus)PMID:25348401Integrationstools für
http://www.informatics.jax.org/ Modellorganismus-DatenbankenMonarch InitiativePMID: 27899636https://monarchinitiative.org/
Humane VariantennomenklaturMutalyzerPMID: 18000842 https://mutalyzer.nl/
HumangenetikOMIMPMID: 28654725https://omim.org/
Primäre Modellorganismus-DatenbankenPomBase (Spalthefe)PMID:22039153 https://www.pombase.org/
LiteraturPubMedN/Ahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Primäre Modellorganismus-DatenbankenRGD (Rat)PMID:25355511 https://rgd.mcw.edu/
Datenbanken für primäre ModellorganismenSGD (knospende Hefe)PMID: 22110037https://www.yeastgenome.org/
Expression menschlicher Gene/ProteineDer Human Protein AtlasPMID: 21752111https://www.proteinatlas.org/
Primäre Datenbanken für ModellorganismenWormBase (C. elegans)PMID:26578572http://wormbase.org
Datenbanken für primäre ModellorganismenZFIN (Zebrafisch)PMID:26097180https://zfin.org/

Referenzen

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