Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.

Abstract

Cholangiopathies, die extrahepatische Gallengänge (EHBDs) beeinflussen, gehören biliären Atresie, Primär sklerosierende Cholangitis und Gallengangskarzinom. Sie haben keine effektive therapeutische Optionen. Werkzeuge, um EHBD zu studieren, sind sehr begrenzt. Unser Ziel war es, eine Organ-spezifischen, vielseitig, Erwachsenen Stammzellen abgeleitet, präklinische Cholangiocyte Modell zu entwickeln, die leicht vom Wildtyp und gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden können. So berichten wir über die neuartige Technik der Entwicklung eines EHBD organoide (EHBDO) Kultur von Erwachsenen Maus EHBDs. Das Modell ist kostengünstig, leicht analysiert werden, und hat mehrere downstream-Anwendungen. Im einzelnen beschreiben wir die Methodik der Maus EHBD Isolation und einzelne Zelle Dissoziation, organoide Kultur Einleitung, Fortpflanzung, und langfristige Wartung und Lagerung. Dieses Manuskript beschreibt auch EHBDO Verarbeitung für Immunohistochemistry, Fluoreszenz-Mikroskopie und mRNA Fülle Quantifizierung durch Echtzeit-quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dieses Protokoll hat deutliche Vorteile neben der Produktion von EHBD-spezifische Organellen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums aus L-WRN Zellen reduziert deutlich die Kosten für dieses Modell. Die Verwendung der Maus EHBDs bietet fast unbegrenzte Gewebe für Kultur-Generation, im Gegensatz zu menschlichem Gewebe. Generierte Maus EHBDOs enthalten eine reine Bevölkerung von Epithelzellen mit Markern der endodermische Stammvater und differenzierte biliären Zellen. Kultivierte Organellen homogene Morphologie durch mehrere Gänge zu erhalten und nach längerer für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff gewonnen werden können. Das Modell ermöglicht die Untersuchung der Gallenwege Stammvater Zellproliferation, pharmakologisch manipuliert werden und kann aus gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden. Zukünftige Studien werden benötigt zur Optimierung der Kulturbedingungen um Effizienzsteigerung Beschichtung, funktionale Zelle Reife und direkten Zell-Differenzierung zu bewerten. Entwicklung von Kokulturen Modellen und einer mehr biologisch neutral extrazelluläre Matrix sind ebenfalls wünschenswert.

Introduction

Cholangiopathies sind unheilbare chronische progressive Störungen, die biliären Zellen in Intra- und extrahepatische Gallenwege Kanäle (EHBDs)¹betreffen. Einige Cholangiopathies, wie primäre sklerosierende Cholangitis, Gallengangskarzinom und biliären Atresie Choledochal Zysten betreffen überwiegend EHBDs. Entwicklung von Therapien für Cholangiopathies ist durch die begrenzte Verfügbarkeit von präklinischen Modellen eingeschränkt. Darüber hinaus früheren Studien konzentrierten sich auf Cholangiopathies zusammengefasst: Leber, Intra- und EHBDs. Allerdings Intra- und EHBDs haben einen ausgeprägten embryonalen Ursprung, und gilt somit als untersch....

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung und Materialien für die Maus EHBD Isolierung

1. Bereiten Sie seeding Medium und waschen Puffer (Table of Materials) in 50 mL konische Röhrchen vor und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis bis zur Verwendung.
2. Richten Sie eine OP-Tisch (Abb. 1 b). Bereiten Sie sterilisierte chirurgische Instrumenten (Abbildung 1).
3. Legen Sie eine sterile 24-Well-Platte im 37 ° C Gewebekult....

Results

Unser Protokoll beschreibt die Generation der Maus EHBD Organellen, die gewebespezifische und Erwachsenen Stammzellen abgeleitet sind. Nachdem die Organellen kultiviert werden, kann eine zystische Struktur Formation bereits 1 Tag nach der EHBD Isolation beobachtet werden. Kontamination mit Fibroblasten wird in der Regel nicht während Kultur Generation beobachtet. EHBDO Beschichtung Effizienz beträgt ca. 2 % Wenn Sie isoliert von Neugeborenen oder Erwachsenen (älter als 2 Monate) Mäuse (

Discussion

Diese Arbeit beschreibt die Generation eine organotypischen 3-dimensionales Modell der Maus EHBD Cholangiocytes. Wichtige Schritte zur EHBDO Kultur Generation gehören sorgfältige EHBD Dissektion zur Vermeidung von Bauchspeicheldrüse Zelle Kontamination, Wartung von sterilen Bedingungen gegen Bakterien- und Pilzinfektionen Kontamination und sorgfältige Manipulation nach der Zentrifugierung zu vermeiden die Verlust von Zellmaterial. Eine enge Einhaltung der beschriebenen Temperaturbedingungen ist erforderlich. Es gibt eini.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-WRN Zellkulturmedium
Advanced DMEM/F12		Life Technologies	12634-010
Fötales Rinderserum (FBS)	1%	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	100 U/ml	Life Technologies	15140-122
Waschpuffer
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	50 mL	Life Technologies	10010-023
Penicillin-Streptomycin	125 U/mL	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	6,25 & Mikro; g/mL	Life Technologies	15290-018
Organoid-Nährmedium
L-WRN Konditioniertes Medium	1:1	ATCC	CRL-3276
Advanced DMEM/F12	1:1	Life Technologies	12634-010
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
N-Glutamin	10 & Mikro; l/mL	Life Technologies	35050-061
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure, HEPES	10 mM	Life Technologies	15630-080
B27	10 & Mikro; l/mL	Gibco	17504-044
N2	10 µ l/mL	Gibco	17502-048
Organoid-Aussaatmedium
Organoid-Nährmedium
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)50	ng/ml	Invitrogen	PMG8041
Fibroblasten-Wachstumsfaktor-10 (FGF10)	100 ng/ml	PeproTech	100-26
Primäre Antikörper
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) Antikörper, Kaninchen	1:250	Abcam	ab53119
Geschlechtsbestimmende Region Y-Box 9 (SOX9) Antikörper, Kaninchen	1:200	Santa Cruz	sc-20095
Pankreas Duodenal Homeobox 1 (PDX1) Antikörper, Kaninchen	1:2000	DSRB	F109-D12
E-Cadherin Antikörper, Ziege	1:500	Santa Cruz	sc-31020
Acetylierter α-Tubulin Antikörper, Maus	1:500	Sigma-Aldrich	T6793
Sekundärantikörper
488 markiertes Anti-Kaninchen, Esel IgG	1:1000	Invitrogen	A-21206
594 markiertes Anti-Ziegen, Esel IgG	1:1000	Invitrogen	A-11058
568 markiertes Anti-Maus, Ziege IgG2b	1:500	Invitrogen	A-21144
TopFlash Wnt Reporter Assay
TopFlash HEK293 Zelllinie		ATCC	CRL-1573
Luciferase Assay Kit		Biotium	30003-2
0,05 % Trypsin-EDTA		Life Technologies	25300054
0,4 % Trypanblau Lösung		Life Technologies	15250061
Zusätzliche Materialien und Reagenzien
Basement Matrix, phenolfreies Matrigel		CORNING	356237
Dissoziationspuffer, Accutase		Gibco	A1110501
Zellkultur-Gefriermedium, Recovery		Life Technologies	12648010
Zellsieb (70 & Mikro; m, steril)		Fisherbrand	22363548
Guanidiniumthiocyanat-Phenol-RNA-Extraktion, TRIzol		Invitrogen	15596026
Gel für die Probenverarbeitung, HistoGel		Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012
Universelles Mykoplasmen-Nachweiskit		ATCC	30-1012K
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen		Fisherbrand	05-408-129
24-Well-Platte		USA Scientific	CC7682-7524
50 mL konisches Zentrifugenröhrchen		Fisher Scientific	14-432-22
Fluoreszenzmikroskop		Nikon	Eclipse E800
Inverses Mikroskop		Biotium	30003-2
Autopsie-Tablett		Fisherbrand	13-814-61