Methodenartikel

Vorbereitung von Neutral-aufgeladenen, pH-responsiven polymischen Nanopartikeln für zytosolische siRNA Delivery

DOI:

10.3791/59549

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2. Mai 2019

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1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es werden Methoden zur Vorbereitung und Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und der Bioaktivität von neutral aufgeladenen, pH-responsiven siRNA-Nanopartikeln vorgestellt. Es werden Kriterien für erfolgreiche siRNA-Nanomedizine wie Größe, Morphologie, Oberflächenaufladung, siRNA-Ladung und Gen-Schweigung diskutiert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Erfolg von siRNA als zielgerichteter molekularer Medizin hängt von der effizienten zytosolischen Zufuhr an Zellen im Gewebe der Pathologie ab. Der klinische Erfolg bei der Behandlung von bisher "untrüglichen" Lebererkrankungen mit siRNA wurde erzielt. Eine effiziente TumorsiRNA-Zufuhr erfordert jedoch zusätzliche pharmakokinetische Gestaltungsüberlegungen, darunter lange Umlaufzeiten, Ausweichorgane (z.B . Leber und Nieren) sowie Tumordurchdringung und-bindung. Hier beschreiben wir die Zubereitung und in vitro physicochemical/biologische Charakterisierung von polymerischen Nanopartikeln, die für eine effiziente SiRNA-Lieferung, insbesondere für nicht-epatische Gewebe wie Tumoren, entwickelt wurden. Die siRNA-Nanopartikel werden durch elektrostatische Komplexe von siRNA und dem DBlock-Copolymer-Poly (Ethylen-Glykol-b-[2-(Dimethylamino) Meylmethacrylate-Co-Butylmethacrylat]) (PEG-DB) zu Polyionen hergestellt. In der Lage, sich in der Lage zu befinden, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage sind, die in der Lage zu sein. Darüber hinaus wird der DB-Block als Vesikel des endolysosomalen Pfades (< pH 6.8), was endosomale Escape-und zytosolische Lieferung von siRNA auslöst. Es werden Methoden beschrieben, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften von siRNA-Nanopartikeln wie Größe, Oberflächenaufladung, Partikelmorphologie und siRNA-Belastung zu charakterisieren. Die Bioaktivität von siRNA-Nanopartikeln wird mittels Luciferase als Modell-Gen in einem schnellen und hochdurchgehenden Gen-Schweigungsanfall gemessen. Entwürfe, die diese ersten Tests bestehen (wie PEG-DB-basierte Polyplexe), gelten als geeignet für die Übersetzung in präklinische Tierstudien, die die Lieferung von siRNA an Tumoren oder andere Orte der Pathologie bewerten.

Einleitung

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Da siRNAs die Übersetzung von Proteinen aus mRNA-Sequenzen hemmen, können sie theoretisch verwendet werden, um alle bekannten Pathologien1,2, 3,4,5zumedikamentös zu machen. Der Einsatz von siRNA in der Medizin wird jedoch durch das umfassend schlechte pharmakokinetische Profil von siRNA-Molekülen 6,7begrenzt. Wenn sie intravenös injiziert werden, werden siRNAs schnell durch die Nieren und/oder durch Nukleasen8,9abgebaut. Aufgrund seiner großen Größe und negativen Ladung kann siRNAnichtin die Zellen eindringen oder dem endolysosomalen Weg entkommen, um auf den RNA-induzierten Stillstandskomplex (RISC) zuzugreifen, der im Cytosol 10,11, 12, 13. November So konzentriert sich der umfangreiche Aufwand auf die Konzeption und Umsetzung von siRNA-Lieferstrategien 14. Diese Bemühungen konzentrierten sich weitgehend auf die Entwicklung von lipid-und polymerbasierten Nanopartikeln, die siRNA verpacken, vor Räumung und Degradierung in vivo schützen und durch ionisierbare, kationelle Aminengruppen eine zelluläre Aufnahme und endosomale Flucht auslösen. Es wurden viele präklinische Erfolge gemeldet und zuletzt wurde der erste klinische Erfolg für die nanopartikel-basierte Leberlieferungen zur Behandlung der erblichen Transthyrein-vermittelten (hATTR) Amyloidose 15 gemeldet.

Es gibt viele krebserregende Gene, die derzeit von der konventionellen Pharmakologie "nicht rugdfähig" sind (z.B. kleine Molekülmedikamente), die das Design von polymerischen siRNA-Nanopartikeln (si-NPs) zur Behandlung von Krebs16 motivieren. Es gibt jedoch einen separaten Satz von Konstruktionsparametern, die für die nicht-hepatische siRNA-Lieferung berücksichtigt werden müssen. Das Liefersystem muss die kationische Ladung des Polyplex abschirmen, die eine Agglutination innerhalb der systemischen Zirkulation 17,18,19verursacht. Für die Tumorzufuhr ist insbesondere die si-NP Stabilität unerlässlich, um eine lange Zirkulation und damit eine erhöhte Akkumulation innerhalb von Tumoren durch die verbesserte Durchlässigkeit undRetentionseffekt (EPR) 20,21zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Kontrolle über die Größe von si-NP unerlässlich, da nur Nanopartikel mit einer Größe von etwa 20 – 200 nm Durchmesser EPR22und kleinere si-NPs (~ 20 – 50 nm Durchmesser) eine verbesserte Tumordurchdringung gegenüber größeren Nanopartikeln aufweisen und Mikropartikel23.

Um diesen zusätzlichen Konstruktionseinschränkungen für die systemische Tumorzustellung von siRNA nach intravenöser Verabreichung gerecht zu werden, wurden neutral aufgeladene, pH-reaktionsfähige si-NPs entwickelt (Abbildung 1)24. Diese si-NPs sind PEGylatierte,oder zuletzt Zwitterionierte 25, für neutrale Oberflächenaufladung und Resistenz gegen Proteinadsorption und Opsonisierung im Umlauf. Da sie sich nicht allein auf den kationischen Charakter verlassen können, um die intrazelluläre Lieferung voranzutreiben, ist ein äußerst effizientes endosomales Escape-Escape-Gebot, um eine starke Genverstallung zu erreichen. Dementsprechend besteht der Kern dieser si-NPs aus einem hochendosomolytischen Kern, der bei extrazellulärem pH-Wert (7,4) inert ist, aber in schalterlicher Weise unter den sauren Bedingungen des endolysosomalen Weges [pH 6.8 (frühe Endosomen) – 5.0 ausgelöst wird ( Lysosomen)]. Schließlich sorgt eine Mischung aus kationischem und hydrophobischem Gehalt im Kern der si-NPs für elektrostatische und van der Waals-Stabilisierungskräfte, die die Stabilität der si-NPs im Blut im Vergleich zu rein kationischen Systemen verbessern.

Die Integration vieler Funktionen in ein relativ einfaches Design ist durch die reversible Addition-Fragmentierungskette Transfer (RAFT) zur Herstellung von Polymeren mit komplexer Architektur und präziser Komposition möglich. Zur Herstellung von Si-NPs mit neutraler Oberflächenaufladung, pH-Reaktionsfähigkeit und NP-Stabilität wird RAFT verwendet, um Poly (Ethylen-Glykol-b-[2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylate--Butylmethacrylat] zu synthetisieren. Abbildung 1A). PEG-DB ist elektrostatisch mit siRNA vervollbbar und bildet si-NPs mit einem PEG-Korona und DB/siRNA-Kern (Abbildung 1B). PEG bildet eine inerte, neutral geladene hydrophile Schicht auf der si-NP Corona. Der DB-Block besteht aus einem 50:50-molaren Verhältnis von 2-(Dimethylamino) Ethylmethacrylat (DMAEMA) und Butylmethacrylat (BMA). Die ationische DMAEMA umsetzt elektrostatisch die negativ geladene siRNA. BMA Selbst-assoziierte innerhalb der NP-Kern von van der Waals Interaktionen, die Erhöhung der NP-Stabilität. Gemeinsam vermitteln DMAEMA und BMA pH-abhängiges Lipidbilayer-lytisches Verhalten an den DB-Polymerblock. Bei extrazellulärem pH wird der DB-Block an den si-NP-Kern geklebt und ist inert auf Lipidbilayers. Unter sauren Bedingungen, wie zum Beispiel innerhalb des Endolysosomalpfads, erleichtert die ionisierbare DMAEMA innerhalb des DB-Blocks den Protonenschwamm-Effekt, bei dem die endosomale Pufferungzuosmotischer Schwellung und Bruch 26 führt. Darüber hinaus integrieren sich hydrophobe BMA-Moieanlagen innerhalb des DB-Blocks aktiv in und lysen Lipidbilayers, was zu einer starken Endosomolyse führt. So wird siRNA mit PEG-DB zu si-NPs Komplexiert, die neutral aufgeladen und bei extrazellulärem pH-Wert hochstabil sind, aber die Lipidbilayer bei saurem pH-Wert stören und so eine zytosolische Lieferung der siRNA-Nutzlast gewährleisten.

Hierin werden die experimentellen Verfahren beschrieben, um si-NPs von PEG-DB zu produzieren. Es werden Methoden zur Charakterisierung der physikalisch-chemischen Parameter und der Bioaktivität von si-NPs vorgestellt und diskutiert. Um die si-NP-Bioaktivität schnell zu bewerten, wird Luciferase als Modell-Gen für Knockdown-Studien eingesetzt. Firefly Luciferase ist das Protein, das für das "Glühen" der Glühwürmchen 27 verantwortlich ist. Entsprechend erzeugen Säugetierzellen, die mit dem firefly luciferase-Gen transferiert werden, ein biolumineszierendes "Glühen", das mit einem Leuchtometer erfasst werden kann, um die Werte der Luciferase-Expression zu quantifizieren. Hier verwenden wir Luciferase, um die Bioaktivität von si-NPs zu bewerten, indem wir siRNA gegen Luciferase liefern und die entsprechende Reduktion der Biolumineszenz in Luziferase-Ausdruckszellen im Vergleich zu Zellen quantifizieren, die eine Rührei siRNA erhalten.

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Protokoll

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1. Vorbereitung und Charakterisierung von si-NPs

  1. si-NP Vorbereitung
    1. Polymere in 10 mM-Zitronensäure-Puffer (pH 4.0) bei 3,33 mg/mL auflösen. Polymer kann zunächst bei 10x Konzentration in Ethanol aufgelöst werden, um die Auflösung zu gewährleisten.
      NOTE: Polymer kann in niedrigeren Konzentrationen aufgelöst werden, aber der Einsatz in Konzentrationen über 3,33 mg/mL kann eine homogene NP-Bildung verhindern.
    2. Fügen Sie siRNA (50 μM in diH2 O)hinzu, um N+:P- Verhältnis von 10 zu ergeben. Polymer-und siRNA-Lösungen gründlich durch Pipettieren mischen und 30 min inkubieren lassen. Das N+:P- Verhältnis stellt die Anzahl der positiv geladenen Amminegruppen auf dem Polymer zur Anzahl der negativ geladenen Phosphatgruppen auf der siRNA dar und wird durch die folgende Formel berechnet:
      figure-protocol-1
      Wo, mol Pol ist die molare Menge an Polymer, RU amine ist die Zahl der sich wiederholenden Einheiten von positiv geladenen Aminen pro Polymer, mol siRNA ist die molare Menge siRNA, und bp siRNA ist die Zahl der Basenpaare pro siRNA-Molekül.
    3. Fügen Sie einen 5-fach überschuss von 10 mM Phosphatpuffer (pH 8.0) hinzu und mischen Sie sanft entweder durch Pipetting oder Umkehrung der Röhre. Um zu bestätigen, dass der endgültige pH-Wert neutral ist (~ 7,2-7,5), pipette 10 μL si-NP-Lösung auf pH-Teststreifen.
      NOTE: Zitronensäure und Phosphatpuffer werden nach den Millipore Sigma Buffer Reference Center Charts zubereitet.
  2. Physikalisch-chemische Charakterisierung von si-NPs
  3. Zeichnen Sie die Größe und Oberflächenaufladung der resultierenden Si-NPs mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) auf. Bereiten Sie eine DLS-Probe vor, indem Sie 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) durch 0,45 μm Porengröße Spritzenfilter in einen quadratischen Quarz oder eine Polystyrren-Cuvette filtern. Rekordgröße und Flächenlademessungen mit einem DLS-Instrument nach Herstellerangaben.
    1. Bestätigen Sie die Größe und Morphologie von si-NPs durch die bildgebende Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
      1. 5 μL si-NP-Lösung bei 1 mg/mL zu TEM-Gittern hinzufügen und für 60 s inkubieren.
      2. 5 μL von 3% Uranyl-Acetatlösung hinzufügen und für 20 s inkubieren. Für 3 s trocken schlagen. Trockene Netze über Nacht unter Trocknung.
      3. Bildgitter nach dem Protokoll, das für das jeweilige Mikroskop eingerichtet wurde.
    2. Charakterisieren Sie die Belastung von siRNA in si-NPs an verschiedenen N+:P- Verhältnissen mit Agarose Gel-Retarung.
      1. Um 2% Acharose zu erzeugen, fügen Sie 2 g Elektrophorese-Ature-Pulver zu 100 ml 1x TAE (Tris-Acetate-EDTA) Puffer bei pH 8.0 hinzu. Rühren, um agentstanden. Hitze, die von Mikrowelle bedeckt ist, bis alle Acharose aufgelöst sind (1-3 min).
      2. Nach dem Abkühlen 5 μL Ethidiumbromid (10 mg/mL in H2 O)hinzufügen und gut vermischen. Gießen Sie den Awant in ein Gel-Tablett und legen Sie den Kamm, um Brunnen zu produzieren, so dass der Kamm 30 Minuten lang trocknen kann. Entfernen Sie vorsichtig den Kamm, um Brunnen zu hinterlassen, und füllen Sie das Gel-Tablett bis zur maximalen Fülllinie mit 1x TAE-Puffer.
      3. Generieren Sie si-NPs (nach dem oben genannten Verfahren) bei 0,1,2,5,7,10,20,Und 40 N+:P- Verhältnisse. 2 μL Aliquots von Ladefarbstoff (keine SDS und Reduktionsmittel) auf Paraffinfolie für jede si-NP-Formulierung legen. Mischen Sie 10 μL si-NP Lösung mit Ladefarbe auf Paraffin-Film per Pipette.
      4. Fügen Sie si-NP/Ladefarbfarblösungen zu agarose Gelbrunnen hinzu. Führen Sie die Spannungsquelle bei 100 V für 35 min aus (oder bis die Proben 80% der Gel-Länge durchlaufen haben).
      5. Visualisieren siRNA-Bands auf einem UV-Transilluminator nach Herstellerangaben.

2. Bestimmung der In-vitro-Bioaktivität von si-NPs

  1. Knockdown des Modell-Gens luciferase
    1. Generieren Sie luciferase si-NPs (nach dem oben genannten Verfahren) mit luciferase siRNA und Rührei si-NPs mit einer Rührei siRNA-Sequenz als Steuerung. Formualte sowohl si-NPs bei der gleichen endgültigen N+:P- Verhältnis und bei der optimalen Quote, die durch agarose Gel-Rastungsstudien identifiziert wird. Beispiel siRNA-Sequenzen sind in der Materialtabelleenthalten.
    2. Saatgutluziferase-Ausdruckzellen [MDA-MB-23olleinhalbLuciferase (Bsd) stabile Zellen] in 96-gut schwarz-wandigen Platten mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Brunnen. In einem Inkubator (37 ° C, 5% CO 2,95% Luftfeuchtigkeit) über Nacht in vollen Medien (DMEM, 10% FBS) einbleiben lassen.
    3. Für einen Endvolumen von 100 μL pro Brunnen und siRNA-Konzentration von 100 nM verdünnen Sie si-NPs in Voll-Serum-Medien. Zellen für 24 Stunden mit si-NPs behandeln.
    4. Nach 24 Uhr die Behandlungen entfernen und die Medien durch ein vollständiges Serummedium ersetzen, das 150 μg/mL D-luciferin enthält. Inkubieren Sie Zellen für 5 Minuten, bevor Sie die Lumineszenz auf einem Plattenleser oder in vivo optisches Bildgebungssystem nach den Vorgaben des Herstellers messen.
    5. Ersetzen Sie luciferin-haltige Medien durch frische, vollständige Serummedien und Inkubat 24 Stunden mehr. Wiederholen Sie den Schritt oben, entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie durch volle Serummedien mit 150 μg/mL D-luciferin, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation vor der Messung der Lumineszenz am 48-h-Zeitraffer.
    6. Bei Längsschnittstudien die Zellen unter sterilen Bedingungen halten und dabei die Lumineszenz messen. Weiter die Kultur in frischen, vollen Medien zwischen Messungen nach dem Austausch von luciferin-enthalten.
      Hinweis: Die entsprechende siRNA-Konzentration variiert mit verschiedenen si-NP-Molekülen und siRNA-Molekülen. Bei der Verwendung von neutral geladenen Polyplexen mit einem endosomolytischen Kern (z.B. PEG-DB) ist 100 nM von den Zellen typischerweise gut verträglich und produziert & gt;75% luciferase Knockdown. Das Massenverhältnis von PEG-DB zu siRNA bei 10 N+:P- Verhältnis und 100 nM siRNA-Behandlungen (unter der Annahme von 26 bp siRNA) beträgt 23,3, d.h. addieren 23,3 ng PEG-DB für jede 1,0 ng siRNA. Zum Beispiel 1,16 μL von 3,33 mg/mL Polymer für 166.5 ng siRNA hinzufügen, um einen gut bei 100 nM in einer 96-well-Platte (100 ml Medienvolumen pro Brunnen) zu behandeln.

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Ergebnisse

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Einige wesentliche Merkmale der effektiven si-NPs für die In-vivo siRNA-Lieferung sind die richtige Größe (~ 20 – 200 nm Durchmesser), siRNA-Verpackungen und Gen-Schweigenden Bioaktivität. Obwohl es sich hierbei nicht um eine erschöpfende Liste handelt (wie in der Diskussion angesprochen), sollten diese grundlegenden Merkmale bestätigt werden, bevor eine weitere Prüfung einer Formulierung in Erwägung gezogen wird.

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Diskussion

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Die hier beschriebenen si-NPs werden durch die elektrostatische Assoziation von anionischen siRNA und kationischen Polymeren zu Polyionenkomplexen (Polyplexe) gebildet. Die elektrostatische Verkomplexung von siRNA und dem kationischen DB-Block von PEG-DB-Polymeren wird durch das Mischen mit niedrigem pH-Wert (4.0) erleichtert. Bei pH 4.0 ist DMAEMA hoch protoniert, und damit ist der DB-Block hoch aufgeladen. Damit wird sichergestellt, dass sich die Polymere als Eindringlinge in der Lösung auflösen und keine Mikellen bild...

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Offenlegungen

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Die Autoren offenbaren keine möglichen Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Die Autoren danken Dr. Craig Duvall und Rebecca Cook für den Zugang zu Daten und Laborressourcen für die Durchführung dieser Forschung. Die Autoren danken dem Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) für den Zugang zu den Instrumenten DLS und TEM (NSF EPS 1004083). Die Autoren sind der National Science Foundation dankbar, dass sie das Graduate Research Fellowship Program (NSF#1445197) unterstützt hat. Die Autoren danken den National Institutes of Health für die finanzielle Unterstützung (NIH R01 EB019409). Die Autoren danken dem Programm "Department of Defense Congressionally Directed Medical Research" für finanzielle Unterstützung (DOD CDMRP OR130302).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 μ m SpritzenvorsatzfilterThermo Fisher ScientificF2513317 mm Durchmesser, PTFE-Membran
0-14 pH-TeststreifenMillipore SigmaP4786
10x TAE-PufferThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7,7 pH-TeststreifenMillipore SigmaP3536
96-Well-Platten mit schwarzen WandwändenCorning3603Mit Gewebekulturen behandeltes
Agarose-PulverThermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Zitronensäure-Monohydrat,Millipore SigmaC1909
zweibasisches Natriumphosphat-DihydratMillipore Sigma71643
D-Luciferin,Thermo Fisher Scientific88294Monokaliumsalz
DMEMGibco 11995065Ethanol
MilliporeSigma 459836
Thermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
Gibco26140079
LadefarbstoffThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDTN/AAntisense-Strangsequenz: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense-Strangsequenz: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA-Basen
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stabile ZellenGenTarget IncSC059-BsdLuciferase-exprimierende Zellen zur Bewertung der si-NP-Bioaktivität verklagt
monobasisches Natriumphosphat-MonohydratMillipore SigmaS9638
Scarmbled siRNAIDTN/ AAntisense-Strangsequenz: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense-Strangsequenz: CGUUAAUCGGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA-Basen
quadratische Polystyrol-KüvettenFisher Scientific14-955-129 TEM-Gittermit einer Kapazität von 4,5 ml
TedPella, Inc.1GC50PELCO Center-Marked Gitter, 50 Mesh, 3,0 mm Außendurchmesser,
Kupfertrinatriumcitrat-Dihydrat,Millipore SigmaS1804
UranylacetatPolysciences, Inc.Artikel-Nr.: 21447-25
, , , , , , , , Ethidiumbromid mit hohem Glukose- und Pyruvatgehalt, FBS, ,

Referenzen

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Schlagwörter

Dynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAgarose Gel RetardationEndosomal EscapepH responsive PolymerCytosolic DeliveryGene Silencing Assay

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