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Methodenartikel

Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel

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DOI:

10.3791/59555

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30. April 2019

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir zeigen die einzellige Kultur von Bakterien in riesigen Vesikeln (GVs). GVs, die Bakterienzellen enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode hergestellt und auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat zur direkten Beobachtung des Bakterienwachstums immobilisiert. Dieser Ansatz kann auch an andere Zellen angepasst werden.

Zusammenfassung

Wir haben eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzelliger Ebene in Riesigen Vesikeln (GVs) entwickelt. Bakterielle Zellkultur ist wichtig für das Verständnis der Funktion von Bakterienzellen in der natürlichen Umgebung. Aufgrund des technologischen Fortschritts können verschiedene bakterielle Zellfunktionen auf einzelzeller Ebene auf engstem Raum aufgedeckt werden. GVs sind kugelförmige mikrogroße Kompartimente, die aus amphiphilen Lipidmolekülen bestehen und verschiedene Materialien, einschließlich Zellen, aufnehmen können. In dieser Studie wurde eine einzelne Bakterienzelle durch die Tröpfchenübertragungsmethode in 10–30 m GVs eingekapselt und die GVs, die Bakterienzellen enthielten, auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat immobilisiert. Unsere Methode ist nützlich, um das Echtzeitwachstum einzelner Bakterien in GVs zu beobachten. Wir kultivierten Escherichia coli (E. coli) Zellen als Modell innerhalb von GVs, aber diese Methode kann an andere Zelltypen angepasst werden. Unsere Methode kann in den Bereichen Mikrobiologie, Biologie, Biotechnologie und Synthetische Biologie eingesetzt werden.

Einleitung

Die Kultur der Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene hat zunehmend Beachtung gefunden. Die Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb eines begrenzten Raumes kann bakterielle Funktionen wie phänotypische Variabilität1,2,3,4, Zellverhalten5, 6 , 7 , 8 , 9und Antibiotikaresistenz10,11. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in Kulturtechniken kann die Kultur einzelner Bakterien auf engstem Raum erreicht werden, z. B. in einem Well-Chip4,7,8, Geltröpfchen12,13 , und Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen5,11. Um das Verständnis oder die Nutzung einzelner Bakterienzellen zu fördern, sind weitere technische Entwicklungen der Kultivierungstechniken erforderlich.

Vesikel, die die biologische Zellmembran imitieren, sind kugelförmige Kompartimente, die aus amphiphilen Molekülen bestehen und verschiedene Materialien aufnehmen können. Vesikel werden nach Größe klassifiziert und umfassen kleine Vesikel (SVs, Durchmesser < 100 nm), große Vesikel (LVs, <1 m) und Riesenbläschen (GVs, >1 m). SVs oder LVs werden aufgrund ihrer Affinität zur biologischen Zellmembran14häufig als Arzneimittelträger eingesetzt. GVs wurden auch als Reaktorsystem für den Bau von Protozellen15 oder künstlicheZellen16verwendet. Die Verkapselung biologischer Zellen inGVs wurde 17,18berichtet, und somit zeigen GVs in Kombination mit dem Reaktorsystem Potenzial als Zellkultursystem.

Hier beschreiben wir zusammen mit einem Video von experimentellen Verfahren, wie VVs als neuartige Zellkulturgefäße verwendet werden können19. GVs, die Bakterien enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode20 hergestellt und dann auf einer unterstützten Membran auf einem Deckglas immobilisiert. Wir nutzten dieses System, um das Bakterienwachstum auf einzelzelliger Ebene in GVs in Echtzeit zu beobachten.

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Protokoll

1. Herstellung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, nach der Tröpfchenübertragungsmethode

  1. Bereiten Sie Lipid-Lagerlösungen von 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 ml) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) in Chloroform/ Methanollösung (2/1, v/v) und lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C.
  2. Herstellung einer lipidhaltigen Öllösung
    1. Gießen Sie 20 l der POPC-Lösung und 4 l der Biotin-PEG-DSPE-Lösung in ein Glasrohr (Abbildung1b i)).
    2. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom zu einem Lipidfilm und legen Sie den Film 1 h in einen Trockenbauort, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen (Abbildung 1b (ii)).
      HINWEIS: Es ist notwendig, das organische Lösungsmittel in einer Dunstabzugshaube zu verdampfen.
    3. Fügen Sie der Glasdurchstechflasche 200 l Mineralöl (0,84 g/ml, Materialtabelle)hinzu (Abbildung 1b (iii)).
    4. Den Eröffnungsteil der Glasdurchstechflasche mit Folie umwickeln und in einem Ultraschallbad (120 W) mindestens 1 h beschallen (Abbildung1b (iii)). Die Endkonzentrationen von POPC und Biotin-PEG-DSPE betragen 1 mM bzw. 0,002 mM.
  3. Vorkultur von Bakterienzellen
    1. E. coli in 1x LB Medium (1 g Hefeextrakt, 2 g Bacto Trypton und 2 g Natriumchlorid in 200 ml entionisiertem Wasser) aus einer LB-Platte impfen und bei 37 °C für 12–14 h (über Nacht) inkubieren.
    2. Nach der Inkubation 20 l der Kulturlösung sammeln und auf 1,98 ml frisches 1x LB-Medium übertragen und die Zellen für 2 h wieder kulturieren.
    3. Überprüfen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) Wert der Vorkulturlösung (vorbereitet in Schritt 1.3.2). Es sollte eine vorkulturelle Lösung von OD600 = 1.0–1.5 verwendet werden.
  4. Vorbereitung der äußeren und inneren wässrigen Lösungen von GVs
    1. Glukose in 1x LB-Medium auflösen, um eine äußere wässrige Lösung von GVs vorzubereiten. Bereiten Sie 20 ml einer Glukoselösung (500 mM) vor.
    2. Verdünnen Sie die Glukoselösung mit 1x LB medium bis 200 mM (Tabelle 1).
    3. Sucrose in 1x LB Medium auflösen, um eine innere wässrige Lösung von GVs vorzubereiten. Bereiten Sie 20 ml einer Saccharoselösung (500 mM) vor.
    4. Mischen Sie die Vorkulturlösung (OD600 = 1,0–1,5), die Saccharoselösung (500 mM) und 1x LB medium (Tabelle 1). Der endgültige OD600-Wert der Kulturlösung sollte 0,01–0,015 und die endgültige Saccharosekonzentration 200 mM betragen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, osmotischen Druck zu vermeiden. Es ist notwendig, die Konzentration zwischen der inneren und äußeren wässrigen Lösung auszugleichen.
  5. Herstellung von Wasser-in-Öl (W/O) Tröpfchen, die Bakterienzellen enthalten
    1. Fügen Sie 2 l der inneren wässrigen Lösung von GVs (in Schritt 1.4.4) bis 50 l der lipidhaltigen Öllösung (Mineralöl mit POPC und Biotin-PEG-DSPE) in ein 0,6 ml Deckelkunststoffrohr (Abbildung1b (iv)) ein.
    2. Emulgieren Sie die beiden Komponenten im Kunststoffrohr, indem Sie das Rohr von Hand tippen (Abbildung1b (v)).
  6. Bildung von GVs, die Bakterienzellen enthalten
    1. 50 l der äußeren wässrigen Lösung von GVs (in Schritt 1.4.2) in ein 1,5 ml Deckelkunststoffrohr (Abbildung1b (vi)) geben und 150 l der lipidhaltigen Öllösung (Mineralöl mit POPC und Biotin-PEG-DSPE) auf der Oberfläche des äußeren wässrigen Lösung(Abbildung 1b (vii)). Inkubieren Sie diese Probe bei Raumtemperatur (RT, 25 °C) für 10–15 min. Überprüfen Sie, ob die Schnittstelle zwischen Öl und wässrigen Lösungen flach ist.
    2. Fügen Sie 50 l der W/O-Tröpfchenlösung (in Schritt 1.5.2) an der Schnittstelle des Öls und der wässrigen Lösung mit einer Pipette hinzu (Abbildung1b (viii)).
    3. Zentrifugieren Sie das 1,5 ml-Kunststoffrohr (ab Schritt 1.6.2) für 10 min bei 1.600 x g bei RT in einer Desktop-Zentrifuge (Abbildung1b (ix)). Nach der Zentrifugation das Öl (obere Schicht) aus dem 1,5-ml-Kunststoffrohr mit einer Pipette ansaugen und die GVs mit Bakterienzellen sammeln (Abbildung 1b (x)).

2. Vorbereitung eines GV-Beobachtungssystems (Bakterielles Zellkultursystem)

  1. Herstellung von kleinen Vesikeln (SVs) für konstruktiv ng a unterstützte Bilayer-Membran
    1. Gießen Sie 20 l der POPC-Lösung und 4 l der Biotin-PEG-DSPE-Lösung in ein Glasrohr (unter Verwendung der gleichen Lipidzusammensetzung wie bei der GV-Vorbereitung in Schritt 1.1).
    2. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom zu einem Lipidfilm und legen Sie diese Probe in einem Trockengerät für 1 h, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.
    3. Fügen Sie 200 l 200 mM Glukose in 1x LB Medium (die äußere wässrige Lösung von GVs) in die Glasdurchstechflasche ein.
    4. Den Eröffnungsteil der Glasdurchstechflasche mit Folie umwickeln und in einem Ultraschallbad (120 W) mindestens 1 h beschallen.
    5. Bereiten Sie SVs nach dem Extrusionsverfahren21 mit einem Miniextruder und einer Polycarbonatmembran mit 100 nm Porengröße vor.
  2. Vorbereitung einer handgefertigten Kammer
    1. Bohren Sie ein 7-mm-Loch mit einem Hohlstanz auf einer doppelseitigen Dichtung (10 mm x 10 mm x 1 mm).
    2. Die doppelseitige Dichtung mit dem Loch auf ein Abdeckglas (30 mm x 40 mm, Dicke 0,25–0,35 mm) kleben.
  3. Vorbereitung einer unterstützten Doppelschichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
    1. Fügen Sie 30 l der SV-Lösung in das Loch der Kammer (in Abschnitt 2.2) und inkubieren bei RT für 30 min.
    2. Waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 l 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) durch Pipettieren enthält.
  4. Immobilisierung von GVs auf der unterstützte Zweischichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
    1. 10 l Neutravidin mit der äußeren wässrigen Lösung von GVs (1 mg/ml) in das Loch einführen und bei RT 15 min inkubieren.
    2. Waschen Sie das Loch vorsichtig zweimal mit 20 l 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) durch Pipettieren enthält.
    3. Fügen Sie alle Lösung strotzenden GVs (in Schritt 1.6.3) in das Loch der Kammer und versiegeln Sie mit einem Abdeckglas (18 mm x 18 mm, Dicke 0,13–0,17 mm) (Abbildung 2b).
  5. Mikroskopische Beobachtung des Bakterienzellwachstums in GVs
    1. Stellen Sie ein mikroskopisches Heizbühnensystem mit einem invertierten Mikroskop ein, das mit einer 40x/0,6 numerischen Blende (NA) Objektivlinse mit einem langen Arbeitsabstand ausgestattet ist (Abbildung 2b).
    2. Platzieren Sie die Kammer auf dem mikroskopischen Heizbühnensystem (Abbildung 2b). Inkubieren Sie die GVs, die Bakterienzellen in der Kammer enthalten, in einem statischen Zustand für 6 h bei 37 °C.
    3. Erfassen und aufzeichnen Sie Mikroskopbilder des Bakterienzellwachstums in GVs alle 30 min mit hilfe einer wissenschaftlichen Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkamera (sCMOS).

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Ergebnisse

Wir stellen eine einfache Methode zur Generierung von GVs vor, die einzelne Bakterienzellen mit der Tröpfchenübertragungsmethode enthalten (Abbildung 1). Abbildung 1a zeigt ein schematisches Bild der Ausfällung von GVs, die Bakterien enthalten. W/O-Tröpfchen, die Bakterien enthalten, werden durch Zentrifugation über die Öl-Wasser-Schnittstelle (Lipid-Monolayer) zu GVs übertragen. Der Dichteunterschied zwischen Saccharose (innere ...

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Diskussion

Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb von GVs. Bei dieser einfachen Methode werden GVs gebildet, die Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene enthalten, indem die Tröpfchenübertragungsmethode verwendet wird. Im Vergleich zu anderen Ansätzen zur Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, hat diese Methode zwei Vorteile: (i) es ist leicht zu entwickeln, und (ii) ein kleines Volumen (2 l) der Probenlösung ist erforderlich, um die GVs vorzubereiten. Die T...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einer Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) japans unterstützt, einem Stipendium für junge Wissenschaftlerforschung (Nr. 18K18157, 16K21034) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) bis M.M., und Grant-in-Aid von MEXT bis K.K. (Nr. 17H06417, 17H06413).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BactotryptonBD Biosciences211705
ChloroformWako Pure Chemicals032-21921
Deckglas (18 x 18 mm)Matsunami Glas Ind.C018181Dicke 0,13– 0,17 mm
Deckglas (30 x 40 mm)Matsunami Glas Ind.Dicke nach Kundenwunsch0,25– 0,35 mm
Desktop-ZentrifugeHi-Tech Co.ATT101Ausweichrotor
Typ Doppelseitige Dichtung (10 & x 1 x / 10 x 1 mm)NitomsT4613
GlasfläschchenAS ONE6-306-01Durham Fermentationsröhrchen
GlukoseWako Pure Chemicals049-31165
Inverses MikroskopOlympusIX-73
MethanolWako Pure Chemicals133-16771
Mikroskopisches HeiztischsystemTOKAI HITTP-110R-100
MineralölNacalai Tesque23334-85
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids610000
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
ObjektivOlympusLUCPLFLN 40&fach;/0.6 NA
Polycarbonat-MembranenAvanti Polar Lipide610005Porengröße 100 nm
sCMOS-KameraAndorZyla 4.2 plus
NatriumchloridWako Pure Chemicals191-01665
SaccharoseWako Pure Chemicals196-00015
UltraschallbadAS ONEASU-3D
HefeextraktBD Biosciences212750
0,6 mL Kunststofftube mit DeckelWatson130-806C
1,5 mL Kunststofftube mit DeckelSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocolinAvanti Polare Lipide850457PPOPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamin-N-[biotinyl(Polyethylenglykol)-2000]Avanti Polare Lipide880129PBiotin-PEG-DSPE

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