Wir zeigen die einzellige Kultur von Bakterien in riesigen Vesikeln (GVs). GVs, die Bakterienzellen enthalten, wurden nach der Tröpfchentransfermethode hergestellt und auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat zur direkten Beobachtung des Bakterienwachstums immobilisiert. Dieser Ansatz kann auch an andere Zellen angepasst werden.
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Methodenartikel
Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir haben eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzelliger Ebene in Riesigen Vesikeln (GVs) entwickelt. Bakterielle Zellkultur ist wichtig für das Verständnis der Funktion von Bakterienzellen in der natürlichen Umgebung. Aufgrund des technologischen Fortschritts können verschiedene bakterielle Zellfunktionen auf einzelzeller Ebene auf engstem Raum aufgedeckt werden. GVs sind kugelförmige mikrogroße Kompartimente, die aus amphiphilen Lipidmolekülen bestehen und verschiedene Materialien, einschließlich Zellen, aufnehmen können. In dieser Studie wurde eine einzelne Bakterienzelle durch die Tröpfchenübertragungsmethode in 10–30 m GVs eingekapselt und die GVs, die Bakterienzellen enthielten, auf einer unterstützten Membran auf einem Glassubstrat immobilisiert. Unsere Methode ist nützlich, um das Echtzeitwachstum einzelner Bakterien in GVs zu beobachten. Wir kultivierten Escherichia coli (E. coli) Zellen als Modell innerhalb von GVs, aber diese Methode kann an andere Zelltypen angepasst werden. Unsere Methode kann in den Bereichen Mikrobiologie, Biologie, Biotechnologie und Synthetische Biologie eingesetzt werden.
Einleitung
Die Kultur der Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene hat zunehmend Beachtung gefunden. Die Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb eines begrenzten Raumes kann bakterielle Funktionen wie phänotypische Variabilität1,2,3,4, Zellverhalten5, 6 , 7 , 8 , 9und Antibiotikaresistenz10,11. Aufgrund der jü....
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Protokoll
1. Herstellung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, nach der Tröpfchenübertragungsmethode
- Bereiten Sie Lipid-Lagerlösungen von 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (POPC, 10 mM, 1 ml) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[Biotinyl(Polyethylenglycol)-2000] (Biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 ml) in Chloroform/ Methanollösung (2/1, v/v) und lagern Sie den Lagerbestand bei -20 °C.
- Herstellung einer lipidhaltigen Öllösung
- Gießen Sie 20 l der POPC-Lösung und 4 l der Biotin-PEG-DSPE-Lösung in ein Glasrohr (Abbildung1b i)).
- Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel....
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Ergebnisse
Wir stellen eine einfache Methode zur Generierung von GVs vor, die einzelne Bakterienzellen mit der Tröpfchenübertragungsmethode enthalten (Abbildung 1). Abbildung 1a zeigt ein schematisches Bild der Ausfällung von GVs, die Bakterien enthalten. W/O-Tröpfchen, die Bakterien enthalten, werden durch Zentrifugation über die Öl-Wasser-Schnittstelle (Lipid-Monolayer) zu GVs übertragen. Der Dichteunterschied zwischen Saccharose (innere .......
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine Methode zur Kultivierung von Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene innerhalb von GVs. Bei dieser einfachen Methode werden GVs gebildet, die Bakterienzellen auf einzelzeller Ebene enthalten, indem die Tröpfchenübertragungsmethode verwendet wird. Im Vergleich zu anderen Ansätzen zur Gewinnung von GVs, die Bakterienzellen enthalten, hat diese Methode zwei Vorteile: (i) es ist leicht zu entwickeln, und (ii) ein kleines Volumen (2 l) der Probenlösung ist erforderlich, um die GVs vorzubereiten. Die T.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von einer Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER, No. 16812285) des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) japans unterstützt, einem Stipendium für junge Wissenschaftlerforschung (Nr. 18K18157, 16K21034) von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) bis M.M., und Grant-in-Aid von MEXT bis K.K. (Nr. 17H06417, 17H06413).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bactotrypton | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Deckglas (18 x 18 mm) | Matsunami Glas Ind. | C018181 | Dicke 0,13– 0,17 mm |
| Deckglas (30 x 40 mm) | Matsunami Glas Ind. | Dicke nach Kundenwunsch | 0,25– 0,35 mm |
| Desktop-Zentrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | Ausweichrotor |
| Typ Doppelseitige Dichtung (10 & x 1 x / 10 x 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glasfläschchen | AS ONE | 6-306-01 | Durham Fermentationsröhrchen |
| Glukose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverses Mikroskop | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Mikroskopisches Heiztischsystem | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineralöl | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objektiv | Olympus | LUCPLFLN 40&fach;/0.6 NA | |
| Polycarbonat-Membranen | Avanti Polar Lipide | 610005 | Porengröße 100 nm |
| sCMOS-Kamera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Natriumchlorid | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Saccharose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultraschallbad | AS ONE | ASU-3D | |
| Hefeextrakt | BD Biosciences | 212750 | |
| 0,6 mL Kunststofftube mit Deckel | Watson | 130-806C | |
| 1,5 mL Kunststofftube mit Deckel | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocolin | Avanti Polare Lipide | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamin-N-[biotinyl(Polyethylenglykol)-2000] | Avanti Polare Lipide | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
Referenzen
- Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1....
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Nachdrucke und Genehmigungen
