Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Messung der potenzialimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium basierend auf 14NH4+/15NH4+ Analysen mittels Sequenzielle Umwandlung in N 2O

5.8K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/59562

⸱

7. Oktober 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Reihe von Methoden zur Bestimmung der potentiellen DNRA-Rate auf Basis von 14NH4+/15NH4+ Analysen wird detailliert bereitgestellt. NH4+ wird über mehrere Schritte in N2O umgewandelt und mittels Quadrupol-Gaschromatographie–Massenspektrometrie analysiert.

Zusammenfassung

Die Bedeutung des Verständnisses des Schicksals von Nitrat (NO3),dem dominanten N-Arten, das von terrestrischen auf aquatische Ökosysteme übertragen wird, hat zugenommen, weil die globalen Stickstoffbelastungen nach der Industrialisierung dramatisch zugenommen haben. Die dissimilatorische Nitratreduktion auf Ammonium (DNRA) und Denitrifikation sind beide mikrobiellen Prozesse, die NO3- zur Atmung verwenden. Im Vergleich zur Denitrifikation wurden quantitative Untersuchungen der DNRA-Aktivität nur in begrenztem Umfang durchgeführt. Dies hat zu einem unzureichenden Verständnis der Bedeutung von DNRA in NO3--Transformationen und den regulierenden Faktoren dieses Prozesses geführt. Ziel dieses Papiers ist es, ein detailliertes Verfahren zur Messung des potenziellen DNRA-Wertes in Umweltproben bereitzustellen. Kurz gesagt, kann die potentielle DNRA-Rate aus der 15N-markierten Ammonium (15NH4+) Akkumulationsrate in 15NO3berechnet werden. Die Bestimmung der in diesem Papier beschriebenen Konzentrationen 14NH4+ und 15NH4+ besteht aus den folgenden Schritten. Zunächst wird das NH4+ in der Probe extrahiert und auf einem gesäuerten Glasfilter als Ammoniumsalz eingeschlossen. Zweitens wird das eingeschlossene Ammonium eluiert und über Persulfatoxidation zu NO3- oxidiert. Drittens wird das NO3- über einen N 2 O-Reduktase-Mangel denitrifier in N2O umgewandelt.2 Schließlich wird das umgebaute N2O mit einem zuvor entwickelten Quadrupol-Gaschromatographie-Massenspektrometriesystem analysiert. Wir wandten diese Methode auf Salzsumpfsedimente an und berechneten deren potenzielle DNRA-Raten, was zeigt, dass die vorgeschlagenen Verfahren eine einfache und schnellere Bestimmung im Vergleich zu zuvor beschriebenen Methoden ermöglichen.

Einleitung

Die künstliche Synthese von Stickstoffdünger und seine weit verbreitete Anwendung haben den globalen Stickstoffkreislauf stark gestört. Es wird geschätzt, dass sich der Transfer von reaktivem Stickstoff von terrestrischen zu Küstensystemen seit den vorindustriellen Zeiten1verdoppelt hat. Ein erheblicher Teil der Düngemittel, die auf ein bestimmtes Feld aufgebracht werden, wird vom Boden zu Flüssen oder Grundwasser abgewaschen, in erster Linie als NO3x 2. Dies kann zu Umweltproblemen wie Trinkwasserverschmutzung, Eutrophierung und Hypoxiebildung führen. NO3- in Wasserumgebungen wird durch biologische Assimilation und verschiedene mikrobielle dissimilatorische Prozesse aus dem Ökosystem entfernt oder zurückgehalten. Denitrifikation und Anammox sind bekannt, dass wichtige mikrobielle Entfernungsprozesse für NO3. Die Denitrifikation ist die mikrobielle Reduktion von NO3auf gasförmige N-Produkte (NO,N2O undN2) in Verbindung mit der Oxidation eines Elektronenspenders, wie organischesubstanzen, wodurch das Risiko der oben genannten Probleme verringert wird. Anammox produziert auch N2 aus NO2und NH4+; daher entfernt es anorganisches N aus einem Ökosystem. Umgekehrt arbeitet die DNRA daran, N in einem Ökosystem zu erhalten; es ist allgemein anerkannt, dass DNRA hauptsächlich durch fermentative Bakterien oder chemolithoautotrophe Bakterien durchgeführt wird und dass sie dissimilatorische NO3- auf bioverfügbar und weniger mobile NH4+reduzieren und reduzieren.

Studien über DNRA wurden hauptsächlich in marinen oder mündungsischen Ökosystemen wie ozeanischen oder mündungsigen Sedimenten und Wasser, Salz- oder Brackwiesenböden und Mangrovenböden durchgeführt. Küsten- oder Meeresökosysteme sind wichtig als Reservoirs für die Entfernung von NO3aus terrestrischen Ökosystemen, und in früheren Studien hat sich gezeigt, dass DNRA über einen sehr breiten Bereich von NO3beitragen -Entfernung (0–99%)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Darüber hinaus wurde die Existenz von DNRA in einer Vielzahl von Umgebungen nachgewiesen, einschließlich Süßwasserumgebungen19,ReisrohreBöden 20und Waldböden21. Während diese Studien gezeigt haben, dass DNRA potenziell mit der Denitrifikation für NO3--Entfernung vergleichbar ist, sind Studien zur Messung der DNRA-Aktivität im Vergleich zu denen, die die Denitrifikation messen, immer noch sehr begrenzt.

Die DNRA-Rate wurde mit 15N-Labeling-Techniken in Verbindung mit der Datenanalyse mittels analytischer oder numerischer Modelle ausgewertet. Eine analytische Lösung zur Berechnung der DNRA-Rate basiert auf der Erhöhung der 15N-Anreicherung des NH4+ Pools nach dem Hinzufügen von 15NO3- als Tracer. 15 N-labeled NO3- wird einer Probe hinzugefügt und inkubiert, und die DNRA-Rate kann dann aus den Konzentrations- und Isotopenverhältnisänderungen in NH4+ vor und nach einem bestimmten Zeitraum berechnet werden. In diesem Papier wird eine Methode zur Quantifizierung der NH4+ Konzentration und des Isotopenverhältnisses, die zur Berechnung der DNRA-Rate erforderlich sind, ausführlich beschrieben. Grundsätzlich ist die hier beschriebene Methode eine Kombination aus mehreren zuvor gemeldeten Techniken22,23,24,25,26 mit Änderungen, die einigen Prozeduren hinzugefügt wurden. Das Verfahren besteht aus einer Reihe von fünf Komponentenverfahren: (1) Inkubation einer Umweltprobe mit der Änderung eines stabilen Isotopentracers, 15NO3,(2) Extraktion und Rückgewinnung von NH4+ unter Verwendung eines "Diffusionsverfahrens" mit Modifikationen, (3) Persulfatoxidation von NH4+ in der Probe, bestehend aus einheimischen NH4+ und 15NH4+ abgeleitet von 15NO3- über DNRA-Aktivität, in NO3und 15NO3,(4) nachfolgende mikrobielle Transformation von NO3und 15NO3- zuN2O Isotopomern über die modifizierte Denitrifiermethode und (5) Quantifizierung der N2O Isotopomere mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC/MS). Im folgenden Abschnitt wird zunächst die Vorbereitung der Verfahren (2) und (4) beschrieben und anschließend alle fünf Komponentenverfahren ausführlich beschrieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Erstellung eines PTFE-Umschlags zur quantitativen Erfassung gasförmiger NH3

  1. Legen Sie ein 60-mm-Stück Polytetrafluorethylen (PTFE) (25 mm Breite) auf eine kleine Folie aus Aluminiumfolie (ca. 300 mm x 450 mm groß, mit Ethanol abgewischt).
  2. Asche ein Glasfaserfilter (10 mm Durchmesser mit einer Porengröße von 2,7 m) bei 450 °C für 4 h in einem Muffelofen. Legen Sie den Glasfaserfilter etwas über dem Mittelpunkt der längeren Achse des Bandes (Abbildung 1a).
  3. Spot 20 'L von 0.9-mol/L H2SO4 auf der Mitte eines GF/D-Filters, und falten Sie sofort das PTFE-Band mit zwei Pinzetten: flach-ended Stempel Pinzette und gerade-Ended Pinzette. Die folgenden Schritte, die Schritte 1.4–1.7, sind in Abbildung 1 dargestellt und sollten schnell ausgeführt werden.
  4. Drehen Sie das PTFE-Band über den GF/D-Filter an der gepunkteten Linie in Abbildung 1a, um die in Abbildung 1bdargestellte Form zu bilden.
  5. Beide Seiten durch Falten versiegeln und dann mit der Pinzette fest an der Kante drücken (Abbildung 1c). Drücken Sie nicht zu hart, und kratzen Sie nicht das PTFE-Band.
  6. Falten Sie das offene Ende mit der Pinzette, und drücken Sie dann die Kante mit der Pinzette (Abbildung 1d).
  7. Versiegeln Sie das offene Ende, indem Sie die Kante mit der Pinzette fest drücken (Abbildung 1e). Der GF/D-Filter sollte während dieses Vorgangs nicht gedrückt werden.

2. Vorbereitung der Biomasse eines Lachgas-Reduktase-Mangels, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, für die Denitrifier-Methode

  1. Streichen Sie einen 20% Glycerin-Bestand von Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 auf 1/4 Stärke Tryptone Sojabrühe (TSB) Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten bei 25 °C für 2-3 Tage.
  2. Eine Einzelkolonie von P. chlororaphis in ein kleines Reagenzglas mit 5 ml autoklaviertem TSB-Medium und Kultur aerob (ohne Schütteln) für einen Tag bei 25 °C bei Dunkelheit übertragen, bis maximales Wachstum erreicht wird; dies wird als Vorkultur verwendet werden.
  3. 3 ml der Präkultur in eine 1-L-Flasche mit einem Siliziumkautschukstopfen mit 1 L frisch zubereiteten autoklavierten modifizierten TSB, ergänzt mit 10 mmol/L KNO323. Inkubieren Sie die Flasche beim Rühren mit einem Rührwerk unter dunklen Bedingungen bei 25 °C. Nach dem Kultivieren für 8 h, ersetzen Sie den Silizium-Gummistopfen mit einem Schraubverschluss und dicht schließen. Setzen Sie den Anbau in Anoxia über Nacht fort.
  4. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 18.800 x g für 15 min bei 4 °C, um Biomassepellets zu erhalten.
  5. Waschen Sie die verpackte Biomasse dreimal mit 30 ml Phosphat-gepufferter Saline (D-PBS(-), pH 7.5), um das NO3vollständig zueliminieren. Die Bedingungen der Zentrifugation sind die gleichen wie in Schritt 2.3.
  6. Nach dem Waschen die verpackte Biomasse mit 30 ml D-PBS(-) wieder aufhängen. Verwenden Sie 1 ml der Suspension, um die Zelldichte durch Messung von OD600zu bestimmen. Pipette 1 ml Aliquots der verbleibenden Suspension in sterile Kryovitale mit 0,8 ml 45% Glycerin. Bewahren Sie die zubereiteten Glyzerinbestände bis zur Verwendung bei 80 °C auf (siehe Abschnitt 6).

3. Eliminierung von Sauerstoff, Nitrit und Nitrat aus dem Probensediment

  1. 3,0 g Sediment in eine 20 ml Glasdurchstechflasche wiegen und 9,0 ml Oberflächenwasser hinzufügen, um es aufzuhängen (25% w/w Gülle).
  2. Versiegeln Sie die Durchstechflasche mit einem schwarzen Butylkautschukstopfen (mit Ionen ausgetauschtem Wasser gewaschen und über Autoklavieren sterilisiert) und einer Aluminiumkappe.
  3. Bereinigen Sie die Aufhängung und ersetzen Sie die Kopfraumluft durch Ar (>99.99%) bei 0,6 L/min für 20 min mit einem Verteiler.
  4. Ersetzen Sie das Ar-Kopfraumgas durch ultra-reines (>99.99995%) Er durch Staubsaugen für 90 s und Aufladen Er für 30 s. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal. Stellen Sie den Kopfraum-Gasdruck auf 1,5 atm ein.
  5. Inkubieren Sie die Durchstechflaschen bei 20 °C über Nacht mit Schütteln bei 150 U/min unter dunklen Bedingungen, indem Sie einen konstanten Temperaturstreuer verwenden, um den verbleibenden Sauerstoff, Nitrat und Nitrit in der Sedimentsuspension und dem Kopfraumgas zu eliminieren.

4. Zeitkursexperiment zur Bestimmung der DNRA-Rate

  1. Ersetzen Sie das Headspace-Gas mit frischem ultra-reinen Er mit dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.5, aber ohne die vier Wiederholungen.
  2. Jede Durchstechflasche gemäß Tabelle 1 durch den Butylkautschukstopfen mit einer gasdichten Spritze mit beschrifteten und nicht beschrifteten Substraten hinzufügen. Reinigen Sie die zuvor vorbereiteten Substratlösungen in ausreichend großen Glasfläschchen mit ultra-reinem He mit dem Druck des Kopfraums auf 1,5 atm, um Luftverschmutzung zu vermeiden. Vermeiden Sie die unbeabsichtigte Injektion von Luftmenge während der Injektionsverfahren.
  3. Inkubieren Sie Fläschchen bei 20 °C mit Schütteln bei 150 Rpm. Fügen Sie die Substrate zu jeder Durchstechflasche nach Tabelle 1 hinzu und brüten sie für 1 h, 3 h und 5 h. Nachdem die Inkubation angehalten wurde, unterziehen Sie die Sedimentsuspension in den Durchstechflaschen den folgenden Verfahren: Schritte 4.4–4.9.
  4. Entfernen Sie die Aluminiumkappe und den Butylkautschukstopfen aus jeder Durchstechflasche. Fügen Sie dann KCl (bei 450 °C für 4 h) in die Sedimentsuspension bis zu einer Endkonzentration von ca. 2 mol/L ein, um die Rückgewinnung von NH4+ aus dem Sediment zu gewährleisten. Schließen Sie die Fläschchen mit einem Butylgummistopfen und einem Aluminiumverschluss.
  5. Schütteln Sie das Sediment bei 150 U/min für 1 h bei 4 °C unter dunklen Bedingungen, um das NH4+zu extrahieren.
  6. Die gesamte Sedimentsuspension in der Durchstechflasche in ein 50 ml Kunststoffzentrifugenrohr und Zentrifuge bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C übertragen.
  7. Spülen Sie die Innenwand einer frisch geöffneten 10-ml-Einwegspritze aus und befestigen Sie sie an einem frisch geöffneten Einweg-Celluloseacetatmembranfilter (Porengröße 0,22 mm, 25 mm Durchmesser). Dann spülen Sie den Membranfilter mit 1 ml Überstand ab. Legen Sie die spülte Spritze-Filtereinheit auf eine 20-ml-Breitmaul-Polypropylenflasche (PP).
  8. Filtern Sie den restlichen Überstand durch einen Acetatmembranfilter in die 20-ml PP-Flasche. Bewahren Sie die Extrakte bis zur weiteren Analyse bei 20 °C auf.

− 5. Erfassung diffuser NH4+ in 2M H2SO4 absorbiert in den GF/D-Filter in der PTFE-Hüllkurve und die Persulfatoxidation von NH4+ bis NO3

  1. Bereiten Sie Standardlösungen von 14NH4Cl mit Konzentrationsgradienten von 0 mol/L, 10 mol/L, 40 mol/L, 100 mol/L, 200 mol/L, 400 mol/L und 500 mol/L vor. Für die 15N-Verhältnis-Analyse fixieren Sie die Gesamtkonzentration von NH4+ bis 200 mol/L und bereiten Isotopverhältnisse von 100:0, 99,5:0,5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 und 10:90 mit reinen 14NH4Cl und 15NH4Cl Standardlösungen vor.
  2. 30 mg MgO (bei 450 °C für 4 h) in eine 20-ml-Glasdurchstechflasche geben und die PTFE-Umhüllung in die Durchstechflasche legen.
  3. 5 ml einer Probe oder eines Standards in die Durchstechflasche mit dem MgO und dem PTFE-Umschlag geben und sofort mit einem grauen Butylkautschukstopfen schließen. Dichtung mit Einer Aluminiumkappe. Wenn die Konzentration von NH4+ voraussichtlich 500 mol/L überschreitet, verdünnen Sie die Probe auf unter 500 mol/L.
  4. Die Durchstechflaschen bei 150 U/min bei 3 h bei 4 °C unter dunklen Bedingungen schütteln.
  5. Entfernen Sie die Aluminiumkappe und den Butylgummistopfen. Nehmen Sie den PTFE-Umschlag mit einer punktgebundenen Pinzette aus der Durchstechflasche, spülen Sie den Umschlag und die Pinzette mit Ionen umwobenem Wasser gründlich ab, wischen Sie sie mit einem Wischpapier ab und legen Sie den Umschlag dann auf ein frisches Wischpapier.
  6. Öffnen Sie den PTFE-Umschlag mit ein paar Pinzetten (die Verwendung sowohl der flachen als auch der punktgebundenen Pinzette wird empfohlen) in der exakten umgekehrten Reihenfolge der Faltung in den Schritten 1.4–1.7.
  7. Halten Sie den Randbereich des GF/D-Filters, bei dem derH2SO4 ohne Absorbiert sein soll, mit der flachen Pinzette und übertragen Sie ihn in ein 11-ml-Schraubverschluss-Prüfrohr mit einer PTFE-gefütterten Kappe. Spülen Sie die Pinzette mit Ionen-ausgetauschtem Wasser und wischen Sie sie mit Wischpapier ab.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 5.5–5.7 für die verbleibenden Umschläge.
  9. Fügen Sie 1 ml Ionen-getauschtes Wasser in jedes der Reagenzgläser, schließen Sie den Schraubverschluss und halten Sie ihn ohne Schütteln für mindestens 30 min bei Raumtemperatur, um das NH4+ vollständig aus dem GF/D-Filter zu entfernen. Führen Sie in diesem Schritt den folgenden Schritt (Schritt 5.10) parallel aus.
  10. Bereiten Sie das Persulfat-Oxidierende Lösung (POR) Reagenz25,26vor.
    1. Da es nicht gelagert werden kann, bereiten Sie die genaue Menge an POR vor, die für die Behandlung eines einzigen Probentages benötigt wird.
    2. Zur Vorbereitung von POR zur Behandlung von 50 Proben 100 ml Ionen-getauschtes Wasser in eine 200-ml-Schraubverschlussflasche gießen und 1,52 g NaOH (Stickstoff-Compound-Analysegrad), 3 g Borsäure und 5 g K2S2O8 (Stickstoff- und Phosphoranalysegrad) in dieser Reihenfolge hinzufügen. Unmittelbar nach zugabe jedes Reagenz die Lösung schütteln, bis sie vollständig gelöst ist.
    3. Falls erforderlich, tränken Sie die Flasche in warmem Wasser, um die Auflösung der Chemikalien zu helfen; jedoch sollte im Hinblick auf die Kontamination von NO3darauf geachtet werden, da Leitungswasser normalerweise NO3enthält.
  11. Nach Schritt 5.8 die Schraubkappe öffnen, 2 ml des POR-Reagenzes in das Reagenz geben und das Rohr mit einem Schraubverschluss fest schließen, um Verluste oder Verunreinigungen in den folgenden Schritten zu vermeiden.
  12. Die Reagenzgläser auf einem Rack aufstellen, in doppellagige Aluminiumfolie wickeln und 1 h bei 121 °C autoklavieren. Halten Sie die Rohre während dieses Schritts in aufrechter Position und vermeiden Sie schnelle Temperaturänderungen nach Abschluss des Autoklavierens.

6. Bestimmung des NO3- konvertiert von NH4+ durch die Denitrifier-Methode mit Quadrupol GC/MS

  1. Mischen Sie 100 ml sterilen 40-mmol/L Phosphatpuffer (pH 7,2) und 100 ml sterile 30-mlmol/L-Glukose aseptisch (20-mmol/L Phosphat und 15-mmol/L Glukose; endend).
  2. Fügen Sie ein 1/7,2 Volumen des Glycerinbestands von P. Chlororaphis zu 200 ml der phosphatgepufferten Glukoselösung in einen 300-ml-Erlenmeyerkolben und spülen Sie mit einem ultrareinen He (>99.995%) Stream für 1 h.
  3. 2,0 ml der Denitrifiersuspension in jede 5-ml-Durchstechflasche geben. Kappen Sie die Fläschchen mit einem grauen Butylgummistopfen und einem Aluminiumverschluss.
  4. Ersetzen Sie die Kopfraumluft durch ultra-reine Er, indem Sie für 3 min saugen und das He für 1 min aufladen. Stellen Sie den Kopfraumgas-Positivdruck auf 1,3 atm ein, um eine unbeabsichtigte Luftverschmutzung zu vermeiden.
  5. Injizieren Sie 1 ml einer Probe oder eines Standards durch den Butylkautschukstopfen mit einer 1-ml Einwegspritze. Beachten Sie die genaue Menge der tatsächlich injizierten Probe.
  6. Die Durchstechflaschen über Nacht bei 25 °C unter dunklen Bedingungen inkubieren.
  7. Injizieren Sie 0,3 ml 6-mol/LL NaOH, um die Denitrifikation zu stoppen und den KopfraumCO2zu absorbieren, der ansonsten dieN2O-Analyse von GC/MS ernsthaft stören wird, daCO2 undN2O das gleiche Molekulargewicht haben.
  8. Bestimmen Sie die Mengen von 44N2O, 45N2O und 46N2O im Headspace-Gas mit Quadrupol GC/MS mit einem modifizierten Injektionsanschluss25. Die für die GC/MS-Analyse verwendeten Betriebsbedingungen sind in Tabelle 2dargestellt.

7. Datenanalyse

  1. Ableiten Sie die Kalibrierkurve für die NH4+ Konzentration aus der linearen Beziehung zwischen der bekannten Konzentration von 14NH4+ und den gemessenen Signalintensitäten der insgesamt erzeugten 44N2O + 45N2O + 46N2O. Ableiten Sie die Kalibrierkurve für den 15N-Gehalt aus der linearen Beziehung zwischen dem bekannten Atom%(d.h.. 15N/14N+15N) und dem berechneten Atom% unter Verwendung einer zuvor bereitgestellten Gleichung27. Berechnen Sie die Konzentration von 15NH4+ durch Multiplikation der Gesamt-NH4+ mit dem 15N Verhältnis von NH4+.
  2. Berechnen Sie die potenzielle DNRA-Rate mit Gleichungen, die an anderer Stelle bereitgestellt werden28,29,30.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Papier vorgestellt werden, stammen aus 15N-Tracing-Experimenten von Salzsumpfsedimenten. Der salzbeprobte Salzmarsch wurde nach dem Großen Erdbeben in Ostjapan 2011 im Moune-Gebiet der Stadt Kesen-numa in der Präfektur Miyagi in Japan neu geschaffen. Im September 2017 wurden an zwei Stellen in den Untergezeiten- und Gezeitenzonen Oberflächensedimente (0–3 cm) gesammelt. Zuerst wurde das Sediment unmittelbar nach der Sammlung durch e...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Konzentration und das Isotopenverhältnis von NH4+ für die DNRA-Analyse wurden mit mehreren Methoden quantifiziert. Die Konzentrationen und Isotopenverhältnisse von NH4+ werden in der Regel getrennt gemessen. Die NH4+ Konzentration wird in der Regel mit kolorimetrischen Methoden einschließlich eines Autoanalyzers4,10,15,16

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Naoto Tanaka für die Unterstützung bei der Datenerfassung und der Entwicklung des Protokolls. Die Sammlung von Samples wurde von JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286 unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
20 mL PP-FlascheSANPLATEC61-3210-18Weithals-Aluminiumkappe
Maruemu1307-13Nr. 20, mit Loch
BorsäureWako021-02195
ZentrifugeHITACHIHimac CR21G II
sauerstoffarmes Gas Druck & Ersetzen Sie den InjektorSANSIN INDUSTRIALIP-12
Einweg-Membranfilter aus CelluloseacetatADVANTEC25CS020ASPorengröße 0,22 µ m, Einmalspritze mit einem Durchmesser von 25 mm
TermoSS-10SZ10 mL
EinmalspritzeTermoSS-01T1 mL
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Gasdichte SpritzeVICI Valco Instruments4075-15010Serie A-2, 100 µ L
GC/MS shimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-01010 mm Durchmesser
GlasfläschchenMaruemu0501-0620 mL
ButylkautschukstopfenMaruemu1306-03Nr. 20-S
H2SO4Wako192-04696Garantiertes Reagenz
K2S2O8Wako169-11891Stickstoff- und Phosphoranalytik
KClWako163-03545Garantiertes Reagenz
KNO3Wako160-04035Garantiertes Reagenz
NaOHWako191-08625Stickstoffverbindungen Analysegrad
NH4ClWako017-02995Garantiertes Reagenz
Kunststoff-ZentrifugenröhrchenASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Gefriergetrocknet, der Typstamm von Pseudomonas aureofaciens
PTFE-DichtbandSigma-AldrichZ22188025 mm Breite
KolbenschüttlerTAITEC0000207-000NR-10
Reagenzglas mit SchraubverschlussIWAKI84-025211 mL
PTFE-ausgekleidete Kappe für ReagenzglasIWAKI84-0262
Tryptische SojabrüheDifco Laboratories211825
Grauer

Referenzen

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419(2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338(2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830(2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460(2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164(2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Messung der DNRA-RateAmmoniumakkumulationPersulfatoxidationN2O-UmwandlungQuadrupol-GC/MSSalzwiesen-SedimenteIsotopenverfolgungUmweltproben
Messung der potenzialimilatorischen Nitratreduktion zu Ammonium basierend auf 14NH4+/15NH4+ Analysen mittels Sequenzielle Umwandlung in N 2O
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.