Ein Protokoll zur Erstellung genmodifizierter menschlicher Pseudoislets aus dispergierten menschlichen Inselzellen, die durch Lentivirus mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) transduziert werden, wird vorgestellt. Dieses Protokoll verwendet leicht verfügbare Enzym- und Kulturgefäße, kann leicht durchgeführt werden und produziert genetisch veränderte menschliche Pseudoislets, die für funktionelle und morphologische Studien geeignet sind.
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Methodenartikel
Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Verschiedene genetische Werkzeuge stehen zur Verfügung, um Gene in Pankreasinseln von Nagetieren zu modulieren, um die Funktion von Inselgenen für die Diabetesforschung zu sezieren. Die von Nagetierinseln gewonnenen Daten werden jedoch aufgrund bekannter Unterschiede in der Inselstruktur und -funktion zwischen den Arten oft nicht vollständig auf menschlichen Inseln reproduziert oder sind auf sie anwendbar. Derzeit sind Techniken, die zur Verfügung stehen, um die Genexpression menschlicher Inseln zu manipulieren, sehr begrenzt. Die Einführung von Transgen entumlässt durch Adenovirus, Plasmid und Oligonukleotide in intakte Inseln und leidet häufig unter geringer Effizienz und hoher Toxizität. Eine geringe Effizienz ist besonders problematisch in Gendownregulationsstudien an intakten Inselchen, die eine hohe Effizienz erfordern. Es ist bekannt, dass enzymatisch dispergierte Inselzellen sich in kulturbildenden Sphäroiden, die als Pseudoislets bezeichnet werden, neu anaggregieren. Die größengesteuerte Reaggregation menschlicher Inselzellen erzeugt Pseudoislets, die die dynamische Insulinsekretion der ersten Phase nach längerer Kultur aufrechterhalten und ein Fenster zur effizienten Einführung von lentiviraler Kurzhaarnadel-RNA (shRNA) mit geringer Toxizität bieten. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung menschlicher Pseudoislets nach lentiviraler Transduktion mit zwei handelsüblichen Mehrwellplatten beschrieben. Das Protokoll kann leicht durchgeführt werden und ermöglicht eine effiziente Downregulation von Genen und die Beurteilung der Dynamik der Insulinsekretion mit menschlichen Ischenzellen. So bieten menschliche Pseudoislets mit lentiviral vermittelter Genmodulation ein leistungsfähiges und vielseitiges Modell zur Beurteilung der Genfunktion in menschlichen Inselzellen.
Einleitung
Der Verlust der funktionellen Beta-Zellmasse ist die zentrale Pathologie für Typ-1- und Typ-2-Diabetes1. Während Betazellen die Produzenten von Insulin in Pankreasinseln sind, spielt die Kommunikation zwischen Betazellen und Nicht-Beta-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Insulinsekretion2. Darüber hinaus trägt die Dysregulation der Glucagon-Sekretion zu Hyperglykämie bei Diabetes3bei. Daher besteht ein starkes Interesse daran, die Genexpression von Zellen innerhalb der Pankreasinseln zu modulieren, um den Mechanismus hinter der Entwicklung von Inselfunktionsstörungen bei Diabet....
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Protokoll
Vor Studienbeginn wurde eine Forschungsbestimmung für Humansubjekte durch das Institutional Review Board der University of Iowa getroffen, der feststellte, dass die Studie die Kriterien für die Forschung an menschlichen Probanden nicht erfüllte. Konsultieren Sie vor Beginn der Studie das örtliche Prüfungsgremium, um festzustellen, ob die Quelle der Inselchen und die geplante Studie einer vorherigen Genehmigung bedarf.
HINWEIS: Für die Bildung von 192 Pseudoislets in der Größe von 3.000 Zellen/Pseudoislets in einer 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte oder 1.200 Pseudoislets in der Größe von 500 Zellen/Pseudoislets in einem M....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte bei der Herstellung von Pseudoislets mit einer 96-well ultra-niedrigen Befestigungsplatte und einer Mikrowell-Kulturplatte. Abbildung 2a zeigt sequenzielle Veränderungen in der Morphologie bei der Bildung von Pseudoislets aus 3 x 103 menschlichen Inselzellen in einer 96-well ultraniedrigen Befestigungsplatte. Monolayer oder lose Zellklumpen, die am tag 1 beobachtet wurden, ver.......
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Diskussion
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung menschlicher Pseudoislets vorgestellt, die mit einer 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte oder einer Mikrowell-Kulturplatte durch Lentivirus transduziert werden. Pseudoislets sollen Morphologie und sekretotische Funktionen ähnlich wie einheimische menschliche Inselchen demonstrieren und können über einen längeren Zeitraum in vitrokultiviertwerden 5,11,18. Im Gegensatz zu einheim.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health to Y.I. (R01-DK090490) und der American Diabetes Association to Y.I. (1-17-IBS-132) finanziell unterstützt. J.A. und Y.I. werden vom Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center unterstützt. A.B. wird durch ein Stipendium der National Institutes of Health (T32NS45549) unterstützt. Die Autoren nutzten menschliche Pankreasinseln, die vom NIDDK-finanzierten Integrated Islet Distribution Program (IIDP) in City of Hope (2UC4DK098085) bereitgestellt wurden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-Adhärenz-Spüllösung | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biologische Sicherheitswerkbank | Thermo Scientific | Serie 1300 Typ A2 | |
| Zellsieb, 40 Mikrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 Inkubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Konisches Zentrifugenröhrchen, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Konisches Zentrifugenröhrchen, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fötales Rinderserum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidiniumthiocyanat-RNA-Extraktionsreagenz | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamin | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hämozytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright Line | |
| Humanes Serumalbumin | Sigma | A1653 | |
| Inverses Mikroskop | Marke Fisher Marke | 11-350-119 | |
| Mikrozentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Mikrotiterplatte | Stammzellentechnologien | 34411 | Aggrewell 400, 24 Well |
| Motorbetriebener Stößel | GAMUT | ||
| Nicht mit Gewebekulturen behandelte Schale, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petrischale, 35 mm | Celltreat | ||
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8 Kanal | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytisches und kollagenolytisches Enzymgemisch | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagenzreservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversibles Sieb, 37 Mikrometer | Stammzellentechnologien | 27251 | |
| Schwenkbecherplattenzentrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Ausschwingrotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberkulinspritze, 1 mL | BD | 309659 | |
| Mikrotiterplatte mit extrem niedrigem Aufsatz, 96 Well | Corning | 4515 |
Referenzen
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
