Summary
Biz poxvirus enfekte hücreler içinde vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay kullanarak mRNA çeviri Yönetmeliği çalışmak için bir protokol sunuyoruz. Tahlil, 5 '-untranslated bölgesi (UTR) ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri Yönetmeliği eğitim için kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak farklı çeviri başlatma modları da incelenebilir.
Abstract
Viral DNA replikasyonu sonrasında yapılan her poksvirüs mRNA, 5 '-UTR ' a evrimsel olarak koruma altına alınan, templated olmayan 5 '-Poly (A) lideridir. Poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA tercüme 5 '-Poly (A) lideri rolünü incelemek için biz bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil geliştirdi. Bu muhabir tahlil dört temel adımlardan oluşur: (1) PCR in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu yükseltmek için; (2) T7 RNA polimeraz kullanarak mRNA oluşturmak için in vitro transkripsiyon; (3) hücrelerde in vitro transkripsiyonu mRNA 'yı tanıtmak için transfeksiyon; (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti. RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil burada açıklanan poxvirus enfekte hücreler ve plazmid gelen şifreli transkripsiyon plazmid çoğaltma sorunları circumvents. Bu protokol, poxvirus enfekte hücreler dışındaki sistemlerde 5 '-UTR ve 3 '-UTR dahil olmak üzere bir mRNA BDTelemanları tarafından çeviri düzenleme belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem kullanılarak Cap-bağımlı, Cap-bağımsız, yeniden başlatma ve iç başlatma gibi farklı çeviri başlatma modları incelenebilir.
Introduction
Orta dogma 'ya göre, genetik bilgiler DNA 'dan RNA 'ya ve sonunda protein1,2' ye akar. Genetik bilgi bu akışı yüksek mRNA çeviri3,4dahil olmak üzere birçok düzeyde düzenlenir. Bu süreçte yer alan düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, Gen ifadesinin düzenlenmesini ölçmek için gazetecinin geliştirilmesi konusunda yardımcı olmaktadır. Burada poxvirus enfekte hücrelerde bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil kullanarak mRNA çeviri çalışması için bir protokol açıklanmaktadır.
Poxvirüsler birçok son derece tehlikeli insan ve hayvan patojenleri5oluşturur. Diğer tüm virüsler gibi, poxvirüsler sadece protein sentezi6,7,8için ana hücre makineleri güveniyor. Verimli viral proteinleri sentezlemek için, virüsler viral mrnas7,8çevirisi için yönlendirmek için hücresel translasyonel makine kaçırmak için birçok stratejiler gelişti. Virüsler tarafından yaygın olarak kullanılan bir mekanizma, kendi transkriptlerinde BDTetkili unsurları kullanmaktır. Önemli örnekler iç ribosome giriş sitesi (IRES) ve Cap-bağımsız çeviri artırıcı (CITE)9,10,11içerir. Bu BDTelemanları, çeşitli mekanizmalar aracılığıyla translasyonel makineleri alarak viral transkriptler bir translasyonel avantajı render12,13,14. 100 Over poksvirüs mrnas 'ın 5 '-untranslated bölgesi (5 '-UTR) içinde evrimsel olarak koruma altında olan bir eleman var: Bu mrnas15,16' nın çok 5 ' ucunda 5 '-Poly (a) lideri. Bu 5 ' Poly (A) liderlerin uzunlukları heterojen ve Transkripsiyon sırasında poxvirus kodlu RNA polimeraz kayma tarafından üretilir17,18. Biz, ve diğerleri, son zamanlarda keşfetti 5 '-Poly (A) lideri Vaccinia virüs ile enfekte hücrelerde bir mRNA bir çeviri avantajı confers (vacv), poxvirüsler Prototipik üyesi19,20.
İn vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz Reporter assay başlangıçta poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA çeviri 5 '-Poly (A) lideri rolünü anlamak için geliştirilmiştir19,21. Plazmid DNA tabanlı Lusiferaz muhabiri olarak yaygın olarak kullanılan olsa da, poxvirus enfekte hücrelerde sonuç yorumu zorlaştıracak çeşitli dezavantajları vardır. İlk olarak, plazmids VACV enfekte hücrelerde çoğaltmak edebiliyoruz22. İkinci olarak, kriptik transkripsiyon genellikle Plasmid DNA18,23,24oluşur. Üçüncü olarak, VACV Promoter güdümlü transkripsiyon Poly (A) oluşturur-heterojen uzunlukları lideri sonuç olarak Poly (A)-bazı deneyler18lider uzunluğu kontrol etmek zor hale. Bir in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil bu sorunları circumvents ve veri yorumu basittir.
Bu yöntemde dört önemli adım vardır: (1) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) in vitro transkripsiyon için DNA şablonunu oluşturmak için; (2) içinde vitro transkripsiyon mRNA oluşturmak için; (3) mRNA 'yı hücrelere teslim etmek için transfeksiyon; ve (4) tercüme göstergesi olarak Lusiferaz aktivitesinin tespiti (Şekil 1). Elde edilen PCR amplikon, 5 '-3 ' yönünde aşağıdaki unsurları içerir: T7-Promoter, Poly (a) lideri veya istenen 5 '-UTR dizisi, Firefly Lusiferaz açık okuma çerçevesi (ORF) ve ardından Poly (a) kuyruk. PCR amplikon, T7 polimeraz kullanarak mRNA 'yı in vitro transkripsiyon ile sentezlemek için şablon olarak kullanılır. İn vitro Transkripsiyon sırasında, m7G CAP veya diğer kapak analog yeni sentezlenmiş mRNA eklenmiştir. Capped transkriptler enfekte olmayan veya vacv enfekte hücrelere transfekte vardır. Hücre lysate transfeksiyon mRNA protein üretimini gösteren Lusiferaz faaliyetleri ölçmek için nakli sonra istenilen zamanda toplanır. Bu muhabir assay 5 '-UTR, 3 '-UTR veya bir mRNA diğer bölgelerinde BDTelemanı mevcut tarafından çeviri Yönetmeliği çalışmak için kullanılabilir. Ayrıca, in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı tahlil Cap-bağımlı başlatma, Cap-bağımsız başlatma, yeniden başlatma ve InAs gibi iç inisiyasyon dahil olmak üzere çeviri başlatma farklı mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro transkripsiyon için PCR tarafından DNA şablonunun hazırlanması
- DNA şablonunu PCR tarafından hazırlamak için, tasarım astar. Astarları tasarlarken, astar uzunluğu, tavlama sıcaklığı (Tm), GC Içeriği, G veya C ile 3 ' End vb. gibi önemli özellikleri dikkate alın.
Not: Bu literatürde ayrıntılı olarak25,26,27. - 5 '-3 ' yönünde aşağıdaki unsurları içeren PCR amplikon oluşturmak için tasarım astar: T7-Promoter, Poly (a) lideri, Firefly Lusiferaz ORF ve Poly (a) kuyruk T7_12A-Fluc olarak atıfta. Şablon DNA 'sında mevcut olmayan tüm ek unsurları kapsayacak şekilde tasarım astar (Ileri ve geri) (Şekil 2a).
Not: Tüm öğelerin dizisi Tablo 1 ' de bulunabilir. - İleri astar birkaç ekstra nükleotidler dahil (5 '-3 ')28, sonra T7-Promoter, Poly (A) lideri veya istenen 5 '-UTR dizisi ve yaklaşık 20 nükleotid, Tmdayalı olarak ayarlamak, karşılık gelen 5 ' muhabirin geni sonuna Orf. Primer içinde karşılık gelen bölgenin gen duyu iplikiyle (+ Strand) özdeş olduğundan emin olun.
Not: Uzun 5 '-UTR için, iki DNA parçaları sentezlemek: bir T7 organizatör ile uzun 5 '-UTR ve ikinci muhabiri geni ORF ile izledi. Bu iki parçaya PCR29örtüşme uzantısı kullanarak katılın. - Tasarım ters astar (5 '-3 ') Poly (A) kuyruk ve yaklaşık 20 nükleotidler dahil etmek, Tmdayalı ayarlamak, muhabirin genin ORF 3 ' sonuna karşılık gelen. Primer içinde karşılık gelen bölgenin gen Anti-duyu Strand (-Strand) özdeş olduğundan emin olun ve bir çerçeve içinde stop kodon Poly (A) kuyruk önce mevcut.
Not: Poli (A) lideri veya Poly (A) kuyruğunda A 'nın istenilen uzunluğu astar içinde özelleştirilebilir. Örneğin, eklemek için 50 A 's Poly (A) kuyruk, ters astar 50 T gerektirmelidir. Benzer şekilde, eklemek için 20 A 's Poly (A) lideri, ileri astar 20 A 's gerektirmelidir. - İç kontrol için, 5 '-3 ' yönünde aşağıdaki öğeleri içeren başka bir astar seti Tasarla: T7 Promoter, kozak dizisi içeren rasgele 5 '-UTR kodlama dizisi, Renilla Lusiferaz ORF ve Poly (a) kuyruğu T7_ olarak anılacaktır Kozak-Rluc.
- Bir PCR tüpünde, reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyin: DNase serbest su, 2x yüksek sadakat DNA Polymerase, astar, ve sıra teyit Lusiferaz şablon DNA (Tablo 2).
Not: Karışımı bireysel bileşenlerin tutarları reaksiyon hacmine göre ayarlanması gerekir. - Tablo 3' te gösterildiği gıbı bir DNA şablonu oluşturmak için standart 3 adımlı (denaturation, tavlama, uzatma) PCR döngüsü kullanın.
Not: Tavlama sıcaklığı X °c kullanılan primer set ve uzatma süresi T min PCR amplikon boyutuna ve kullanılan DNA polimeraz bağlıdır bağlıdır. - PCR ürününü% 1 agaroz Tris-asetat-EDTA (Tae) jel elektroforezi (0.1 μg/ml etidyum bromür içeren) ve ticari olarak mevcut moleküler ağırlık standardı ile% 5-10 oranında çalıştırarak algılayın. PCR ürününün boyutunu belirlemek için bir UV aydınlatıcısı altında jel görselleştirin.
- PCR ürününün doğru boyutunu belirledikten sonra, T7_Kozak-Rluc için T7_12A-Fluc ve ~ 1,0 KB için ~ 1,7 KB, ticari olarak kullanılabilen bir PCR arıtma kiti kullanarak arındırır. 100 μL nükleaz ücretsiz suyu kullanarak DNA 'yı elute (Şekil 2B).
- Bir kez, bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu kontrol ve A260/A280 oranını belirlemek (~ 1.8-2.0 kabul edilebilir) saflaştırılmış.
- Arındırılmış DNA 'Yı-20 °C ' de saklayın veya hemen in vitro transkripsiyon için kullanın.
2. In vitro transkripsiyon tarafından mRNA üret
-
RNA 'nın PCR üründen in vitro sentezini, bir in vitro transkripsiyon kiti kullanarak (Şekil 3A).
Not: T7_12A-Fluc ve T7_Kozak-RLUC DNA şablonları sırasıyla 12A-Fluc ve kozak-Rluc mRNAs sentezlemek için kullanılır.- Bunu yapmak için, bir mikrosantrifüj tüpü alın ve reaktifler aşağıdaki sırayla ekleyin: DNase-RNase serbest su, NTP tampon karışımı, Cap analog, şablon PCR ürün, T7-RNA polimeraz Mix (Tablo 4).
Not: Diğer kapak sistemleri ayrıca, üreticinin talimatını takiben in vitro transkripsiyon sonrası RNA 'ya sıralı olarak da kullanılabilir. - 37 °C ' de 2 saat boyunca iyice karıştırın ve inküye yapın.
- RNA arıtma kiti kullanarak sentezlenmiş RNA 'nın arıtılmasına devam edin.
- Bunu yapmak için, bir mikrosantrifüj tüpü alın ve reaktifler aşağıdaki sırayla ekleyin: DNase-RNase serbest su, NTP tampon karışımı, Cap analog, şablon PCR ürün, T7-RNA polimeraz Mix (Tablo 4).
- RNA 'yı kontrol etmek için% 1,5 agaroz Tris-borate-EDTA (TBE) jel (0,5 μg/ml etidyum bromür içeren) içinde saflaştırılmış RNA çalıştırın. Bir UV aydınlatıcısı altında jel görselleştirin (Şekil 3B).
- Bir spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu kontrol edin ve A260/A280 oranını belirleyin (~ 1.8-2.0 kabul edilebilir).
- Saflaştırılmış RNA ve mağaza at-80 °C.
3. mRNA 'yı hücrelere transfekt
- Bir 24-kuyu plaka tohum HeLa hücreleri (yaklaşık ~ 80-90% confluent ertesi gün) ve% 5 CO2Ile 37 °c ' de bir kuluçko bir gecede inkübe.
- , Bir multiplicity içinde Vaccinia virüsü (VACV) ile HeLa hücreleri enfekte (MOı) 5 ya da karşılaştırma için enfekte olmayan HeLa hücreleri tutmak.
Not: MOı hücre başına bulaşıcı viral parçacıklar sayısıdır. - MOI X = {[(hücre sayısı * X)/virüs titer] * 1000} μL 1 mL orta başına virüs.
-
İstenilen h sonrası enfeksiyon (HPi) (10-12 HPi 'de bu denemede), Şekil 3c'de gösterildiği gibi bir cationıc lipid transfeksiyon reaktif kullanarak mRNA (24-kuyu plakaları başına toplam mrna 500 ng) transfect.
- Bir 24-kuyu plaka bir iyi için, mix 480 ng 12A dizi Firefly Lusiferaz (12A-Fluc) mRNA ve 20 ng kozak sıra taşıyan Renilla Lusiferaz (kozak-rluc) mRNA bir mikro santrifüj tüp. Başka bir mikrosantrifüjte tüp 1,1 ekleme μL cationıc lipid transfeksiyon reakajının.
- Her iki tüpte düşük serum orta 55 μL ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın ve inküye yapın.
- 5 dk. inkübasyon yapıldıktan sonra, mRNA 'da tüp içeren azaltılmış serum ortamı içeren 55 μL katyonik lipid transfeksiyon reakajının eklenmesi.
- Hafifçe ama iyice karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında inküye.
- İnkübasyon sırasında, hücre kültürü ortamını çıkarın ve 24-kuyu plakalarının iyi başına düşük serum Orta 400 μL ekleyin.
- İnkübasyon sonrası, 100 μL karışımı dropwise ve eşit bir iyi 24-kuyu plakaları ekleyin.
4. luciferase etkinliklerini ölçmek
- Beş saatlik Post-Co-transfeksiyon 12A-Fluc ve kozak-rluc mRNA, bir Lusiferaz tahlil sistemi iki muhabir deneyleri performans yeteneğine kullanarak ölçmek Lusiferaz aktivite (örneğin, Çift Lusiferaz Reporter tahlil kiti).
- Azaltılmış serum orta çıkarın ve 150 μL 1x liziz tampon, Lusiferaz tahlil kiti bir bileşeni ekleyerek hücreleri Lyse.
- Oda sıcaklığında 10 min inkübasyon yapıldıktan sonra, hücreleri parçalayarak lysate toplayın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 4 °C ' de 10 dakika için 12.000 x g 'de lysate Santrifüjü Pelet hücre enkaz.
- Bir katı alt ile opak duvarlı 96 iyi beyaz assay plaka süpernatant 30 μL ekleyin.
- Lusiferaz tahlil kiti ve MultiMode plaka okuyucu Luminometre kullanarak çift lüminesans ölçmek.
- Tablo 5' te açıklanan ayarları kullanarak kinetik fonksiyonunu (her iyi bazda) kullanarak ölçümü gerçekleştirin.
Not: Okuma da manuel Luminometer kullanılarak alınabilir. Bir küvette Fluc için eşit hacimli lysate ve substrat ekleyin. Luminometre kullanarak 10 s için 2 s ve ölçü bekleyin. Fluc ölçümünü takiben, luminometreden hızlı bir şekilde küvetten çıkarın ve Rluc için el ile eşit hacimli bir substrat ekleyin. Yine, 2 s ve ölçü için 10 s Luminometer kullanarak bekleyin. - Lüminesans okuma verilerini arzu edilen bir dosya biçimine dışa aktarın.
- Dahili kontrol Rluc değeri ile Fluc değerini bölerek enfekte olmayan ve VACV enfekte HeLa hücrelerinde 12A-Fluc mRNA göreli çeviri oranını belirleyin.
Not: Ek Şekil 1 göreli Fluc aktivitesini elde etmek için ham verilerin adım adım analizini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İn vitro transkripsiyon RNA tabanlı Lusiferaz Reporter tahlil dört adım: PCR In vitro transkripsiyonu için DNA şablonu oluşturmak için, mRNA üretmek için in vitro transkripsiyon, mRNA transfeksiyon, ve Lusiferaz ölçümü, şematik diyagramda görülebilir ( Şekil 1). Hem DNA şablonları (Fluc ve rluc) hem de çıkıntı uzantısı PCR genel şeması için astar tasarımı şematik olarak gösterilmiştir (Şekil 2a). PCR 'den sonra, doğru boyutlu PCR ürünü Tae agaroz jel elektroforezi ile tespit edildi (Şekil 2B). Daha sonra, PCR ürün boyutunu doğrulamak için TBE jel elektroforez içinde arıtılmış ve çalıştırılan RNA in vitro (Şekil 3A) sentezlemek için şablon olarak kullanılır (Şekil 3B). Saflaştırılmış ve doğrulanmış mRNA, cationıc lipid transfeksiyon reakajının (Şekil 3c) kullanıldığı hücrelere transfikasyondadır. Bu protokolde kullanılan astar tablosu 6' da listelenir.
İn vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil poksvirüs enfeksiyonu sırasında mRNA çeviri 5 '-Poly (A) lideri rolünü anlamak için geliştirilmiştir. Bu tahlil kullanarak, biz bir 5 '-Poly (A) lideri (12 NT) enfekte ve VACV enfekte hücrelerde içeren bir Fluc mRNA çeviri etkinliğini test. Fluc değeri, göreli Fluc aktivitesini (örn. Fluc aktivitesi/Rluc aktivitesi) belirlemek için hem enfekte olmayan hem de VACV enfekte hücrelerdeki Rluc değerini kullanarak normale döndü (Şekil 4A). Rluc tarafından Fluc bölünmesi belirli bir kuyunda transfeksiyon verimliliği ve RNA stabilitesi normalleştirilmiş. Bu analiz yaklaşımı kullanılarak, mRNA içeren 5 ' Poli (A) liderinin VACV enfeksiyonu sırasında translasyonel bir avantajı olduğunu tespit ettik (Şekil 4b). RNA seviyesi enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde benzer olduğu gibi enfekte hücrelerdeki avantajı diferansiyel transfeksiyon verimliliği veya mRNA stabilitesi nedeniyle değildi 5 h Post mRNA transfeksiyon19.
Şekil 1: deneysel prosedürün şematik. PCR istenen elemanlar ile bir DNA şablonu oluşturmak için kullanılır. mRNA bir Lusiferaz Reporter gen kodlama T7 RNA polimeraz tabanlı sistemi kullanarak in vitro sentezlenen. A Firefly Lusiferaz (Fluc) mRNA bir Renilla Lusiferaz ile Co-transfected (rluc) mRNA enfekte veya vacv enfekte hücrelere. Lusiferaz faaliyetleri, Çift Lusiferaz kapasitesine sahip bir Luminometre kullanılarak ölçülür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Primer tasarım ve PCR tabanlı DNA amplifikasyonu. (A) ileri astar bir 8NT rasgele dizi, T7 Organizatör, istenen 5 '-UTR ve Lusiferaz muhabiri geni 5 ' ucundaki bir parçası tarafından takip sentezlenen ise, Reverse astar Poly (a) kuyruk ve 3 ' sonu oluşturmak için bir T-yolu içerir Lusiferaz muhabiri geni. Çıkıntı uzatma PCR ile bir plazmid şablon Lusiferaz geni içeren kullanarak, bir DNA şablonu oluşturulur. (B) PCR reaksiyonundan istenilen boyutta DNA bandı% 1 agaroz Tae jel elektroforezi kullanılarak tespit edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: mRNA sentezi ve transfeksiyon. (A) in vitro transkripsiyon şematik. 5 '-UTR ' a gelen Lusiferaz geni içeren PCR tarafından güçlendirilmiş DNA ve T7 promotör şablon olarak kullanılır. T7 RNA polimeraz promotör için işe ve 5 ' den 3 ' yönüne kadar, beyaz gösterilen ribonucleotides ekler. MRNA ise 25-30 NT uzunluğundadır, m7G Cap bir anti-Reverse Cap analog, arca kullanılarak eklenir. (B) in vitro transkripsiyon Ware 'den RNA bantları 1,5% agaroz TBE jel elektroforez kullanılarak tespit edilmiştir. (C) muhabir mRNA 'nın hücrelere transfeksiyonunu gösteren şematik. Gazeteci mRNA ya da ayrı tüplerde cationıc lipid transfeksiyon reakajının bulunduğu Orta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca dengelenmeye izin verilir. Daha sonra çözüm, oda sıcaklığında inkübasyon takiben 15 dakika sonra RNA/transfeksiyon reakajının karışımı kültür plakalarının hücrelere eklendikten sonra karıştırılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4:5 ' Poli (a) lideri Içeren mRNA 'nın translasyonel verimliliği artar. (A) 5 '-UTR ' a Poly (a) lideri ve beş '-UTR ' a kozak görüş sırası Ile Rluc mRNA içeren Fluc mRNA, hücrelere ortak transferdir. (B) 5 '-Poly (A) lideriyle Fluc mRNA, Rluc mRNA ile birlikte enfekte edilmemiş ve vacv enfekte hücrelerde transferat yapıldı. 5 HPi, Lusiferaz aktivitesi bir Luminometer kullanılarak ölçülmüştür. Rluc normalleştirilmiş Fluc aktivitesi enfekte olmayan ve VACV enfekte hücrelerde temsil edilir. Hata çubukları, en az üç yinelemeler standart sapmaları (SD) gösterir. P-değerleri belirlemek için öğrencinin t-testi kullanıldı; P-değer < 0,001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Öğe | Sıra |
| T7 Promoter | (Aktaş) |
| Poly (A) lideri | AAAAAAAAAAAA, 3 ila 51 arasında değişen |
| Kozak serisi | (GCCACC) |
| Poly (A) kuyruk | AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA...... |
Tablo 1: yöntemde kullanılan diziler – tablo T7 Promoter, Poly (A) lideri, kozak dizisi, Poly (A) kuyruğu dizileri içerir.
| Bileşen | Birim |
| DNase ücretsiz su: | 38 (μL) |
| 2x yüksek sadakat DNA polimeraz Master Mix: | 50 (μL) |
| İleri astar (10 μM): | 4 μL |
| Ters astar (10 μM): | 4 μL |
| Luciferase DNA şablonu (1-10 ng/μL): | 4 μL |
| Toplam: | 100 (μL) |
| Fluc DNA şablonu için kaynak pGL3-Fluc Plasmid | |
| Rluc DNA şablonu için kaynak pRL-Rluc plazmid |
Tablo 2: PCR reaksiyonu- to sipariş ve bileşenlerin hacmi PCR reaksiyon eklendi.
| Adım | Sıcaklık | Zaman | Döngüsü |
| İlk denatürasyon | 95 °C derece | 2 dk. | (1x döngüsü) |
| Denatürasyon | 95 °C: | 15 sn | |
| Tavlama | X °c: | 30 sn | (25x döngüsü) |
| Uzantısı | 72 °C: | T dk | |
| Final uzatma | 72 °C: | 7 dk. | (1x döngüsü) |
| Tutun | 4 °C: | ∞ |
Tablo 3: PCR programı – sıcaklık, zaman ve döngü ile birlikte PCR programı için adımlar.
| Bileşen | Birim | |
| DNase-RNase ücretsiz su: | 20 μL 'ye kadar | |
| NTP tampon Mix (her rNTP 20 mM): | 2 μL | |
| Cap analog (40 mM): | 4 μL | |
| Şablon PCR ürün (400 ng) *: | X μL | (PCR ürün konsantrasyonu bağımlı) |
| T7-RNA polimeraz karışımı: | 2 μL | |
| Toplam: | 20 μL | |
| * T7_12A-Fluc ve T7_Kozak-Rluc sırasıyla 12A-Fluc ve kozak-Rluc mRNA sentezlemek için kullanılan şablon. |
Tablo 4: In vitro transkripsiyon reaksiyonu-in vitro transkripsiyon reaksiyonu için eklenen bileşenlerin sırası ve hacmi.
| Adım -ları | Ses/saat |
| Luciferase assay substrat (Fluc) enjekte: | 30 μL |
| Bekleyin/Kuluçbe Zamanı: | 2 sn |
| Işıkesans ölçümü (Fluc): | 10 sn |
| GLO substrat (Rluc) & Durdur: | 30 μL |
| Bekleyin/Kuluçbe Zamanı: | 2 sn |
| Işıkesans ölçümü (Rluc): | 10 sn |
Tablo 5: luciferase ölçüm ayarları – Önerilen hacim veya zaman ile Lusiferaz ölçümü için adımlar.
| Astar | Sıra |
| T7-12A-Fluc Ileri | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGaaaaaaaaaaaa (Akdağ) |
| T7-12A-Fluc ters | BIR daha DEĞIL, çok fazla. |
| T7-kozak-Rluc Forward | ATCGACGATAATACGACTCACTATAGGGatcgtagccacc (ATGACTTCGAAAGTTTATGATC) |
| T7-kozak-Rluc ters | BIR daha DEĞIL, çok fazla. JAACTCGCTC |
Tablo 6: astarlar-bu yöntemle tam dizileri ile kullanılan astar.
Tamamlayıcı Şekil 1: ham verilerin analizi – normalleştirilmiş verileri almak için ham verileri çözümlemek için adımlar. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tüm dört çekirdekli adımlar in vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil başarısı için önemlidir. Özellikle T7 Organizatör dizisi için primer tasarıma özel dikkat verilmelidir. T7 RNA polimeraz, 5 '-UTR dizisinden önce eklenen T7 promotör 'de ilk altı çizili G (ggg-5'-UTR-Aug-) den transkripsiyon başlar. Transkripsiyon başlangıç sitesi (TSS) 5 ' ucunda ilk g 'den başlaysa da, T7 Organizatör bölgesinde 3 ' ten az olan g sayısının azaltılması RNA verim/çıkışını in vitro transkripsiyondan düşürmüştür. Deney sırasında, aynı zamanda RNA 'nın verimi ve kalitesi düşükse, jel arıtılmış DNA ürününün in vitro transkripsiyon için en iyi olmadığını gözlemledik. PCR reaksiyonunun% 5-10 'ini, in vitro transkripsiyon için kullanılmak üzere bir PCR arıtma kiti kullanarak% 1 agaroz jel elektroforez cinsinden boyutunu belirlemek ve geri kalanı% 90-95 ' e kadar arındırdık. PCR 'den spesifik olmayan amplifikasyon durumunda, istenilen büyüklükte bandın jel ile kesilmesi ve jel-saflaştırılmış DNA parçası kullanılması önerilir. Verim düşük olabileceği için, in vitro transkripsiyon reaksiyonu için reaksiyon hacmini arttırmayı öneririz. Diğer transfeksiyon tabanlı yöntemlere benzer şekilde, DNA/RNA, küresel veya seçmeli olarak çeviriyi pasifleştirebilen DNA/RNA algılama yollarını uyarabilir. Bu nedenle, veri uyarıları ile yorumlanması gereken, biz potansiyel bizim deneyler bu sorundan kaynaklanan sorunlarla karşılaşmadı rağmen.
Önerilen yöntem, mRNA tesliminin yöntemi, kullanılmak üzere iç kontrol, çeviri için uygun bir zaman, numune hazırlama ve veri analizi gibi bazı değişikliklerle farklı model sistemlerinde kullanılmak için uygundur. Bu yöntemin ana sınırlama, hızlı bir şekilde tamamen fizyolojik koşulları yansıtmayan BDT elemanları tarafından çeviri Yönetmeliği test etmek için bir muhabir tahlil olmasıdır. Bu nedenle, bu yöntem mümkünse diğer tamamlayıcı deneyler tarafından desteklenmelidir.
DNA modifikasyonu ile karşılaştırıldığında, RNA modifikasyonların rolleri daha az iyi anlaşılır. Ancak, RNA modifikasyonları yazma, okuma ve silme enzimlerin keşfi ile30,31,32,33,34,35, şimdi etkisini incelemek mümkün gen ifadesinde RNA Modifikasyon30,31,32,33,34,35. İn vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabir tahlil farklı RNA modifikasyonları dahil etmek için değiştirilebilir ve RNA çevirisi üzerindeki etkilerini test etmek için kullanılır. Örneğin, bu yöntem, çeşitli değişiklikler30,31olan farklı Cap analogları dahil edebilirsiniz. Buna ek olarak, iç RNA Modifikasyon sırasında veya sonra içinde, dahili RNA değiştirme enzim dahil olabilir. 0, Cap 1 ve iç RNA modifikasyonu için bir değişikliğin eklenmesi, bu RNA değişikliklerinin çeviride rollerini incelemek için bir araç sağlayacaktır.
İn vitro transkripsiyonu RNA tabanlı Lusiferaz muhabiri tahlil RNA çevirisi hakkında temel biyoloji anlamak büyük potansiyel ve geniş bir uygulama vardır. Tercüme başlatılması için farklı mekanizmalar, Cap-bağımlı başlatma dahil, Cap-bağımsız başlatma, yeniden başlatma ve iç inisiyasyon gibi ILL bu yöntem kullanılarak incelenebilir. Bu avantajları üzerine, bu tahlil BDT-elemanları tarafından 5 '-UTR ve 3 '-UTR bir mRNA içinde çeviri Yönetmeliği test etmek için istihdam edilebilir. Açıklanan protokol, uzun klonlamayı önlemek ve RNA elemanlarının çeviride etkilerini hızla incelemek için avantaj sağlayan PCR ürününü kullanır. PCR sırasında olası hataları en aza indirmek için yüksek sadakat polimeraz ve düşük PCR döngü numarası kullanılmalıdır. Alternatif olarak, bir şablon sık kullanılırsa, istenen 5-' UTR ve Lusiferaz ORF içinde bir Plasmid içine klonlanabilir in vitro transkripsiyon şablonu. Birlikte, protokol tek bir reaksiyon içinde transkripsiyon ve mRNA kapatma birleştirir ve konvansiyonel transfeksiyon ve analiz RNA tabanlı Lusiferaz muhabir assay bir Kullanıcı dostu, hızlı ve basit bir yöntem içinde vitro transkripsiyon yapmak kullanır mRNA çeviri mekanizmaları çalışma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali faiz bildirmek istiyorum.
Acknowledgments
Proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI128406 www.nih.gov) tarafından ZY 'ye ve kısmen Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) tarafından PD 'ye Lisansüstü öğrenci yaz maaşları şeklinde finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
- Crick, F. H.
- Crick, F.
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell. 136, 731-745 (2009).
- Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress. Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).
- Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. Orthopoxviruses Pathogenic for Humans. , Springer US. (2005).
- Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).
- Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351 (2013).
- Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).
- Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region. Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).
- Pelletier, J., Sonenberg, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 334, 320-325 (1988).
- Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region. RNA. 6, 1808-1820 (2000).
- Simon, A. E., Miller, W. A. 3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses. Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).
- Marom, L., et al. Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES. RNA Biology. 6, 446-454 (2009).
- Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).
- Ahn, B. Y., Moss, B. Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs. Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).
- Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript. Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).
- Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader. Cell. 50, 163-169 (1987).
- Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs. Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).
- Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation. PLOS Pathogens. 13, e1006602 (2017).
- Jha, S., et al. Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase. Nature. 546, 651-655 (2017).
- Dai, A., et al. Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff. Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).
- De Silva, F. S., Moss, B. Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors. Journal of Virology. 2, 23 (2005).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).
- Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts. Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).
- Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. , Academic Press. (2012).
- Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter. Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).
- Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).
- Akichika, S., et al. Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase. Science. , (2018).
- Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase. Cell Research. 1, (2018).
- Boulias, K., et al. Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome. bioRxiv. , 485862 (2018).
- Dominissini, D., Rechavi, G. N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation. Cell. 175, 1725-1727 (2018).
- Wei, J., et al. Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm. Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).
