In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Unser Protokoll für einen in vitro transkribierten RNA-basierten Luziferase-Assay hilft, die Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht eine kundenspezifische Länge des Poly(A)Liters das Studium seiner regulatorischen Auswirkungen auf die Übersetzung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Übersetzungsregulierung durch Cis-Elemente wie 5'UTR und 3'UTR in mRNA und ein breites Spektrum der Übersetzungsinitiierung ermöglicht.

Der in vitro transkribierte RNA-basierte Luziferase-Reporter-Assay kann auf Modifikationen an Kappen und andere Modifikationen zugeschnitten und verwendet werden, um die Wirkung auf die Übersetzung zu testen. Entwerfen Sie zunächst Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, um PCR-Amplikon zu erzeugen, das die folgenden Elemente in 5'bis 3'Richtung enthält:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF in einem Poly(A)tail, der als T7_12A-Fluc bezeichnet wird, enthalten mehrere zusätzliche Nukleotide in Vordergrundung, gefolgt von T7-Promoter Poly(A)liter oder gewünschter 5'UTR-Sequenz und etwa 20 Nukleotiden, die dem 5'Ende des ORF des Reportergens entsprechen. Passen Sie die Grundierungslänge basierend auf der Schmelztemperatur an, die dem 5'Ende des ORF des Reportergens entspricht, um sicherzustellen, dass die entsprechende Region im Primer mit dem Sinnesstrang des Gens identisch ist.