Name: In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie ein Luciferase-Reporter-Assay mit in vitro transkribierter RNA die Translationsregulation in Pockenviren-infizierten Zellen untersucht. Diese Methode analysiert Cis-Elemente wie 5'UTR und 3'UTR in mRNA.

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Das Projekt wurde von den National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) an ZY und teilweise vom Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) in Form des Graduate Student Summer Stipend to PD gefördert.

1. Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR für In-Vitro-Transkription 
<ol><li>Zur Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR, Design-Primer. Bei der Konstruktion von Primern beachten Sie entscheidende Eigenschaften wie Primerlänge, Glühtemperatur (Tm), GC-Gehalt, 3 ' Ende mit G oder C etc. NOTE: In dieser Literatur 25,26,27ausführlich diskutiert.</li>
	<li>Design-Primer zur Generierung von PCR-Amplizium, das die folgenden Elemente in 5 ' bis 3 ' Richtung enthält: T7-Promoter, Poly (A) Anführer, firefly luciferase ORF und ein Poly (A) Schwanz, der im Folgenden als T7_12A-Fluc bezeichnet wird. Design-Primer (Forward and Reverse), um alle zusätzlichen Elemente, die nicht in der Vorlage DNA vorhanden sind (Abbildung 2A). NOTE: Die Reihenfolge aller Elemente finden Sie in Tabelle 1.
</li>
	<li>Fügen Sie mehrere zusätzliche Nukleotide in vordere Grundierung (5 '-3') 28, gefolgt von T7-Promoter, Poly (A) Leader oder gewünschte 5 '-UTR-Sequenz und etwa 20 Nukleotide, passen Sie auf Tm, entsprechend dem 5 ' Ende des Reporter-Gens ' s Orf. Stellen Sie sicher, dass die entsprechende Region in der Grundierung identisch ist mit dem Sinnesstrang (+ Strang) des Gens. NOTE: Synthies für lange 5 '-UTR, synthetisieren Sie zwei DNA-Fragmente: Eines mit T7-Promoter, gefolgt von langen 5 '-UTR und das zweite mit dem ORF des Reporter-Gens. Schließen Sie sich diesen beiden Fragmenten mit der Überlappung der PCR29an.</li>
	<li>Design Reverse-Primer (5 '-3 '), um Poly (A) Schwanz und etwa 20 Nukleotide, Anpassung auf Tm, die dem 3 ' Ende des Reporter-Gens ORF entspricht. Stellen Sie sicher, dass die entsprechende Region in der Grundierung identisch ist mit dem Anti-Sinse-Strang (-Strang) des Gens und ein In-Frame-Stop-Codon vor dem Poly (A) Schwanz vorhanden ist. NOTE: Die gewünschte Länge von A es in einem Poly (A) Leader oder Poly (A) Schwanz kann in den Primern angepasst werden. Zum Beispiel, um 50 A es in den Poly-Schwanz (A) hinzuzufügen, sollte die umgekehrte Grundierung 50 T es enthalten. In ähnlicher Weise, um 20 A es in der Poly (A) Führer hinzuzufügen, sollte der Vorwärts-Primer 20 A es enthalten.</li>
	<li>Für die interne Steuerung, entwerfen Sie eine weitere Reihe von Primern, die die folgenden Elemente in 5 ' bis 3 ' Richtung enthalten: T7 Promoter, eine zufällige 5 '-UTR-Codierungssequenz, die Kozak-Sequenz, Renilla luciferase ORF und Poly (A) Schwanz im Folgenden als T7_ bezeichnet wird. Kozak-Rluc.</li>
	<li>Fügen Sie in einem PCR-Rohr die Reagenzien in folgender Reihenfolge hinzu: DNasfreies Wasser, 2x hochtrabende DNelität-DNA-Polymerase, Primer und sequenzbestätigte Luciferase-Vorlage DNA (Tabelle 2). NOTE: Die Anzahl der einzelnen Komponenten im Gemisch sollte je nach Reaktionsvolumen angepasst werden.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Standard-3-stufigen PCR-Zyklus (Denaturation, Annealing, Extension), um eine DNA-Vorlage zu erzeugen, wie in Tabelle 3gezeigt. NOTE: Die Glühtemperatur X ° C hängt von der verwendeten Grundierung ab, und die Verlängerungszeit T min hängt von der PCR-Amplizium-Größe und der verwendeten DNA-Polymerase ab.</li>
	<li>Erkennen Sie das PCR-Produkt, indem Sie 5-10% der PCR-Reaktion in 1% agarose Tris-Acetate-EDTA (TAE) Gel-Elektrophorese (mit 0,1 μg/ml-Ethidium Bromid) zusammen mit handelsüblichen molekularen Gewichtsstandard ausführen. Visualisieren Sie das Gel unter einem UV-Beleuchter, um die Größe des PCR-Produktes zu bestimmen.</li>
	<li>Nach der Bestimmung der korrekten Größe des PCR-Produktes, ~ 1.7 kb für T7_12A-Fluc und ~ 1.0 kb für T7_Kozak-Rluc, reinigen Sie es mit einem handelsüblichen PCR-Reinigungssatz. Die DNA mit 100 μL Nuklease-freiem Wasser auslöschen (Abbildung 2B).</li>
	<li>Sobald die DNA gereinigt ist, überprüfen Sie die Konzentration der DNA mit einem Spektrophotometer und bestimmen Sie das A260/A280 Verhältnis (~ 1,8-2.0 ist akzeptabel).</li>
	<li>Die gereinigte DNA bei-20 ° C speichern oder für die In-vitro-Transkription sofort verwenden.</li>
</ol>2. Erzeugen mRNA von In Vitro Transkription
<ol><li>
Synthesize-RNA aus dem PCR-Produkt in vitro, mit einem In-vitro-Transkriptsatz (Abbildung 3A). Hinweis: T7_12A-Fluc und T7_Kozak-Rluc werden verwendet, um 12A-Fluc bzw. Kozak-Rluc mRNAs zu synthetisieren.<ol>
<li>Dazu nehmen Sie ein Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzu: DNase-RNase freies Wasser, NTP Buffer Mix, Cap Analog, Template PCR Product, T7-RNA Polymerase Mix (Tabelle 4). NOTE: Andere Deckelsysteme können auch verwendet werden, um RNA nach der In-vitro-Transkription nach der Anleitung des Herstellers sequenziell zu kappen.</li>
		<li>Gut mischen und bei 37 ° C für 2 Stunden inkubieren.</li>
		<li>Gehen Sie zur Reinigung der synthetisierten RNA mit einem RNA-Reinigungssatz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie gereinigte RNA in 1,5% agarose Tris-borate-EDTA (TBE) Gel (mit 0,5 μg/mL Ethidium Bromid), um die RNA zu überprüfen. Das Gel unter einem UV-Beleuchtungsgerät (Abbildung 3B) visualisieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Konzentration der RNA mit Hilfe eines Spektrophotometers und bestimmen Sie das Verhältnis A260/A280 (~ 1,8-2,0 ist akzeptabel).</li>
	<li>Die gereinigte RNA ausrichten und bei-80 ° C lagern.</li>
</ol>3. Transfect mRNA to Cells
<ol><li>Saatgut-HeLa-Zellen in einer 24-Well-Platte (ca. ~ 80-90% am nächsten Tag konfluent) und Inkubat über Nacht in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO2.</li>
	<li>Infizieren Sie HeLa-Zellen mit einem Impfstoffvirus (VACV) bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 5 oder halten Sie nicht infizierte HeLa-Zellen zum Vergleich. NOTE: MOI ist die Zahl der infektiösen Viruspartikel pro Zelle.</li>
	<li>MOI von X = {[(Anzahl der Zellen * X)/Virus Titer] * 1000} μl des Virus pro 1 mL Medium.</li>
	<li>
Nach der gewünschten h Post-Infektion (hpi) (in diesem Experiment bei 10-12 hpi), transfect mRNA (500 ng der gesamten mRNA pro Brunnen von 24-well-Platten) mit einem kationischen Lipid-Transfection Reagenz, wie in Abbildung 3Cgezeigt.
	<ol>
<li>Für einen Brunnen einer 24-Well-Platte, mischen 480 ng von 12A Sequenz mit firefly luciferase (12A-Fluc) mRNA und 20 ng Kozak-Sequenz mit Renilla luciferase (Kozak-Rluc) mRNA in einem Mikrozentrifugenrohr. In einem weiteren mikrozentrifugen Rohr werden 1,1 μL kationisches Lipidtransfektionsreagenz hinzugefügt.</li>
		<li>In beiden Röhren 55 μL reduziertes Serummedium hinzufügen. Mischen Sie und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
		<li>Nach 5 Minuten Inkubation, fügen Sie 55 μL kationisches Fetttransfektionsreagenz mit reduziertem Serummedium in mRNA mit Schlauch.</li>
		<li>Mischen Sie sanft, aber gründlich, und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
		<li>Während der Inkubation das Zellkulturmedium entfernen und 400 μL reduziertes Serummedium pro Brunnen von 24-Brunnen-Platten hinzufügen.</li>
		<li>Nach der Inkubation 100 μL der Mischung droptisch und gleichmäßig zu einer gut 24-Brunnen-Platte geben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Maß Luciferase-Aktivitäten
<ol><li>Fünfstündige Post-Co-Transfektion von 12A-Fluc und Kozak-Rluc mRNA, messen luciferase-Aktivität mit einem Luciferase-Assay-System in der Lage, zwei Reporter-Assays (z. B. Dual Luciferase Reportage-Kit) durchzuführen.</li>
	<li>Entfernen Sie das reduzierte Serummedium und lysern Sie die Zellen, indem Sie 150 μL 1x Lysepuffer, ein Bestandteil des Luciferase-Assay-Bausatzes, hinzufügen.</li>
	<li>Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur sammeln Sie das Lysat, indem Sie die Zellen verschrotten und in ein Mikrozentrifugenrohr überführen.</li>
	<li>Zentrifuge das Lysat bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C, um Pelletzellschutt zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 30 μL Supernatant in undurchsichtige 96 gut weiße Assay-Platte mit einem festen Boden.</li>
	<li>Messen Sie die Dual-Lumineszenz mit dem Luciferase-Assay-Kit und einem Multimode-Plattenleser-Leuchtmesser.</li>
	<li>Führen Sie die Messung mit Hilfe der Kinetik-Funktion (auf pro-well-Basis) mit den Einstellungen, die in Tabelle5 beschrieben sind. NOTE: Die Lektüre kann auch mit einem manuellen Leuchtenmesser erfolgen. Fügen Sie ein gleichmäßiges Volumen von Lysat und Substrat für Fluc in einer Cuvette hinzu. Warten Sie auf 2 s und messen Sie auf 10 s mit Leuchtometer. Nach der Fluc-Messung schnell die Cuvette aus dem Leuchtometer herausnehmen und für Rluc manuell ein gleichmäßiges Volumen des Substrats hinzufügen. Warten Sie wieder auf 2 s und messen Sie 10 s mit Leuchtometer.</li>
	<li>Exportieren Sie die Lumineszenz-Lesdaten in ein wünschenswertes Dateiformat.</li>
	<li>Bestimmen Sie die relative Übersetzungsrate von 12A-Fluc mRNA in nicht infizierten und VACV-infizierten HeLa-Zellen, indem Sie den Fluc-Wert durch interne Kontrolle Rluc-Wert teilen. NOTE: Ergänzende Abbildung 1 zeigt die schrittweise Analyse von Rohdaten, um eine relative Fluc-Aktivität zu erhalten.</li>
</ol>

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<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+m6A%2C+m6Am%2C+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren möchten keine konkurrierenden finanziellen Interessen erklären.

Alle Vierkernschritte sind entscheidend für den Erfolg des in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Sassay. Besonderes Augenmerk sollte auf das Grundierdesign gelegt werden, insbesondere für die T7-Promoter-Sequenz. Die Transkription von T7-RNA beginnt mit der Transkription des unterstrichenen ersten G (GGG-5 '-UTR-AUG-) im T7-Promoter, der vor der 5 '-UTR-Sequenz hinzugefügt wurde. Obwohl die Transkription Startplatz (TSS) beginnt von der ersten G am 5 '-Ende, sank die Zahl der G es weniger als...

Nach dem zentralen Dogma fließt genetische Information von der DNA zur RNAund schließlich zudem Protein 1,2. Dieser Fluss von genetischen Informationen ist auf vielen Ebenen stark reguliert, einschließlich der mRNA-Übersetzung3,4. Die Entwicklung von Reporteranalysen zur Messung der Regulierung der Genexpression wird das Verständnis der in diesem Prozess involvierten Regulierungsmechanismen erleichtern. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der mRNA-Übersetzung mit einem in vitro transkribierten RNA-basierten Luciferase-Reporter-Test in poxvirus-infizierten Zellen.
Poxviren umfassen viele hochgefährliche menschliche und tierische Krankheitserreger 5. Wie alle anderen Viren setzen Poxviren bei der Proteinsynthese6,7,8ausschließlich auf Wirtszell-Maschinen. Um virale Proteine effizient zu synthetisieren, entwickelten Viren viele Strategien, um zelluläre Übersetzungsmaschinen zu entführen, um sie für die Übersetzung von viralen mRNAs7,8umzuleiten. Ein häufig von Viren verwendeteter Mechanismus ist es, cis-wirkende Elemente in ihren Transkripten zu verwenden. Bemerkenswerte Beispiele sind die interne Ribosome Entry Site (IRES) und cap-independent translation enhancer (CITE)9,10,11. Diese cis-Elementemachen die viralen Transkripte zu einem translationalen Vorteil, indem sie translationale Maschinenüberverschiedene Mechanismen 12, 13,14anziehen. Mehr als 100 poxvirus mRNAs haben ein evolutionär konserviertes cis-wirkendes Element in der 5 '-unübersetzten Region (5 '-UTR): Ein 5 '-Poly (A) Führer (A) an den ganz 5 ' Enden dieser mRNAs15,16. Die Längen dieser 5 '-poly (A)-Führer sind heterogen und werden durch das Verrutschen der poxviruskodierten RNA-Polymerase während der Transkription17,18erzeugt. Wir und andere haben vor kurzem herausgefunden, dass der 5 '-poly (A)-Führer einem mRNA in Zellen, die mit dem Impfinien-Virus (VACV) infiziert sind, einen Übersetzungsvorteil verleiht, demprototypischen Mitglied von Poxviren 19,20.
Der in vitro transkribierte RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test wurde ursprünglich entwickelt,umdie Rolle des 5 '-poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung währendder Poxvirus-Infektion 19,21zuverstehen. Obwohl Plasmid-DNA-basierte Lluciferase-Reporter-Assays weit verbreitet sind, gibt es mehrere Nachteile, die die Ergebnisinterpretation in poxvirus-infizierten Zellen erschweren. Zunächst können Plasmide in VACV-infizierten Zellen 22 vermehren. Zweitens kommt die kryptische Transkription häufig von Plasmid-DNA18,23, 24. Drittens erzeugt VACV-Promoter-getriebene Transkription Poly (A)-Führer heterogener Längen, was es schwierig macht, die Poly-(A)-Anleiterlänge in einigen Experimenten 18 zu kontrollieren. Ein in vitro transkribierter RNA-basierter Luciferase-Reporter-Test umgeht diese Probleme und die Dateninterpretation ist einfach.
Es gibt vier Schlüsselschritte in dieser Methode: (1) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription zu erzeugen; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung mRNA; (3) Transfektion zur Lieferung mRNA in Zellen; Und (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung (Abbildung1). Das daraus resultierende PCR-Amplizium enthält folgende Elemente in 5 ' bis 3 ' Richtung: T7-Promoter, Poly (A) Leader oder gewünschte 5 '-UTR-Sequenz, firefly luciferase open reading frame (ORF), gefolgt von einem Poly (A) Schwanz. PCR-Ampliver wird als Vorlage verwendet, um mRNA durch In-vitro-Transkription mit T7-Polymerase zu synthetisieren. Bei der In-vitro-Transkriptionwird m 7 G-Kappe oder andere Kappenanaloge in neu synthetisierte mRNA integriert. Die gekappten Transkripte werden in nicht infizierte oder VACV-infizierte Zellen transferiert. Das Zelllysat wird zum gewünschten Zeitpunkt nach der Transfektion gesammelt, um die Aktivitäten der Luciferase zu messen, die auf die Proteinproduktion aus der transfektiven mRNA hinweisen. Dieser Reporter-Test kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-element zu untersuchen, das in 5 '-UTR, 3 '-UTR oder anderen Regionen einer mRNA vorhanden ist. Darüber hinaus kann der in vitro transkribierte RNA-basierte Test verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der Übersetzungsinitiation zu untersuchen, einschließlich kap-abhängiger Initiation, kap-unabhängiger Initiation, Wiederinitiation und interner Initiation wie IRES.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase für die PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Anti-Reverse-Cap-Analogon oder ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Halbflächige weiße Polystyrol-Mikroplatte mit flachem Boden</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>Undurchsichtige weiße 96-Well-Platte mit fester Unterseite</td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>PCR-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>GloMax Navigator Mikroplatten-Luminometer</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Bezeichnet als Multimode Plate Reader Luminometer</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthese Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In Vitro-Transkriptionskit</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Kationisches Lipidtransfektionsreagenz</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Zur Messung der DNA- und RNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Reduziertes Serummedium</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>RNA-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>Vaccinia Verschließsystem</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080</td><td>Verschließsystem</td></tr></tbody></table>

in vitro transcribed rna-basierter luciferase reporter assay to study translation regulation in poxvirus-infizierten zellen

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Jedes Poxvirus mRNA, das nach der viralen DNA-Replikation transkribiert wurde, hat einen evolutionär konservierten, nicht temperierten 5 '-poly (A)-Anführer im 5 '-UTR. Um die Rolle des 5 '-Poly (A)-Anführers in der mRNA-Übersetzung während der Poxvirus-Infektion zu zerlegen, haben wir einen in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Test entwickelt. Dieser Reporter-Test besteht aus vier Kernschritten: (1) PCR zur Verstärkung der DNA-Vorlage für die In-vitro-Transkription; (2) In-vitro-Transkription zur Erzeugung von mRNA mit T7-RNA Polymerase; (3) Transfection zur Einführung in vitro transkribierte mRNA in Zellen; (4) Erkennung der Luciferase-Aktivität als Indikator für die Übersetzung. Der hier beschriebene RNA-basierte Luciferase-Reporter-Test umgeht Probleme der Plasmid-Replikation in poxvirusinfizierten Zellen und kryptischer Transkription aus dem Plasmid. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente in einer mRNA zu bestimmen, einschließlich 5 '-UTR und 3 '-UTR in anderen Systemen als poxvirus-infizierten Zellen. Darüber hinaus können mit dieser Methode verschiedene Arten der Übersetzungsinitiation wie kappenabhängig, kappenunabhängig, Wiederinitiation und interne Initiation untersucht werden.

Die vier Schritte des in vitro transkribierten RNA-basierten Lluciferase-Reporter-Anenstehens: PCR zur Erzeugung von DNA-Schablonen für In-vitro-Transkription, In-vitro-Transkription zur Erzeugung mRNA, mRNA-Transfektion und Luciferase-Messung, sind im schematischen Diagramm zu sehen ( Abbildung 1). Die Entwarf von Primern sowohl für DNA-Vorlagen (Fluc und Rluc) als auch für das allgemeine Schema der Überhangverlängerung PCRwird ...

Wir legen ein Protokoll vor, um die mRNA-Übersetzungsverordnung in poxvirus-infizierten Zellen zu untersuchen, die in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter Assay verwendet werden. Der Test kann für das Studium der Übersetzungsregulierung durch cis-Elemente einer mRNA verwendet werden, einschließlich 5 '-unübersetzter Region (UTR) und 3 '-UTR. Mit dieser Methode können auch verschiedene Übersetzungsinitiationsmodi untersucht werden.

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Unser Protokoll für einen in vitro transkribierten RNA-basierten Luziferase-Assay hilft, die Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht eine kundenspezifische Länge des Poly(A)Liters das Studium seiner regulatorischen Auswirkungen auf die Übersetzung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Übersetzungsregulierung durch Cis-Elemente wie 5'UTR und 3'UTR in mRNA und ein breites Spektrum der Übersetzungsinitiierung ermöglicht.Der in vitro transkribierte RNA-basierte Luziferase-Reporter-Assay kann auf Modifikationen an Kappen und andere Modifikationen zugeschnitten und verwendet werden, um die Wirkung auf die Übersetzung zu testen. Entwerfen Sie zunächst Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, um PCR-Amplikon zu erzeugen, das die folgenden Elemente in 5'bis 3'Richtung enthält:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF in einem Poly(A)tail, der als T7_12A-Fluc bezeichnet wird, enthalten mehrere zusätzliche Nukleotide in Vordergrundung, gefolgt von T7-Promoter Poly(A)liter oder gewünschter 5'UTR-Sequenz und etwa 20 Nukleotiden, die dem 5'Ende des ORF des Reportergens entsprechen. Passen Sie die Grundierungslänge basierend auf der Schmelztemperatur an, die dem 5'Ende des ORF des Reportergens entspricht, um sicherzustellen, dass die entsprechende Region im Primer mit dem Sinnesstrang des Gens identisch ist.Dann entwerfen Reverse Primer Poly(A)tail und ca. 20 Nukleotide. Passen Sie basierend auf der Schmelztemperatur entsprechend dem 3'Ende des ORF des Reportergens an, um sicherzustellen, dass der entsprechende Bereich des Primers mit dem Antisensestrang des Gens identisch ist und vor dem Poly(A)tail ein In-Frame-Stop-Codon vorhanden ist. Für die interne Kontrolle einen weiteren Satz von Primern entwerfen, die die folgenden Elemente in 5'bis 3'Richtung enthalten:T7-Promoter, eine zufällige 5'UTR-Codierungssequenz mit Kozak-Sequenz, Renilla Luciferase ORF und Poly(A)tail, genannt T7_Kozak-Rluc.Um die Reaktion einzurichten, fügen Sie Reagenzien in folgender Reihenfolge zu einem PCR-Rohr hinzu:DNase freies Wasser, 2X High-Fidelity-DNA-Polymerase, Primer und Sequenz bestätigte Luziferase-Vorlagen-DNA. Nach einem standardmäßigen dreistufigen PCR-Zyklus zur Erzeugung einer DNA-Vorlage, erkennen Sie das PCR-Produkt, indem Sie 5-10% der PCR-Reaktion in einer 1%Agarose TAE-Gelelektrophorese zusammen mit einem Molekulargewichtsstandard ausführen. Um die Größe des PCR-Produkts zu bestimmen, visualisieren Sie das Gel unter einem UV-Beleuchtungsgerät.Nach der Bestimmung der richtigen Größe des PCR-Produkts, reinigen Sie es mit einem handelsüblichen PCR-Reinigungskit mit 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser, um die DNA zu löschen. Überprüfen Sie die Konzentration der gereinigten DNA mit einem Spektralphotometer und speichern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die Verwendung zur In-vitro-Transkription. Um RNA aus dem PCR-Produkt zu synthetisieren, fügen Sie die folgenden Reagenzien zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu: DNase-RNase freies Wasser, NTP-Puffermix, Cap Analog, PCR-Produktvorlage und T7-RNA-Polymerase-Mix aus In-vitro-Transkriptionskit.Mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden und gehen Sie dann mit einem RNA-Reinigungskit zur Reinigung der synthetisierten RNA über. Um die gereinigte RNA zu überprüfen, erhitzen Sie RNA bei 70 Grad für fünf Minuten, um sekundäre Struktur zu entfernen und führen Sie sie auf 1,5 Agarose TBE Gel.Dann visualisieren Sie das Gel unter einem UV-Beleuchtungsgerät. Überprüfen Sie die Konzentration der gereinigten RNA mit einem Spektralphotometer. Aliquot it und lagern bei minus 80 Grad Celsius.Saat-HeLa-Zellen in einer 24-Well-Platte, um 80-90%konfluency am nächsten Tag zu erreichen und über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid zu brüten. Infizieren Sie HeLa-Zellen mit Vaccinia-Virus bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf und halten Sie nicht infizierte HeLa-Zellen zum Vergleich. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 10 bis 12 Stunden.Mischen Sie nach der gewünschten Stunde nach der Infektion 480 Nanogramm 12A Sequenz mit Firefly Luciferase mRNA und 20 Nanogramm Kozak-Sequenz mit Renilla Luciferase mRNA in einem Mikrozentrifugenrohr. In einem anderen Mikrozentrifugenrohr 1,1 Mikroliter kationisches Lipidtransfektionsreagenz hinzufügen. 55 Mikroliter reduzierter Serummedien in beide Röhren geben, bei Raumtemperatur fünf Minuten mischen und inkubieren.Fügen Sie dann 55 Mikroliter kationisches Lipidtransfektionsreagenz, das reduzierte Serummedien enthält, zu mRNA-haltigem Röhrchen hinzu. Mit einer Pipette sanft, aber gründlich mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren. Während der Inkubation, entfernen Sie das Zellkulturmedium aus den Zellen und fügen Sie 400 Mikroliter reduziertes Serummedium pro Brunnen hinzu.Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung fallen weise und gleichmäßig pro Brunnen der 24 Brunnenplatte. Fünf Stunden nach der Ko-Transfektion mit 12A Fluc und Kozak Rluc mRNA, entfernen Sie das reduzierte Serummedium aus den Zellen und lyse die Zellen durch Zugabe von 150 Mikroliter nx Lysepuffer aus dem Luciferase-Assay-Kit, das in der Lage ist, zwei Reporter-Assays durchzuführen. Nach der Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur, kratzen Sie die Zellen mit Gummi und sterile Spritze und übertragen Sie in ein Mikrozentrifugenrohr.Um Zellreste zu pellet, zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 30 Mikroliter Überstand pro Brunnen einer undurchsichtigen wandweißen 96 gut weißen Assayplatte mit einem soliden Boden. Verwenden Sie das Luciferase-Assay-Kit und ein Multimode-Plattenleser-Luminometer, um die doppelte Lumineszenz mit der im Manuskript beschriebenen Kinetikfunktion zu messen.Nach dem Export der Lumineszenz-Lesedaten in ein wünschenswertes Dateiformat, bestimmen Sie die relative Translationsrate von 12A Fluc mRNA in nicht infizierten und VACV-infizierten HeLA-Zellen, indem Sie den Fluc-Wert durch den internen Kontroll-Rluc-Wert dividieren. Dieser Test wurde verwendet, um die Translationseffizienz einer Fluc mRNA zu testen, die einen 5'Poly(A)Liter in nicht infizierten und VACV-infizierten Zellen enthält. Sowohl nicht infizierte als auch VACV-infizierte Zellen wurden erfolgreich mit Fluc und Rluc mRNA kotransfiziert.Die Division von Fluc durch Rluc normalisierte die Transfektionseffizienz in der RNA-Stabilität in Zellen. 5'Poly(A)liter mRNA hat einen translationalen Vorteil während der VACV-Infektion im Vergleich zu nicht infizierten Zellen. Dies war nicht auf die Differenztransfektionseffizienz oder mRNA-Stabilität zurückzuführen, da der RNA-Spiegel bei nicht infizierten und VACV-infizierten Zellen fünf Stunden nach der mRNA-Transfektion ähnlich war.Achten Sie bei der Konstruktion von Primern besonders darauf, da dies nicht nur die Effizienz der PCR-Reaktion, sondern auch alle nachgelagerten Prozesse beeinflussen kann, die die verstärkte DNA erfordern. Diese Methode ist ein wichtiger Test, um die Übersetzungsregelung durch Cis-Elemente schnell zu testen. Wenn möglich, sollte diese Methode durch andere ergänzende Experimente bestätigt werden.Vorsicht sollte bei der Verwendung des Vaccinia-Virus getroffen werden und die Exposition gegenüber Chemikalien wie Ethidiumbromid und Phenol vermieden werden.

in-vitro-transcribed-rna-based-luciferase-reporter-assay-to-study

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Methode beschreibt die hochgradige in vitro-Synthese von sowohl kapptem als auch nicht kapptem mRNA aus einem linearisierten Plasmid, das das Gaussia-Luciferase-Gen (GLuc) enthält. Die RNA wird gereinigt, und ein Teil der nicht kappten RNA wird enzymatisch mit dem Vaccinia-Virus-Capping-Enzym kappt. Im letzten Schritt wird die mRNA in HeLa-Zellen transfiziert, und die Kulturüberstände der Zellen werden auf Luciferase-Aktivität untersucht.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung von Virusinfektionen in Mausmodellen mit einem rekombinanten Luciferase- und Fluoreszenzprotein-exprimierenden bi-Reporter-Influenza-A-Virus. Diese Methode ermöglicht sowohl in vivo- als auch ex vivo-Studien, die es den Forschern ermöglichen, Einblicke in die virale Dynamik und die Auswirkungen von Interventionen zu gewinnen.

Ein Luziferase-fluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Verfolgung von Virusinfektionen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen. Nicht infizierte und virusinfizierte Zellen wurden mit mRNAs co-transfiziert, die für Glühwürmchen-Luziferase (Fluc) und Renilla-Luziferase (Rluc) ko-transfizieren, wobei die Fluc-mRNA eine 5'-Poly(A)-Leader-Sequenz enthielt. Nach dem Hinzufügen von biolumineszierenden Substraten zu lysierten Zellen messen Sie das Signal von beiden Luciferasen, um den translationalen Vorteil der Fluc...

Ein Luciferase-Reporter-Assay zur Untersuchung der Translationsregulation in Pockenvirus-infizierten Zellen

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Die Transfektion in die Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 ist aufgrund der natürlichen Reaktion der Zelle auf Fremdmaterialien schwierig. Wir haben hier ein schonendes und dennoch robustes Verfahren zur Transfektion von Luciferase-Reportergenen in RAW264.7-Zellen beschrieben.

Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen

Ein in-vitro- Biolumineszenz-Assay zellulären zirkadianen Rhythmus in Mamma Epithelzellen bestimmen wird vorgestellt. Diese Methode nutzt Säugerzelle Reporter Plasmide destabilisierte Luciferase unter der Kontrolle des Veranstalters Periode 2 gen zum Ausdruck zu bringen. Es kann zu anderen Zelltypen auszuwertende Organ-spezifischen Auswirkungen auf die zirkadianen Rhythmus angepasst werden.

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Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

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Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

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Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

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In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

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