Methodenartikel

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

DOI:

10.3791/59635

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9. August 2019

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Sequenzspezifität ist entscheidend für die Genregulation. Regulatorische Proteine, die bestimmte Sequenzen erkennen, sind wichtig für die Genregulation. Die Definition funktioneller Bindungsstellen für solche Proteine ist ein schwieriges biologisches Problem. Ein iterativer Ansatz zur Identifizierung einer Bindungsstelle für ein RNA-bindendes Protein wird hier beschrieben und ist auf alle RNA-bindenden Proteine anwendbar.

Zusammenfassung

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Die Genregulation spielt in allen Zellen eine wichtige Rolle. Transkriptionale, posttranskriptionelle (oder RNA-Verarbeitung), translationale und posttranslationale Schritte werden verwendet, um bestimmte Gene zu regulieren. Sequenzspezifische Nukleinsäure-bindende Proteine zielen auf spezifische Sequenzen ab, um die räumliche oder zeitliche Genexpression zu steuern. Die Bindungsstellen in Nukleinsäuren sind typischerweise durch Mutationsanalyse gekennzeichnet. Zahlreiche Proteine von Interesse haben jedoch keine bekannte Bindungsstelle für eine solche Charakterisierung. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Identifizierung bisher unbekannter Bindungsstellen für RNA-bindende Proteine. Es beinhaltet iterative Auswahl und Verstärkung von Sequenzen beginnend mit einem randomisierten Sequenzpool. Nach mehreren Runden dieser Schritte-Transkription, Bindung und Verstärkung werden die angereicherten Sequenzen sequenziert, um eine bevorzugte Bindungsstelle(n) zu identifizieren. Der Erfolg dieses Ansatzes wird mit In-vitro-Bindungstests überwacht. Anschließend können in vitro und in vivo funktionelle Assays verwendet werden, um die biologische Relevanz der ausgewählten Sequenzen zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung einer bisher unbekannten Bindungsstelle(n) für jedes RNA-bindende Protein, für das ein Assay zur Trennung proteingebundener und ungebundener RNAs existiert.

Einleitung

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In der Zellbiologie spielt die Genregulation eine zentrale Rolle. In einem oder mehreren Schritten entlang des Genexpressionswegs haben Gene das Potenzial, reguliert zu werden. Diese Schritte umfassen Transkription (Initiierung, Dehnung und Beendigung) sowie Spleißen, Polyadenylierung oder 3' Endbildung, RNA-Export, mRNA-Translation und Zerfall/Lokalisierung von primären Transkripten. In diesen Schritten modulieren Nukleinsäure-bindende Proteine die Genregulation. Die Identifizierung von Bindungsstellen für solche Proteine ist ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der Genkontrolle. Mutationsanalyse und phylogenetischer Sequenzvergleich wurden verwendet, um regulatorische Sequenzen oder Proteinbindungsstellen in Nukleinsäuren wie Promotoren, Spleißstellen, Polyadenylierungselementen und Translationssignalen zu entdecken1, 2 , 3 , 4.

Pre-mRNA Spleißen ist ein integraler Schritt während der Genexpression und -regulation. Die Mehrheit der Säugetiergene, auch die beim Menschen, haben Introns. Ein großer Teil dieser Transkripte wird alternativ gespleißt, wodurch mehrere mRNA- und Protein-Isoformen aus demselben Gen oder Primärtranskript erzeugt werden. Diese Isoformen haben zellspezifische und entwicklungsspezifische Rollen in der Zellbiologie. Die 5' Spleißstelle, der Astpunkt und der Polypyrimidin-Trakt/3' Spleißstelle sind kritische Spleißsignale, die einer Regulierung unterliegen. Bei negativer Regulierung wird eine ansonsten starke Spleißstelle verdrängt, während bei positiver Regulierung eine ansonsten schwache Spleißstelle aktiviert wird. Eine Kombination dieser Ereignisse erzeugt eine Fülle von funktionell unterschiedlichen Isoformen. RNA-bindende Proteine spielen bei diesen alternativen Spleißereignissen eine Schlüsselrolle.

Es sind zahlreiche Proteine bekannt, deren Bindungsstellen oder RNA-Targets noch identifiziert werden müssen5,6. Die Verknüpfung von regulatorischen Proteinen mit ihren nachgelagerten biologischen Zielen oder Sequenzen ist oft ein komplexer Prozess. Für solche Proteine ist die Identifizierung ihrer Ziel-RNA oder Bindungsstelle ein wichtiger Schritt bei der Definition ihrer biologischen Funktionen. Sobald eine Bindungsstelle identifiziert ist, kann sie durch molekulare und biochemische Standardanalysen weiter charakterisiert werden.

Der hier beschriebene Ansatz hat zwei Vorteile. Erstens kann es eine bisher unbekannte Bindungsstelle für ein Protein von Interesse identifizieren. Zweitens besteht ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes darin, dass er gleichzeitig eine Sättigungsmutagenese ermöglicht, die ansonsten arbeitsintensiv wäre, um vergleichbare Informationen über Sequenzanforderungen innerhalb der Bindungsstelle zu erhalten. Somit bietet es ein schnelleres, einfacheres und kostengünstigeres Werkzeug, um Proteinbindungsstellen in der RNA zu identifizieren. Ursprünglich wurde dieser Ansatz (SELEX oder Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) verwendet, um die Bindungsstelle für die Bakteriophagen-T4-DNA-Polymerase (Gen 43-Protein) zu charakterisieren, die sich mit der Ribosom-Bindungsstelle in ihrer eigenen mRNA überlappt. Die Bindungsstelle enthält eine 8-Basis-Loop-Sequenz, die 65.536 randomisierte Varianten für die Analyse7darstellt. Zweitens wurde der Ansatz auch unabhängig verwendet, um zu zeigen, dass spezifische Bindungsstellen oder Aptamer für verschiedene Farbstoffe aus einem Pool von etwa 1013 Sequenzen8ausgewählt werden können. Tatsächlich wurde dieser Ansatz in vielen verschiedenen Kontexten verwendet, um Aptamer (RNA- oder DNA-Sequenzen) für die Bindung zahlreicher Liganden, wie Proteine, kleine Moleküle und Zellen, und für die Katalyse9zu identifizieren. Ein Aptamer kann beispielsweise zwischen zwei Xanthin-Derivaten, Koffein und Theophyllin, unterscheiden, die sich durch das Vorhandensein einer Methylgruppe in Koffein10unterscheiden. Wir haben diesen Ansatz (SELEX oder iterative Selektionsverstärkung) ausgiebig genutzt, um zu untersuchen, wie RNA-bindende Proteine in der Spleiß- oder Spleißverordnung11funktionieren, was die Grundlage für die anschließende Diskussion bilden wird.

Die zufällige Bibliothek: Wir haben eine zufällige Bibliothek mit 31 Nukleotiden verwendet. Die Längenbetrachtung für die zuzufällige Bibliothek beruhte lose auf der Idee, dass der allgemeine Spleißfaktor U2AF65 an eine Sequenz zwischen der Verzweigungspunktsequenz und der 3' Spleißstelle bindet. Im Durchschnitt liegt der Abstand zwischen diesen Spleißsignalen in Metazoen im Bereich von 20 bis 40 Nukleotiden. Ein anderes Protein Sex-lethal war dafür bekannt, sich an eine schlecht charakterisierte regulatorische Sequenz in der Nähe der 3' Spleißstelle seiner Ziel-Pre-mRNA, Transformator, zubinden. Daher wählten wir eine zufällige Region von 31 Nukleotiden, flankiert von Primerbindungsstellen mit Restriktionsenzymstellen, um die PCR-Verstärkung und Anhaftung des T7-RNA-Polymerase-Promotors für die In-vitro-Transkription zu ermöglichen. Die theoretische Bibliotheksgröße oder -komplexität betrug 431 oder ungefähr 1018. Wir verwendeten einen kleinen Bruchteil dieser Bibliothek, um unseren zufälligen RNA-Pool (1012-1015) für die unten beschriebenen Experimente vorzubereiten.

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Protokoll

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ANMERKUNG: Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der wichtigsten Schritte im iterativen Auswahl-Amplifikationsprozess (SELEX).

1. Generierung einer zufälligen Bibliotheksvorlage

  1. Synthetisieren Sie die Vorwärtsgrundierung 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' und die Reverse Primer 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer.
    HINWEIS: Die Primer und die zufällige Bibliothek können kommerziell synthetisiert werden.
  2. Synthetisieren Sie eine zufällige Bibliothek Oligonukleotid Vorlage 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N1... N31)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' durch chemische Synthese. Verwenden Sie ein äquimolares Gemisch aus vier Phosphoramiditen während der Synthese für die 31 randomisierten Positionen, die oben als N dargestellt sind.
    HINWEIS: Die Sequenz der Bibliotheksvorlage enthält 31 zufällige Nukleotide (N1 bis N31) und flankierende Sequenzen zur Bindung der Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung. Die Vorwärtsgrundierung umfasst die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz (unterstrichen) für die In-vitro-Transkription und eine Restriktionsstelle Bcl1 (italicisiert) zum Klonen. Die Reverse Primer enthält Restriktionsenzyme BamH1 und HindIII (italicized), um das Klonen zu erleichtern.

2. Generierung des DNA-Zufallsbibliothekspools

  1. Befestigen Sie den T7-RNA-Polymerase-Promotor an die Bibliothek durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die 1 -M-DNA-Zufallsbibliotheksschablone, 1 M m pro Primer, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 g/L Acetylylierungs-Serumalbumin, 2 Einheiten Taq- /c1> Polymerase und je 200 M dNTPs (Deoxyguanosin, Desoxyadenosin, Desoxycytidin und Desoxythymidintriphosphat).
  2. Verwenden Sie fünf Zyklen denaturier-, glüh- und Verlängerungsschritte (94 °C für 1 min, 53 °C für 1 min und 72 °C für 1 min) PCR gefolgt von einem Verlängerungszyklus (72 °C für 10 min).

3. Synthese von Pool 0 RNA

  1. Richten Sie eine 100-L-Transkriptionsreaktion12ein. Mix T7 Transkriptionspuffer, 1 M zufällige Bibliothekpool-DNA, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM Guanosintriphosphat (GTP), je 1 mM Adenosintriphosphat (ATP), Cytidintriphosphat (CTP) und Uridintriphosphat (UTP) und 2 Einheiten/L-RNA-Polymerase.
    HINWEIS: RNA kann in vitro mit handelsüblichen Kits mit einer Option der T7- oder SP6-RNA-Polymerase transkribiert werden.
  2. Inkubieren Sie das obige Reaktionsgemisch in einem Mikrozentrifugenrohr für 2 h bei 37 °C.
  3. Gel reinigen RNA in einem 10% denaturierenden Polyacrylamid-Gel.
  4. Identifizieren Sie die Position der Transkripte auf dem Gel, indem Sie es mit Methylenblau oder Autoradiographie beflecken, indem Sie Spuren von Radioaktivität (0,5 l oder weniger von32P UTP) in die Transkriptionsreaktion einbeziehen.
    1. Die Gelscheibe in ein Zentrifugenrohr geben und in kleinere Stücke brechen, z.B. mit einer Homogenisatorspitze. Fügen Sie Proteinase K (PK) Puffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% Natriumdodecylsulfat) hinzu, um die Gelstücke einzutauchen. Lassen Sie das Rohr auf einem Nutator von 2 h bis über Nacht bei Raumtemperatur.
  5. Drehen Sie in einer Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge (14.000 U/min oder 16.873 x g) 5 min bei Raumtemperatur, um den Gelabfall zu entfernen und die Pufferlösung wiederherzustellen.
  6. Wirbeln Sie die Probe zweimal mit einem gleichen Volumen von Phenol-Chlor-Form und einmal mit Chloroform.
  7. Mischen Sie die wässrige Phase von oben mit einem Zehntel Volumen Natriumacetat (3,0 M, pH 5,2), 10 g tRNA oder 20 g Glykogen und Ethanol (2–3 Volumen, bei -20 °C gelagert). Lassen Sie die Rohre bei -80 °C für 1 h.
  8. Drehen Sie die Rohre, die die Lösung für 5–10 min bei 4 °C in einer Mikrozentrifuge (14.000 U/min oder 16.873 x g) enthalten. Entsorgen Sie den Überstand sorgfältig. Spülen Sie das RNA-Pellet mit 70% Ethanol und drehen Sie für 2–5 min. Ethanol vorsichtig ansaugen. Das RNA-Pellet an der Luft trocknen.
  9. Löslichkeit des RNA-Pellets in 50 l Wasser, das mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt wird. Lassen Sie die Probe bei -20 °C zur Lagerung.
    HINWEIS: Reinigen Sie die RNA mit handelsüblichen Spinspalten, die derzeit häufiger zur Entfernung von Radioaktivität ohne inkorporierte Sukzessatik verwendet werden und als schnelle und bequemere Alternative zur RNA-Reinigung dienen.
    VORSICHT: Verwenden Sie einen Acrylglasschild, Handschuhe und andere Vorsichtsmaßnahmen, um vor Radioaktivität zu schützen.

4. Proteinbindungsreaktion und Trennung gebundener RNA

  1. Durchführung der Bindung von Protein und RNA in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 in einem Volumen von 100 l, indem Sie diesen Endkonzentrationen folgende Bestandteile hinzufügen: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 g/L Rinderserumalbumin, 0,5 Einheiten/L RNasin, 0,15 g/l tRNA , 1 mM EDTA und 30 L der entsprechenden rekombinanten Proteinkonzentration (PTB). Fügen Sie RNA aus dem entsprechenden Pool hinzu.
    ANMERKUNG: Der Spleißfaktor U2AF65 bindet typischerweise an die Polypyrimidin-Trakt/3' Spleißstellen von Modellintronen mit einer Bindungsaffinität (Gleichgewichtsdissoziationskonstante oder Kd) von etwa 1–10 nM. Daher wurden in den ersten beiden Bindungsrunden die Proteinkonzentration 10-fach über dem Kd für U2AF65verwendet; Für SXL- und PTB-Proteine war die Anfangskonzentration in diesem Bereich nur unsere beste Vermutung. Dies sorgte dafür, dass gewünschte RNA-Arten, die binden konnten, obwohl auch niedrigere Affinitätssequenzen potenziell gebunden wurden. In den Runden 3 und 4 (Transkription, Bindung und Verstärkung) wurde die Proteinkonzentration verdreifacht (Schritt 4.1). Dies wurde getan, um sukzessive Niedrigaffinität RNA-Arten zu beseitigen.
  2. Die Rohre mit den Bindereaktionen ca. 30 min bei 25 °C in einen Temperaturblock (oder auf Eis) legen.
  3. Fraktionieren Sie die gebundene RNA aus der ungebundenen RNA für die ersten 4 Runden der Selektionsverstärkung mit den folgenden Schritten.
    1. Filtern Sie die Probe (100 l) bei Raumtemperatur durch einen Nitrozellulosefilter, der an einem Vakuumkrümmer befestigt ist.
      HINWEIS: Der RNA-Protein-Komplex, aber nicht die ungebundene RNA, verbleibt auf dem Filter.
    2. Schneiden Sie den Filter mit zurückgehaltener RNA in Fragmente mit einer sterilen Rasierklinge; in ein Zentrifugenrohr einlegen. Erholen Sie die RNA, indem Sie die Röhre mindestens 3 h (oder über Nacht) mit Filterstücken, die in den Proteinase-K-Puffer (PK) eingetaucht sind, sanft stürzen.
    3. Deproteinisieren Sie die RNA-Probe, indem Sie sie in Gegenwart eines gleichen Volumens von Phenol-Chloroform (1:1) und dann von Chloroform wirbeln. Stellen Sie die wässrige Phase jedes Mal wieder her, indem Sie die Probe mit hoher Geschwindigkeit für 5 min bei Raumtemperatur zentrieren.
    4. Mischen Sie es mit Natriumacetat (0,1 Volumen von 3,0 M, pH 5,2) und Ethanol (2–3 Volumen absoluter Ethanol, 200 Proof). Lassen Sie das Rohr 30 min in einem -80 °C-Gefrierschrank, zentrifugieren Sie es 10 min lang mit hoher Geschwindigkeit und nach den Wasch- und Trocknungsschritten (Schritt 3.8) die RNA in mit DEPC behandeltem Wasser zu löslich. Diese Schritte sind oben beschrieben (Schritte 3.6 bis 3.9).
  4. Trennen Sie die proteingebundenen RNA-Fraktionen von den ungebundenen Fraktionen für die letzten 2 Runden (Runden 5 und 6; Transkription, Bindung und Verstärkung) wie folgt. Reduzieren Sie die Proteinkonzentration in der Bindungsreaktion (Schritt 4.1) um weiteres Dreifaches für zusätzlichen Selektionsdruck, um hochaffine Bindungssequenzen anzureichern und bevorzugt niedrigaffine Sequenzen zu entfernen.
    1. Vorguss eines nativen Polyacrylamidgels (5% mit 60:1 Acrylamid:bis-Acrylamid-Verhältnis) in 0,5x TBE-Puffer (Tris-Borate-EDTA) vor dem Aufbau der oben genannten RNA:Protein-Bindung (Schritt 4.1) Reaktion. Elektrophorese dieses Gel in einem kalten Raum (4 °C) durch Auftragen 250 V für 15 min.
    2. Pipette die oben genannten RNA:Protein-Bindungsreaktionen (Schritt 4.1) in verschiedene Brunnen dieses Gels.
      HINWEIS: Das Protein wird bei -80 °C gespeichert und vor der Verwendung in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-Ethanesulfonsäure (HEPES), pH 8,0, 20% Glycerin, 0,2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,05% NP-40 und 1 mM Dithiothreitol (DTT) verdünnt. Die Zugabe von 0,5–1,0 mM Proteasehemmer Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) ist optional. In der Bindungsreaktion trägt dieser Puffer etwa 6% Glycerin bei, was eine direkte Beladung von Proben in die Brunnen ermöglicht, ohne sie mit einem separaten Gel-Ladepuffer mischen zu müssen.
    3. Fraktionieren Sie die gebundene RNA aus der ungebundenen RNA mit Gelelektrophorese in einem kalten Raum (4 °C) bei 250 V für 1 bis 2 h. Dieser Prozess wird auch als Gel-Mobilitäts-Shift-Assay bezeichnet.
      HINWEIS: Die Dauer der Elektrophorese variiert je nach Denkcharakter der RNA und des Proteins, die für die Bindung verwendet werden.
    4. Setzen Sie das Gel einem Röntgenfilm aus und identifizieren Sie die Position der gebundenen RNA mithilfe der Autoradiographie. Schneiden Sie die Gelscheibe mit der gebundenen RNA aus und legen Sie sie in eine Röhre ein.
    5. Inkubieren Sie die zerkleinerte Gelscheibe im PK-Puffer, der für die Elution für 3 h oder über Nacht verwendet wird.
    6. Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte 3.5 bis 3.9. Kurz gesagt, wirbeln Sie die eluierte RNA-Probe kräftig zuerst mit Phenol-Chloroform und dann mit Chloroform.
    7. Natriumacetat und Ethanol mit der wässrigen Phase nach Chloroformextraktion vermischen. Nach der Inkubation im Gefrierschrank von -80 °C bei 4 °C für 5–10 min drehen, um das RNA-Pellet zu sammeln. Waschen Sie das RNA-Pellet mit Ethanol und trocknen Sie es an der Luft, indem Sie den Deckel des Rohres offen lassen. Lösen Sie die mit DEPC behandelte RNA in Wasser auf.
      HINWEIS: Der Wechsel zum Gel-Mobilitäts-Shift-Assay zur Fraktionierung ermöglicht die Eliminierung unerwünschter RNA-Arten, die beispielsweise für die Bindung angereichert worden sein könnten, zum Beispiel an den Nitrozellulosefilter hier (oder eine beliebige Matrix), der in den Anfangsrunden für die Fraktionierung verwendet wird.

5. Umgekehrte Transkription und PCR-Verstärkung

  1. Synthetisieren Sie cDNA aus der gelösten RNA mit Reverse-Transkriptase und dem Reverse Primer, indem Sie die 20-L-Reaktion (2 l von 10x RT-Puffer, 2 l AMV-Reverse-Transkriptase, 1 -M-Reverse-Primer, 10-L-RNA, RNase-Inhibitor optional) bei 42 °C für 60 min inkubieren.
  2. Verstärken Sie die cDNA mit 20–25 PCR-Zyklen, wie in Schritt 2.1 beschrieben.

6. Transkription und Proteinbindung

  1. Wiederholen Sie den Prozess der RNA-Synthese, Der Proteinbindung, der Trennung von proteingebundener und ungebundener Fraktion, wie in Abschnitt 3–5 oben beschrieben.

7. Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen

  1. Verwenden Sie den Gel-Mobilitäts-Shift-Assay (Schritt 4.4) oder den Filterbindungstest (Schritt 4.3), um Bindungsaffinität und Spezifität für ausgewählte Pools oder einzelne Sequenzen innerhalb jedes Pools zu bestimmen (siehe Schritt 8.3).
  2. Verwenden Sie Autoradiographie oder einen Phosphor-Imager, um Bänder im gebundenen und ungebundenen Bruch zu erkennen und zu quantifizieren.

8. Klonen und Sequenzieren

  1. Das endgültige PCR-DNA-Produkt mit den Restriktionsenzymen Bcl1 und HindIII für 1-2 h, Ligate mit dem entsprechend verdauten pGEM3 oder anderen Plasmiden, die die Restriktionsstellen von 2 h bis über Nacht transportieren, verdauen, das Ligationsprodukt in kompetente Bakterienzellen umwandeln durch Hitzeschock oder Elektroporation mit standardmolekularen Verfahren13.
  2. Wachsen Sie Bakterien über Nacht, indem Sie die transformierten Zellen auf Agarplatten mit Luria-Bertani (LB) Medium und Ampicillin (50 g/ml) bei 37 °C plattieren. Pflücken Sie Kolonien, um Kulturröhren zu impfen, die LB flüssiges Medium mit Ampicillin enthalten, und wachsen Sie bei 37 °C in einem Schüttelinkubator über Nacht. Reinigen Sie Plasmid-DNAs, die DNA-Einsätze enthalten, mit einem Standard-Plasmid-Isolationsprotokoll13.
    HINWEIS: Kommerzielle Kits sind für die Plasmidreinigung verfügbar.
  3. Sequenzieren Sie die Plasmide mit DNA-Einsätzen mit dem Dideoxy-Kettenbeendigungssequenzierungsprotokoll nach den Anweisungen des Herstellers zur Sequenzierung14.
    HINWEIS: Die Sequenzierung kann im Haus oder kommerziell durchgeführt werden.

9. Sequenzausrichtung

  1. Ausrichten von Sequenzen und Erzielung einer Konsensbindungsseite(en) mithilfe verfügbarer Online-Ausrichtungstools
    (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).

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Ergebnisse

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Die folgenden Beobachtungen zeigen eine erfolgreiche Selektionsverstärkung (SELEX). Zunächst analysierten wir Pool 0 und die ausgewählten Sequenzen zur Bindung an das Protein, das für den iterativen Selektionsamplifikationsansatz verwendet wird. Abbildung 2 zeigt, dass das Säugetier-Polypyrimidin-Trakt-Bindungsprotein (PTB) kaum nachweisbare Bindung an die Pool-0-Sequenz, aber eine hohe Affinität für den ausgewählten Sequenzpool zeigt. Es gab kaum nachweisbar...

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Diskussion

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Nukleinsäurebindende Proteine sind wichtige Regulatoren der Tier- und Pflanzenentwicklung. Eine wesentliche Voraussetzung für das SELEX-Verfahren ist die Entwicklung eines Assays, mit dem proteingebundene und ungebundene RNA-Fraktionen getrennt werden können. Im Prinzip kann dieser Assay ein In-vitro-Bindungstest wie der filterbindende Assay, der Gel-Mobilitäts-Shift-Assay oder ein Matrix-Bindungstest19 für rekombinante Proteine, gereinigte Proteine oder Proteinkomplexe sein. Der Assay kann auch e...

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Offenlegungen

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Der Autor erklärt, dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Autor dankt den National Institutes of Health für die bisherige Finanzierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
GelelektrophoresegeräteStandardStandard Glasplatten
StandardStandard
NitrocelluloseMilliporeHAWP
NitrocelluloseSchleicher & SchuellPROTRAN
Polyacrylamid GellösungenStandardStandard
Proteinase KNEBP8107S
Rekombinante PTBLaborvorbereitungNicht anwendbar
Reverse TranskriptaseNEBM0277S
VakuumverteilerFisher ScientificXX1002500Millipore 25mm Glas Mikroanalytik Vakuum Filter
VakuumVerteiler MilliporeXX27025521225 Probenahme Vakuum Verteiler
RöntgenfilmeStandardStandard

Referenzen

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  1. Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
  2. Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
  3. Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
  4. Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  5. Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
  6. Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  9. Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
  10. Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
  11. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  12. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  14. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  15. Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
  16. Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
  17. Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
  18. Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
  19. Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
  20. Joyce, G. F. Reflections of a Darwinian Engineer. Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).
  21. McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).
  22. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  23. Szeto, K., et al. RAPID-SELEX for RNA aptamers. PLoS One. 8 (12), e82667(2013).
  24. Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201(2014).
  25. Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004(2010).
  26. Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  27. Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223(2015).
  28. Jijakli, K., et al. The in vitro selection world. Methods. 106, 3-13 (2016).

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