Method Article

Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir berichten von der Botal-RNA-Elektroporation (mRNA) als methode, die eine schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine im Wachtel-Embryo-Modellsystem ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen fluoreszierend zu kennzeichnen und ihre In-vivo-Bewegungen durch Zeitraffermikroskopie kurz nach der Elektroporation aufzuzeichnen.

Abstract

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Wir berichten, dass die mRNA-Elektroporation fluoreszierende Proteine ermöglicht, Zellen in lebenden Wachtelembryonen schneller und breiter zu kennzeichnen als DNA-Elektroporation. Die hohe Transfektionseffizienz ermöglicht es, mindestens 4 verschiedene mRNAs mit einer Effizienz von 87 % zu transfizieren. Die meisten elektroporated mRNAs werden während der ersten 2 h Nachelektroporation abgebaut, so dass zeitempfindliche Experimente am sich entwickelnden Embryo durchgeführt werden können. Schließlich beschreiben wir, wie man lebende Embryonen dynamisch mit mRNAs elektropoliert, die verschiedene subzelluläre zielgerichtete fluoreszierende Proteine kodieren.

Introduction

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Elektroporation ist ein physikalisches Transfektionsverfahren, das einen elektrischen Impuls verwendet, um transiente Poren in der Plasmamembran zu erzeugen, wodurch Substanzen wie Nukleinsäuren oder Chemikalien in das Zytosol gelangen können. Elektroporation ist weit verbreitet, um DNA in Bakterien, Hefe, Pflanzen und Säugetierzellen zu liefern1,2,3. Es wird routinemäßig verwendet, um genetische Nutzlasten in Zielzellen und Gewebe innerhalb des sich entwickelnden Aviären Embryos einzuführen, um die genetische Kontrolle der Entwicklung zu untersuchen oder wandernde Populationen der Zellen4,5,6, 7. Allerdings gibt es auch bei der DNA-Elektroporation8mehrere experimentelle Einschränkungen. Zum Beispiel führt die DNA-Elektroporation oft eine sehr variable Anzahl von Expressionsvektoren pro Zelle und anschließend die von ihnen kodierenden mRNAs und Proteine ein. Diese Variabilität kann zu einer erheblichen Zell-Zell-Heterogenität führen, die sowohl die Bildanalyse als auch die Dateninterpretation9,10erschwert. Darüber hinaus beginnen Proteine aus der DNA-Elektroporation erst nach der Elektroporation 3 h auszudrücken und erreichen erst 12 h die maximale Effizienz der Zellzahl und Fluoreszenzintensität, wahrscheinlich aufgrund der Zeit, die für die Übertragung in den Kern und die vollständige Transkription und Übersetzung in vivo11.

Im Gegensatz dazu wurde die mRNA-Transfektion effektiv in einer Vielzahl von Modellsystemen eingesetzt, einschließlich Xenopus laevis Oozyten durch Mikroinjektion12,13, Umprogrammierung menschlicher Stammzellen durch mRNA Lipofectamin-Transfektion14 , und elektroporating widerspenstigen neuronalen Stammzellen bei erwachsenen Mäusen15. Wir testeten die Fähigkeit der mRNA-Elektroporation, Zellen während der frühen aviären embryonalen Entwicklung effizient zu kennzeichnen, indem wir in vitro synthetisierte mRNAs verwenden, die verschiedene fluoreszierende Proteine (FPs) kodieren. Für unsere Studien verwendeten wir den pCS2+-Vektor, einen Mehrzweckexpressionsvektor, der häufig zum Extieren von Proteinen in Xenopus- und Zebrafischembryonen verwendet wird. Die SP6- und T7-RNA-Polymerase-Promotoren im pCS2+ ermöglichen die Synthese von mRNA und Protein aus jedem geklonten Gen, wenn sie in einem In-vitro-Transkriptions-/Translationssystem verwendet werden.

Hier zeigen wir, dass die mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht. Wir haben viele der in diesen Studien verwendeten Expressionsvektoren entwickelt und generiert. Zum Beispiel haben wir das LifeAct-eGFP-Gen16 in den pCS2+ Vektor17 subkloniert, um es vom CMV-Promotor und SP6-Promoter auszudrücken. Das eingefügte Gen liegt flussabwärts des SP6-Promotors und vor dem SV40-Poly(A)-Schwanz18. Bei Embryonen, die mit mRNA und DNA kopodiert wurden, wurden FPs, die aus in vitro transkribierten mRNAs kodiert wurden, erstmals innerhalb von 20 min elektroporation nachgewiesen, während FPs aus DNA-Expressionsvektoren erst nach 3 h nachgewiesen wurden. Membranproteine können gleichzeitig zu einem Embryo elektropoiert werden, was zu einer schnellen und effizienten Expression mehrerer Proteine in einzelnen Zellen führt. Schließlich zeigen wir mit einer In-vivo-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleicharbeiten (FRAP) Assay, dass ein Großteil der elektroporated mRNAs innerhalb von 2 h zerfällt. So macht eine schnelle anfängliche Proteinproduktion in Kombination mit einer begrenzten neuen Proteintranslation die mRNA-Elektroporation zu einer wertvollen Technik, wenn eine zeitliche Kontrolle der Expression notwendig ist.

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Protocol

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Alle tierischen Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Richtlinien des Children es Hospital Los Angeles und des Institutional Animal Care and Use Committees der University of Southern California durchgeführt.

1. Generierung pCS2-basierter Expressionsvektoren

  1. Um pCS2.Lifeact-eGFP zu klonen, bereiten Sie das Vektor-Backbone vor, indem Sie 2 g pCS2.CycB1-GFP (ein Konstrukt, das einen anderen Einsatz enthält) mit BamHI (10 U) und BsrGI (10 U) in einem geeigneten Verdauungspuffer (siehe Materialtabelle) verdaut haben, der in einer Gesamtreaktion auf 1x verdünnt ist. Volumen von 50 l für 1 h bei 37 °C (siehe Abbildung 1 für den Schaltplan des Klonvorgangs).
    1. Dephosphorylieren Sie die freien 3'OH-Enden des Vektorrückgrats aus der Restriktionsenzymreaktion durch Zugabe von Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U). 30 min bei 37 °C inkubieren.
    2. Führen Sie die gesamte Mischung in einem 1% Agarose-Gel/1x Tris Acetat EDTA (TAE) Puffer bei 90 V für ca. 50 min und färben Sie das Gel dann in einer 0,5-mm/ml-Lösung aus Ethidiumbromid in 1x TAE-Puffer für 15 min mit sanfter Schaukelung. Achten Sie außerdem darauf, Molekulargewichtsmarker in einer freien Spur zu laden, um DNA-Größen zu bestimmen.
    3. Mit einem DNA-sicheren UV-Transilluminator, um das Nicken von DNAs zu vermeiden, schneiden Sie das Vektor-Rückgrat (erwartete Bandgröße von 4 kb) schnell aus dem Agarose-Gel und isolieren Sie das DNA-Fragment aus dem Gelstück mit einem Gel-Reinigungskit unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers.
  2. Bereiten Sie den Einsatz gleichzeitig mit Schritt 1.1 vor, indem Sie 2 g pEGFP-N1-Lifeact mit BglII (10 U) und BsrGI (10 U) in einem geeigneten Verdauungspuffer verdauen, der bei einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 l bei 37 °C auf 1x verdünnt wird. Führen Sie die gesamte Mischung in einem 1% Agarose-Gel, um das 800 bp-Band zu isolieren, wie zuvor in Schritt 1.1.2-1.1.3 erläutert.
  3. Nachdem sowohl der Vektor als auch der Insert auf dem Spektralphotometer gereinigt und quantifiziert wurden, kombinieren Sie 50 ng des Vektors und 38 ng des Inserts (1:3 Molar-Verhältnis von Vektor zu Insert) im T4-DNA-Ligase-Puffer, bevor T4-DNA-Ligase hinzugefügt wird, um die Ligationsreaktion zu katalysieren. Richten Sie außerdem ein No-DNA-Steuerelement, ein Nur-Vektor-Steuerelement und ein Nur-Insert-Steuerelement ein. Inkubieren Sie alle Reaktionen bei Raumtemperatur für 30 min.
    1. Verwandeln Sie 1 l des Ligationsgemisches in kompetentes E. coli DH10. Auch transformieren Wasser nur negative Kontrolle und 20 pg pUC19 positive Kontrolle. Bakterien auf Luria Broth (LB) Agarplatten mit 50 g/ml Ampicillin verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    2. Am nächsten Morgen zählen Sie die Kolonien auf jedem Teller.
      HINWEIS: Idealerweise sollte es keine Kolonien auf den negativen Kontrollplatten, >100 Kolonien auf den vektor+insert Ligationsplatten und weniger Kolonien auf der reinen Vektorplatte geben.
    3. Wählen Sie mindestens 8 Bakterienkolonien aus der Agarplatte, die mit dem Vector+Insert-Ligationsgemisch transformiert wurden, und impfen Sie sie mit sterilen Zahnstochern oder Pipettenspitzen in 2 ml flüssige LB-Brühe mit 50 g/ml Ampicillin.
    4. Extrahieren Sie DNA aus jedem der Klone mit kommerziellen Plasmid Miniprep Kits.
    5. Führen Sie einen diagnostischen Restriktionsdigest mit 500 ng DNA aus jedem Klon mit NotI (10 U) und BamHI (10 U) im entsprechenden Verdauungspuffer aus, der bei 37 °C auf 1x für 1 h verdünnt wird, und führen Sie die verdaute DNA auf einem 1% Agarose-Gel im 1x TAE-Puffer aus. Erwartete Bandgrößen für pCS2.Lifeact-eGFP positive Klone sind 3,9 kb und 978 bp.
    6. Verwandeln Sie 1 pg-100 ng DNA aus dem positiven Klon in kompetente E. coli DH10, und bereiten Sie 3-4 Miniprep-Reaktionen vor, wie in den vorherigen Schritten beschrieben, um eine ausreichende Menge an DNA für die In-vitro-Transkriptionsreaktion zu erhalten (mindestens 10 g).

2. Vorbereitung von mRNA durch In-Vitro-Transkription

  1. Linearisieren Sie 10 g pCS2.LifeAct-eGFP am 3'-Ende des Einsatzes mit NotI (10 U) in einem geeigneten Verdauungspuffer, der über Nacht bei einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 l bei 37 °C auf 1x verdünnt wird.
    HINWEIS: Um eine RNase-Kontamination zu verhindern und den mRNA-Abbau zu reduzieren, tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit mRNA-Proben.
  2. Reinigen Sie die DNA mit einer Mischung aus Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1, v/v).
    1. Fügen Sie 150 l RNase-freies Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen der Verdauungsreaktion gleich 200 l zu machen. Dann fügen Sie 200 l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und Wirbel das Gemisch für 20 s.
    2. Zentrifuge in einer Mikrofuge mit maximaler Geschwindigkeit (18.400 x g) für 2 min. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase, die die linearisierte DNA enthält. Wiederholen Sie diesen Schritt, um zusätzliche Verunreinigungen zu entfernen und achten Sie darauf, den weißen Niederschlag, der sich zwischen der unteren und oberen Flüssigphase bilden kann, nicht zu stören.
  3. Niederschlagen Sie linearisierte DNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3M Natriumacetat (RNase-frei) und 2,5 Volumen von 100% Ethanol. Lassen Sie die Mischung bei -20 °C für >30 min, dann pellet die DNA durch Zentrifugieren mit maximaler Geschwindigkeit (18.400 x g).
    1. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 70% Ethanol, dann trocknen Sie das Pellet für >5 min.
    2. Lösen Sie das DNA-Pellet in 5 l RNase-freiem Wasser auf. Quantifizieren Sie die DNA per Spektralphotometer.
      HINWEIS: Die erwartete DNA-Konzentration liegt bei einem A260/A280-Verhältnis zwischen 1,7 und 2,0 bei 0,5-1 g/l.
  4. Verwenden Sie 1 g der linearisierten pCS2.LifeAct-eGFP-DNA für die In-vitro-Transkription (IVT). Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers im kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle), um 10 l Cap Analog (Endkonzentration 0,8 mM) und NPS (Endkonzentration 1 mM für ATP, CTP und TTP; 0,2 mM für GTP), 2 l 10x Reaktionspuffer (Endkonzentration) 1x), 2 l SP6-RNA-Polymerase und RNase-freies Wasser bis zu 20 l.
    1. Inkubieren Sie die IVT-Mischung für etwa 2 h oder länger, abhängig von der Transkriptgröße.
      HINWEIS: 2 h Inkubation funktioniert gut für eine 3 kb Transkript, aber über Nacht Inkubation funktioniert besser für Transkripte, die größer als 5 kb sind.
    2. Um freie Nukleotide aus der Transkriptionsreaktion zu entfernen, fügen Sie 30 L LiCl-RNA-Ausfälllösung (7,5 M Lithiumchlorid, 50 mM EDTA) hinzu, um die mRNA auszufällen. Die Mischung kurz vorrücken und 30 min bei -20 °C lagern. die mRNA 15 min in einer Mikrofuge mit maximaler Geschwindigkeit (18.400 x g)nach unten drehen und mit 70% Ethanol (RNase-frei) abspülen.
  5. Lösen Sie die synthetisierte mRNA in 15 l RNase-freiem Wasser auf. Geben Sie die synthetisierte mRNA bei 5 l/Tube (3 Röhren insgesamt) und legen Sie sie bei -80 °C für eine Langzeitlagerung. Quantitieren Sie die mRNA mit einem Spektralphotometer.
    HINWEIS: Die erwartete Ausbeute liegt bei 15-20 g mRNA (ca. 1 g/l). 1 l (1 g/l) ist ausreichend für ein Experiment mit 10 Embryonen, vorausgesetzt, dass die mRNA von 1 g/l auf 500 ng/l verdünnt wird und dass jeder Embryo mit 200 nL injiziert wird. Jedes Rohr sollte daher genügend mRNA für 5 Experimente enthalten.
  6. Führen Sie 300 ng mRNA auf einem 1% Agarose-Gel in 1x TAE-Puffer nach der Reinigung aller Gel-Geräte mit der RNase-Dekontaminationslösung (z.B. RNase Away) aus und stellen Sie sicher, dass die mRNA als ein Band erscheint (mehrere Bänder können vorhanden sein, wenn sich sekundäre Strukturen bilden) ppears in der Gelspur, was auf den RNA-Abbau hinweist.

3. Vorbereitung des mRNA Elektroporationsmixes

  1. Die mRNA in der gewünschten Konzentration auftauen und verdünnen (250-500 ng/l in RNase-freiem Wasser funktioniert gut für alle in dieser Arbeit getesteten mRNAs). Fügen Sie 1/10 Volumen farbigen Farbstoffs hinzu (siehe Tabelle der Materialien, RNAse-freie, 0,1% Endkonzentration), um die mRNA-Injektionsstelle zu visualisieren und die Elektroden richtig zu platzieren.
    HINWEIS:     Wenn DNA und RNA zu einer Co-Elektroporation kombiniert werden, stellen Sie sicher, dass DNA frei von Verunreinigungen von RNasen ist, indem Sie Phenol-Chlor-Extraktion und Ethanol-Ausfällung vor mRNA und DNA-Gemisch verwenden.
    1. Achten Sie darauf, eine negative Kontrolle mit einer Mock (keine RNA hinzugefügt) Elektroporationslösung vorzubereiten. Wenn möglich, bereiten Sie eine positive Kontrolle mit vorvalidierter mRNA vor (mRNA, die in früheren Experimenten nachweislich erfolgreich FP produziert hat).
      HINWEIS: Die negative Kontrolle ist für alle bildgebenden Experimente unerlässlich, um Hintergrundfluoreszenzniveaus für die Normalisierung der Daten zu bestimmen. Die positiv-kontrollierte ist besonders wichtig bei der Arbeit mit neu transkribierten mRNA, indem sie bestätigt, dass die Elektroporationseinstellungen funktioniert haben.
  2. Bewahren Sie die mRNA-Elektroporationslösung auf einer Eisschlämme auf, um einen Abbau zu verhindern, bis sie bereit ist, mit der Elektroporation fortzufahren.

4. Elektroporate mRNAs in lebende Wachtelembryonen

  1. Sammeln Sie täglich frisch gelegte befruchtete Wachteleier und lagern Sie bei 13 °C nicht länger als 1 Woche in einem befeuchteten Kühlschrank. Die Wachteleier bei 38 °C bis zu den gewünschten embryonalen Entwicklungsstadien19,20,21bebrüten.
    HINWEIS: HH3 bis HH5 wurden in dieser Studie sowohl für statische als auch für dynamische Bildgebung verwendet. Bei HH3-Embryonen erleichtert das Verlassen der Eier bei Raumtemperatur für 2 h vor der Ernte den Isolationsprozess erheblich, da die Embryonen bei abgekühlter Zeit im Allgemeinen widerstandsfähiger gegen physikalische Manipulationen sind.
  2. Isolieren und vorbereiten Embryonen nach dem EG-Kultursystem22. Sammeln Sie mindestens 5 Embryonen pro Zustand, einschließlich mindestens einer, um als negative Kontrolle zu dienen (nicht elektroporated).
    1. Das Ei vorsichtig brechen und in eine 10 cm Petrischale gießen. Entfernen Sie den Großteil des dicken Albumins mit einer Transferpipette und entfernen Sie das verbleibende dicke Albumin um den Embryo, indem Sie die Oberfläche des Dotters mit einem Gewebetuch sanft abwischen, um sicherzustellen, dass der Embryo fest am Papierring haftet.
    2. Vorgeschnittenes Filterpapier (siehe Materialtabelle)auf den Embryo legen und mit einer Schere den Umfang des Embryos glatt schneiden.
    3. Verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um den Embryo mit PBS zu unterlegen, mit sanften Strömen, um jedes Dotter zu räumen, das am Embryo klebt.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist bei der Arbeit mit jüngeren (
    4. Ziehen Sie den Embryo/Papierring in einem schrägen Winkel langsam nach oben und vom Eigelb in eine mit PBS gefüllte Petrischale zur weiteren Reinigung. Sobald der größte Teil des Dotters entfernt wurde, legen Sie die embryoventrale Seite auf eine 35 mm Petrischale, die mit einer halbfesten Mischung aus Agar/Albumen bedeckt ist.
  3. Bereiten Sie sechs bis acht 10 cm lange Glasmikrokapillaren (O.D. = 1,2 mm) mit einem Glas-Mikropipette-Ziehinstrument vor.
  4. Legen Sie die embryoventrale Seite in die mit PBS gefüllte Elektroporationskammer. Mit hilfe einer Glasmikrokapillare einen Bolus von 200 nL der mRNA- oder DNA/mRNA-Elektroporation in den Hohlraum zwischen Epiblast und Vitelline-Membran, die die gewünschte Region abdeckt, injizieren.
    HINWEIS: Der gesamte vordere Bereich für Pellucida und einige Flächen für Opaca wurden in den meisten Experimenten in diesem Manuskript elektropoiert.
  5. Die positiven und negativen Elektroden (Platin-Flachquadratelektrode; Seitenlänge 5 mm) auf die Ober- bzw. Unterseite des Embryos legen und mit der folgenden Pulssequenz elektroporat machen: fünf quadratische elektrische Impulse von 5 V, 50 ms Dauer mit 100 ms Intervallen mit einem In-vivo-Elektroporator. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den Elektroden 5 mm beträgt.
    HINWEIS: Die Optimierung der Elektroporationsparameter ist entscheidend, um Bedingungen zu vermeiden, die die zerbrechlichen embryonalen Zellen abtöten können. Für verschiedene Elektroporationsgeräte sollten Parameter von Spannung, Pulslänge, Pulsintervallen und der Anzahl der Impulse für DNA und mRNA berücksichtigt werden.
  6. Inkubieren Sie die elektropoierten Embryonen bei 38 °C bis zum gewünschten Entwicklungsstadium.
    HINWEIS: Ein fluoreszierendes SezierendesSteroskop (siehe Materialtabelle) hilft beim Screenen transfizierter vs. nicht transfizierter Embryonen.
  7. Sollen die Embryonen statisch abgebildet werden, fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd in PBS für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
    1. Entfernen Sie die Embryonen aus der Vitelline-Membran, indem Sie den Umfang des Filterpapiers mit einer Schere glatt umschneiden und die glänzende Membran auf der rückenden Oberfläche mit scharfen Zangen sanft abschälen.
    2. Waschen Sie die festen Embryonen in PBS/Triton (0,1%) 2x für 5 min und auf Wunsch mit In-situ-Hybridisierung oder Immunfärbung fortfahren.
    3. Schließlich färben Sie den Embryo in 0,5 g/l DAPI in PBS/Triton (0,1%) mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie Embryonen in PBS/Triton 2x für 5 min und löschen Sie den Embryo in SCALE-U2 Lösung23 über Nacht.
  8. Um die Effizienz der Elektroporation zu analysieren (siehe Abbildung 2), verwenden Sie das Binär- und Partikelanalysetool und den DAPI-Kanal auf ImageJ, um kerntechnische Umrisse aus allen Zellen im Bild zu erhalten.
    1. Um das binäre Tool auf ImageJ zu verwenden, verwenden Sie ein einzelnes Z-Slice im DAPI-Kanal, das die Mehrheit der Zellen enthält, und klicken Sie auf Prozess > Binär > Binär erstellen. Um Zellen in der Nähe zu trennen, klicken Sie auf Verarbeiten > Binär > Einzugsgebiet. Abrufen von Zellumrissen durch Klicken auf Analysieren > Partikel analysieren, Größeauf 100-500 festgelegt .
    2. Stellen Sie sicher, dass ein Großteil der Zellen im DAPI-Kanal umrissen ist, und speichern Sie die Zellumrisse, indem Sie im Popupfenster des ROI-Managers auf Weitere > Speichern klicken.
    3. Verwenden Sie diese Umrisse, um Fluoreszenzintensitätswerte für den mRNA- und DNA-Kanal zu erhalten, indem Sie die zuvor gespeicherte Datei auf einem einzelnen Z-Slice im mRNA- oder DNA-Kanal öffnen und dann auf Messen im ROI-Manager klicken.
    4. Filtern Sie schließlich diese Intensitätswerte und zählen Sie Zellen mit <6.000 Fluoreszenzintensität als nicht transfiziert und Zellen mit >6.000 Fluoreszenzintensität als transfiziert.

5. Bild-FPs, die von elektroporated mRNAs kodiert werden

  1. Wählen Sie den gesündesten und besten elektroporated Embryo für die dynamischen bildgebenden Experimente nach der Betrachtung aller elektroporated Embryonen unter dem fluoreszierenden sezierenden Stereoskop.
    1. Bebrüte die anderen elektroporated Embryonen und den nicht-elektropoierten Embryo (die negative Kontrolle) in einem separaten Inkubator weiter, während der ausgewählte Embryo für den Fall, dass dieser Embryo während des Experiments stirbt, die Abbildung des ausgewählten Embryos abbildet.
  2. Für die dynamische Bildgebung verwenden Sie die gesamte Geflügel-Embryokultur, wie zuvor beschrieben24,25,26 mit einem invertierten konfokalen Mikroskop.
    HINWEIS:     Das Mikroskop ist mit einem Inkubator auf der Bühne ausgestattet (siehe Materialtabelle), der die Temperatur während der Bildgebung bei 36 °C hält. Während des Mikroskopaufbaus wurde beobachtet, dass Embryonen, die bei 36 °C inkubiert werden, länger überleben als bei höheren Temperaturen, möglicherweise weil der Laser eine lokale Erwärmung des Embryos verursachen kann. Leser sollten die optimale Inkubationstemperatur auf der Bühne für ihren eigenen Mikroskopaufbau bestimmen.
    1. Um die Embryogenese dynamisch abzubilden und zu visualisieren, reinigen Sie den elektroporated embryo nirgends mit PBS, um Blasen zu entfernen, die sich auf der Rückenseite des Embryos während des Elektroporationsprozesses bilden können, indem Sie den Embryo mit Zangen in einem PBS-Sauberen bewegen. lösung.
    2. Legen Sie den sauberen Embryo direkt auf eine bildgebende Schale, die eine dünne Schicht Von Albumen-Agar enthält ( 150 L), um sicherzustellen, dass keine Blasen auf der dorsalen Oberfläche des Embryoserzeugt werden 22.
    3. Um das Überleben der Langzeitbildgebung zu gewährleisten, fügen Sie an den Innenrändern der Bildform ein kleines feuchtes aufgerolltes Stück Tissuepapier hinzu und versiegeln Sie die Schale mit Paraffinfolie, um die Verdunstung während der Bildgebung und Inkubation zu minimieren.
    4. Bewegen Sie diese Schale schnell in das vorgewärmte Stadium eines konfokalen Mikroskops und lokalisieren Sie den farbigen Farbstoff im Embryo mithilfe des Hellfeldkanals (PMT-Laser 20%), der den injizierten und elektropolierten Bereich identifiziert.
  3. Stellen Sie die Bildgebungssoftware auf das gewünschte Ziel (10 oder 20x), den dichroitischen Spiegel (488 nm für GFP nm, 561 für RFP), Emissionsspektren (499-562 nm für GFP, 570-695 nm für RFP) und schalten Sie einen geeigneten Laser ein (488 nm für GFP, 561 nm für RFP).
    HINWEIS:     Elektroporated mRNA wurde in Proteine übersetzt, die innerhalb von 20 min gesehen wurden (siehe Abbildung 3). Die bildgebenden Metadaten, die für die meisten Bilder in diesem Dokument verwendet wurden, waren: ein invertiertes konfokales Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv (siehe Tabelle der Materialien); Pixelverweilzeit, 1,5 s; Mittelwert von 4-Linien-Scans.
    1. Klicken Sie auf Live auf die Bildgebungssoftware und passen Sie die Laserleistung an eine Einstellung an, die für die Fluoreszenzintensität je nach Mikroskoplaserleistung geeignet ist. Beginnen Sie mit der Abbildung des Embryos mit 1% Laserleistung, 800 Verstärkung, und erhöhen Sie die Laserleistung langsam um 1% erhöht, bis gesättigte Pixel gesehen werden.
    2. Folgen Sie diesem, indem Sie die Laserleistung leicht verringern, bis keine gesättigten Pixel mehr zu sehen sind.
      HINWEIS: Die Laserleistung, die für den Beginn einer bildgebenden Sitzung eines Embryos gewählt wurde, kann für frühere Zeitpunkte gut sein, aber zu späteren Zeitpunkten nicht ideal, wenn die Fluoreszenz der Zellen im Laufe der Zeit viel heller oder dunkler wird. Um dies zu beheben, stellen Sie den Embryo zunächst mit etwas niedrigeren Leistungseinstellungen ab, da die elektropoierten Zellen in der Regel in den ersten 6 Stunden nach der Elektroporation heller werden (siehe Abbildung 3A-E zur Quantifizierung der Signalerhöhung). Wenn die späteren Bilder gesättigt sind, fahren Sie mit den ursprünglichen Bildeinstellungen fort, nehmen Sie jedoch unmittelbar danach ein zusätzliches Bild mit schwächeren Bildeinstellungen (kleineres Loch oder schwächere Laserleistung) auf.
    3. Stellen Sie den Embryo alle 3-5 min ab, um die individuelle Zellmigration über verschiedene Zeitpunkte hinweg zu verfolgen. Für diese Arbeit waren die Bilder Z-Stacks (ca. 50 m dick) des gesamten elektropolierten Bereichs, plus etwas mehr Platz zum Boden des Z-Stacks, falls der Embryo während der gesamten Bildgebungssitzung in das Agarosebett sinkt.
    4. Beobachten Sie, wie schnell sich die Zellen bewegen, indem Sie die ersten Zeitpunkte des ersten Films überprüfen. Wenn sich die Zellen mit einer schnellen Geschwindigkeit bewegen (d. h., dass sie den Bereich des abgebildeten Bereichs innerhalb von ein paar weiteren Zeitpunkten verlassen), sollten Sie den Zoom des abgebildeten Bereichs (1x x 0,8x) erweitern oder einen anderen Bereich abbilden.
      HINWEIS: Embryonale Regionen in der Gegend pellucida bewegen sich viel schneller als die in der Gegend Opaca. Darüber hinaus enthalten jüngere Embryonen (HH3, HH5) oft Zellen, die sich im Vergleich zu älteren Embryonen (>HH7) schneller bewegen.
    5. Nach der Abbildung der elektropolierten Region des Embryos, Bild eine nicht-elektroporated Region des gleichen Embryos, um Autofluoreszenz-Spiegel zu bestimmen (sollte minimal sein, wenn niedrige Laserleistung <10% verwendet wird, um den Embryo abbilden).

6. Fluoreszenz-Rückgewinnung nach Photobleaching (FRAP) zu Assay mRNA Integrity

HINWEIS: Eine In-vivo-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleichung (FRAP) kann verwendet werden, um zu bestimmen, wie lange transfizierte mRNA in FPs übersetzt werden könnte. Das folgende Protokoll beschreibt ein FRAP-Experiment, um die Halbwertszeit von H2B zu erkennen. Citrin mRNA in einem elektroporated Embryo.

  1. Führen Sie FRAP-Experimente am invertierten konfokalen Mikroskop mit einem 20x 0,8 NA Objektiv und einem völlig offenen Loch durch.
    1. Nach Bestätigung der Elektroporation von H2B-Citrin auf dem Stereomikroskop und Einstellung des Embryos auf der vorgewärmten Stufe auf dem invertierten konfokalen Mikroskop (siehe Schritt 5.2.4), photobleicht die meisten der zellulären Fluoreszenz aus H2B-Citrin zu einem gewissen Zeitpunkt (45 min, 2 h und 5 h Nachelektroporation) mit dem 405 nm Laser mit 70% Laserleistung, 100 Iterationen, Scangeschwindigkeit 4, wodurch nur 5% der Fluoreszenz übrig bleibt.
      HINWEIS: Dieser Vorgang sollte einige Minuten dauern.
    2. Die Embryonen auf der Bühne nach dem Photobleichen bei 36 °C weiter bebrüten.
  2. Achten Sie darauf, aktiv Zell innerhalb der photobleached Region zu teilen, die darauf hinweisen, dass die photobleached Zellen nicht vollständig nach der Behandlung gestorben sind.
  3. Erfassen Sie Postbleichbilder (Z-Stacks des elektropolierten Bereichs) in regelmäßigen Zeitabständen (3 oder 5 min) für bis zu 30 min mit dem konfokalen Mikroskop.
    HINWEIS: Falls verfügbar, verwenden Sie eine transgene H2B-XFP-Linie als positiv zur Sicherstellung des Zellüberlebens in der photogebinierten Region. Die Rate der Fluoreszenzrückgewinnung für das fp, das von der elektroporated mRNA kodiert wird, sollte abnehmen, aber die für das FP- kodierte über Transgene sollte während des gesamten Films konsistent bleiben.
  4. Um sicherzustellen, dass die bildgebenden Bedingungen das Überleben von Embryonen nicht schädlich beeinflussen, gleichzeitig elektroporated Embryonen inkubieren, die nicht photobleached sind, was als Kontrolle für die Bildgebung dienen kann.
  5. Um die Photobleichergebnisse für den mRNA-Zerfall nach der Elektroporation zu quantifizieren, verfolgen Sie die Zellfluoreszenz im Laufe der Zeit (3 oder 5 min), indem Sie die Fluoreszenzintensität des Zentrums (ein Kreis von 7,5 m) jeder Zelle mit ImageJ messen. Messen Sie dies für alle Zellen innerhalb der photobleached Region, die nicht an Mitose leiden und vollständig photobleached wurden.
    HINWEIS: Erwägen Sie, die mitotischen Zellen aus der Quantifizierung zu lassen, da mitotische Kerne aufgrund der Chromatinkondensation eine stärkere Fluoreszenz haben als Interphasenkerne.
  6. Plotten Sie die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit nach der Bleiche an einer Vielzahl von Zeitpunkten (45 min, 2 h und 5 h).

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Results

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mRNA-Elektroporation ist effizienter als DNA-Elektroporation

Wir haben pCS2+ verwendet. H2B-Citrin zur Herstellung von in vitro transkribierter mRNA. Da die DNA-Elektroporation in der Regel bei 1-2 g/l durchgeführt wird, verwendeten wir eine äquimolare Konzentration von mRNA (berechnet auf etwa 0,25-0,5 g/l für H2B-Citrine) für die mRNA-Elektroporation. Wir haben zuerst die Elektroporationseffizienz von pCS2+ ge...

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Discussion

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In diesem Protokoll haben wir Schritt für Schritt Anleitungen gegeben, wie man mRNA präzise in die Zellen von gastrulating quail embryos injizieren und elektroporate. Wir haben gezeigt, dass in vitro synthetisierte mRNA-Elektroporation eine schnelle und effiziente Expression fluoreszierender Proteine (FPs) in gastrulating quail embryos ermöglicht (Abbildung 2 und 3). Fluoreszenz aus H2B-Citrin-Protein, das aus elektroporated mRNAs übersetzt wurde, konnte durch konfokale Mikr...

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

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Wir danken David Huss für die hilfreichen Einblicke in diese Arbeit. Diese Arbeit wurde teilweise durch das Rose Hills Foundation Summer Research Fellowship (2016-2018) und das USC Provost es Undergrad Research Fellowship an M.T., das Saban Research Institute Intramural Training Pre-Doctoral Award an M.D. und die University of Southern California Undergraduate Research Associates Program Award an R.L.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
Phenol:Chloroform:IsoamylalkoholThermo Fisher
SP6 mMessage In-vitro-TranskriptionskitThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylenglykol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol tert-octylphenylether
DAPISigma AldrichD95422-(4-Amidinophenyl)-6-indolcarbamidindihydrochlorid, 4′,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid, DAPI dihydrochlorid
Whatman No.1 FilterpapierSigma AldrichWHA1001125
GlycerinSigma AldrichG9012
HarnstoffSigma Aldrich51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi war ein Geschenk von Dorus Gadella (Addgene Plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. Methoden 2008;5:605-7. PubMed-ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneDieses Paper
pCS.H2B-citrinAddgene53752pCS-H2B-citrine war ein Geschenk von Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene#53750pCS-memb-mCherry war ein Geschenk von Sean Megason (Addgene Plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 Inverses MikroskopCarl Zeiss Microscopy GmbHDas LSM-780 ist ein Konfokal- und Multiphotonenmikroskop, das die Empfindlichkeit bietet, die für wichtige Bildgebungsarbeiten erforderlich ist. Ausgestattet mit einem motorisierten Tisch, einem Autofokus-Gerät und einem Volltisch-Verdunkelungsinkubator ist das 780 ein hervorragendes Mikroskop für die High-End-Bildgebung von lebenden Zellen/Embryonen. Der hochempfindliche 32-Kanal-Quasar-Detektor ermöglicht spektrale Bildgebung, lineare Entmischung und Bildaufnahme mit hoher Farbzahl (>4). Die Anregung kann mit 6-Linien-Einzelphotonenlasern (405, 458, 488, 514, 564 und 633 nm), Chamäleon-2-Photonen-Lasern (kohärent) (Bereich von 690 nm bis 1000 nm) durchgeführt und mit der Systemsoftware ZEN 2011 SP7 (Schwarz) ausgeführt werden.
CUY-21 EDIT In-vivo-ElektroporatorBex Co., Ltd.
Platin-Flach-Vierkantelektrode, Seitenlänge 5 mmBex Co., Ltd.
Olympus MVX10 FL StereomikroskopOlympus LifeScience
XM10 MonochromkameraOlympus LifeScience
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) für HCR (10-fach, pH 7,4) Zur Herstellung von 1 l einer 10-fachen Stammlösung kombinieren Sie 80 g NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11,4 g Na2HPO4 (wasserfrei; Sigma-Aldrich S3264) und 2,7 g KH2PO4 (wasserfrei; Sigma-Aldrich P9791). Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein und bringen Sie das Endvolumen mit ultrareinem H2O auf 1 l. Vermeiden Sie die Verwendung von CaCl2 und MgCl2 in PBS für HCR. Es ist wichtig, dass das PBS für HCR als RNase-freie Lösung hergestellt wird (z. B. durch Diethylpyrocarbonat [DEPC]-Behandlung).
1,37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/TritonAddieren Sie 1 mL Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) und 100 mL 10&fach; PBS auf 890 mL hochreines destilliertes H2O. Filtrieren Sie die Lösung durch ein 0,2 μm m Filter und lagern Sie ihn bei 4 ? C bis zum Gebrauch.
1-fache phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (DEPC-behandelt; pH 7,4)
0,1% Triton X-100
15593031LF701P5E

References

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