Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Immunohistochemistry (IHC) ist eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung spezifischer Proteine und zellulärer Strukturen in Geweben in situ^1,2,3. Ungeeignete Fixierungsmethoden und suboptimale Schnitte komplexer Gewebe können die Gewebestruktur stören, eine hohe Hintergrundfärbung erzeugen oder Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verringern, was zu Färbeartefakten und daraus resultierender Fehlinterpretation von IHC-Daten⁴. Da die Netzhaut des Wirbeltiers ein komplexes und hochorganisiertes neuronales Organ ist, das aus Schichten miteinander verbundener Photorezeptoren, Interneuroner und Ganglienzellen besteht, ist es sehr zerbrechlich und kann leicht während der Zerlegung und Schnitte gestört werden. Ein detailliertes, standardisiertes und validiertes Protokoll von der Mausaugensektion und -orientierung bis zur Immunfärbung wird dazu beitragen, IHC-Artefakte deutlich zu reduzieren, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht und genauere Vergleichsdaten möglich sind. analyse.

Es gibt viele Protokolle für die Gewebevorbereitung für IHC, jedoch sind nicht alle für Netzhautgewebe geeignet. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouin-Lösung bewahren die Netzhautstruktur während der Zerlegung und Schnittung⁵. Leider führen starke Fixative oft zur verstärkten Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung aufgrund der chemischen Modifikation von Epitopen⁶. Auf der anderen Seite können mildere Fixative, wie 4% Paraformaldehyd (PFA), einige dieser Artefakte lindern, erfordern aber eine sorgfältige Zerlegung und Schnitte, um die optimale Netzhautstruktur zu erhalten. PFA dringt schnell in Gewebe ein, aber Kreuz-Links-Proteine sehr langsam, wodurch das Risiko der Epitopmaskierung reduziert wird. Da die PFA-Inkubation in kurzer Zeit eine relativ milde Fixierung ist, benötigen Gewebe oft schnelles Einfrieren, um Antigene zu erhalten. Es ist wichtig, die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren des Gewebes zu vermeiden, da sie die Integrität von Zellen und Geweben verzerren und schädigen⁷.

Hier beschreiben wir detaillierte und standardisierte Protokolle für Sezieren, Fixierung und Kryoschutz von Maus-Okularbechern, die konsistente und zuverlässige IHC-Daten liefern.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt, der vom Institut für Labortierressourcen zur Verfügung gestellt wurde, und wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania.

Alle Werkzeuge und Geräte für die Methoden sind in Abbildung 1 dargestellt und in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

1 . Mausaugenenukleation, Augenbechersezieren und Einbetten

1. Euthanisieren Sie Mäuse mitKohlendioxid (CO2 ), gefolgt von enthaupteten (postnatale Mäuse P0 - P11) oder zervikale Dislokation (Erwachsene >P11 Mäuse). Bei P0-P14-Mäusen sind die Augen von Haut bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Haut vor den nachfolgenden Schritten entfernt wird.
2. Markieren Sie den zeitlichen Teil des Auges (Abbildung 2A), indem Sie die Hornhaut leicht mit einem Schwanzkauterisierer verbrennen. Vermeiden Sie es, ein Loch in der Hornhaut zu verbrennen, indem Sie die Hornhaut sehr leicht und für nicht mehr als eine Sekunde mit dem Kauterizer berühren.
3. Entführen Sie sofort Mausaugen mit gebogenen Dumont #5/45 Zangen. 15 min in einem 1,5 ml Kryoröhrenrohr mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salin (PBS) auf Eis inkubieren.
4. Nach 15 min in 4% PFA das fixierte Auge mit den gekrümmten Zangen Dumont #5/45 auf eine modifizierte 35 mm Sezierschale (siehe Materialtabelle und Abbildung 1C) mit PBS gefüllt und unter sezierendes Mikroskop platzieren.
5. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Brennzeichen, senkrecht zu und knapp über dem Limbus (Grenze der Hornhaut) mit dem Mikromesser.
6. Setzen Sie die gekrümmte Schere in den Schnitt ein und führen Sie einen Umfangsschnitt der Hornhaut nach dem Limbus durch (Abbildung 2B).
7. Entfernen Sie die Hornhaut und extrahieren Sie die Linse mit einem dünnen Dumont #5 Zange , (Abbildung 2B) und heben Sie es zart weg von der hinteren Teil des Auges. Der Glaskörper, das klare Gel, das den Raum zwischen der Linse und der Netzhaut füllt, wird mit der Linse herauskommen (Abbildung 2B) und die Netzhaut wird als weiße Oberfläche sichtbar sein, die die Innenseite der hinteren Augentasse bedeckt. Stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Schäden an der Netzhaut, wie Löcher oder Risse (Abbildung 2C) vorhanden sind.
8. Waschen Sie die Augenbecher zweimal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
9. Kryoschützen Sie die Augenbecher, indem Sie sie in einer Lösung von 15% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C ausgrenzen, bis die Augentasse sinkt
10. Übertragen Sie die Augenbecher auf 30% Saccharose in PBS für 2-3 h, bis die Augentasse sinkt.
11. Die Augenmuscheln in OCT in 10 x 10 mm Kryomolden einbetten (Abbildung 3A). Mit einem Sezieren Mikroskop, orientieren Sie das Auge in der Kryomold entlang seiner dorsal-ventralen Achse (Abbildung 2D, Abbildung 3A) durch Drehen des Auges, bis die Brandmarke auf der Oberseite ist, der Sehnerv ist auf der linken Seite und der ausgeschnittene Teil der Form zeigt sich nach rechts ( Abbildung 2D). Achten Sie darauf, Blasen in der Nähe des Gewebes zu vermeiden.
    HINWEIS: Um den Augenbecher zu manipulieren, verwenden Sie eine Titansonde aus einem Titandraht, der an einer Pipettenspitze befestigt ist.
12. Um Netzhautgewebe zu einfrieren, tauchen Sie den Kryomold mindestens 5 min in ein Metallbecher mit Isopentan ein und legen Sie das Becherglas in flüssigen Stickstoff oder Trockeneis/100% Ethanolbad (bis zu 1/3 der Höhe des Metallbechers).
    HINWEIS: Der Kryomold sollte in Isopentan emittan e,Isopentane bis zur Hälfte seiner Höhe eingetaucht werden, muss aber nicht vollständig untergetaucht werden.
13. Entfernen Sie den gefrorenen Block und wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie.
14. Bei -80 °C lagern.
15. Markieren Sie den eingefrorenen Block mit einem Stift oder Sharpie, um die Ausrichtung des Blocks aufzuzeichnen (Abbildung 3B).

2 . Schnitt mit einem Kryostat

1. Nach der Einstellung der Kryostattemperatur (zwischen -20 und -25 °C) lassen Sie die Formen, die die eingebetteten Augenbecher enthalten, 1 h auf die Kryostattemperatur ausgrenzen.
2. Installieren Sie den Block mit dorso-ventraler Ausrichtung (Abbildung 3C) und schneiden Sie 10 m dicke serielle Abschnitte. Platzieren Sie die Netzhautabschnitte vorsichtig auf kommentierten und nummerierten Mikroskopdias.
3. Lagern Sie Dias in Diaboxen bei -20 °C oder -80 °C, bis IHC-Verfahren durchgeführt werden.

3 . Fluoreszenz-Immunostainierung mit dem Slide Rack

HINWEIS: Das Slide Rack-System (z. B. Sequenza) hält die Glasmikroskop-Dias mit einer Abdeckplatte, wodurch ein Kapillarspalt von 100 L zwischen dem Schlitten und der Platte entsteht.

1. Die Kryo-Sektionen bei Raumtemperatur (RT) für 2 h bis 4 h auftauen, damit sie trocknen und an Mikroskopschlitten befestigen können.
   HINWEIS: Es ist auch möglich, sie bei 30-37 °C für 30 min bis 1 h zu trocknen.
2. Legen Sie Dias in Slide Rack und waschen Sie die Netzhautabschnitte zweimal in 100-200 L PBS für 2 min.
3. Permeabilisieren Sie die Netzhautabschnitte, indem Sie sie in 0,25% Triton-X / 0,05% NaN₃in PBS für 5 min bei RT inkubieren.
4. Fügen Sie den Folien eine Blockierlösung mit 100 L hinzu.
5. Fügen Sie den Dias 100 L primärer Antikörper hinzu, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.
6. Retinalabschnitte über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   HINWEIS: Während dieser Zeit decken Sie das Slide Rack ab, um eine Austrocknung der Abschnitte zu vermeiden.
7. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 Mal, jeweils für 15 min, mit 200 L PBS.
   HINWEIS: Die Zugabe von 0,001- 0,002% Triton-X100 zu PBS (PBS-T) ermöglicht eine strengere Wäsche, kann aber einige Membranen und zelluläre Strukturen stören.
8. Inkubieren Sie Netzhautabschnitte in fluoreszierend-markierten sekundären Antikörpern für 1 h bei RT. Von nun an vor Licht schützen.
9. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 mal, jeweils für 15 min.
10. Inkubieren Sie die Netzhautabschnitte bei RT für 5 min mit einem Kernmarker wie Hoechst 33342 oder DAPI-Lösung.
11. Waschen Sie die Netzhautabschnitte 1 Mal für 15 min.
12. Legen Sie einen Deckelaufschlag auf ein Papiertuch auf die Laborbank.
13. Fügen Sie 2 Tropfen anti-fading Montagemedien in die Mitte des Coverslip.
14. Drehen Sie die Rutsche um, um den Retina-Kryo-Abschnitt nach unten zu haben.
15. Montieren Sie den Deckelrutsch vorsichtig langsam, in einem Winkel von 45°, kippen Sie den Schlitten auf das Montagemedium.
    HINWEIS: Vermeiden Sie das Bilden von Blasen, wenn Sie die Folie an Ort und Stelle senken.
16. Tragen Sie mit einem schweren Buch oder Katalog (siehe unten) gleichmäßigen Druck auf die Slide-Coverslip-Kombination, um überschüssige Montagemedien zu vermeiden.
    HINWEIS: Um die Konsistenz bei der Probenvorbereitung zu gewährleisten, verwenden Sie immer dasselbe Objekt (d. h. dasselbe Buch oder denselben Katalog), um während der Schiebemontage gleichmäßigen Druck auf den Deckelzuschlag auszuüben.
17. Flach halten und bei RT im Dunkeln über Nacht aushärten lassen. Dias bei 4 °C auf unbestimmte Zeit flach lagern.
18. Bild über Weitfeld- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 4).

Um zu veranschaulichen, wie diese Protokolle eine optimale Netzhautkonservierung für IHC gewährleisten, untersuchten wir Netzhautabschnitte von P28 WT-Mäusen (C57BL/6N) mit Antikörpern gegen Rhodopsin (ein Photorezeptormarker)8, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 (Gad65, eine Marker)9, Glutamin-Synthetase (GS, ein Müller-Zellmarker)10und Calbindin (ein horizontaler Zellmarker)11 (Abbildung 4). IHC zeigen, dass unsere Protokolle durchweg qualitativ hochwertige und gut erhaltene Netzhautabschnitte ergeben. Bemerkenswert ist, dass die rhodopsinreichen inneren und äußeren Segmente vertikal und intakt bleiben, ohne dass sich das retinale pigmentierte Epithel (RPE) von der Überlage des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) trennt (Abbildung 4A). Darüber hinaus bleiben Müller-Zellen gut erhalten mit soma richtig ausgerichteten und zytoplasmatischen Prozessen, die sich von der Ganglienzellschicht (GCL) bis zur äußeren Kernschicht (ONL) erstrecken (Abbildung 4B).

Interneuronen, wie Gad65-positive Amacrinzellen, bleiben auch innerhalb der INL- und inneren Plexiformschicht (IPL) (Abbildung 4B) ordnungsgemäß geschichtet, während gut definierte horizontale Zellen an der INL- und äußeren Plexiform nachweisbar sind. (OPL) Rahmen (Abbildung 4C). Zusammen zeigen diese Daten, dass unsere Methode die Integrität von Netzhautzellen und Geweben bewahrt, von Photorezeptoren bis hin zu Ganglienzellen

Um das Querschnitt zu erleichtern, ist es wichtig, den optischen Becher in der Kryoform vor dem Einfrieren akribisch zu orientieren. Fehlorientierte Netzhaut, schlechte Schnitttechnik oder Schnitte mit stumpfen oder beschädigten Mikrotommessern können Artefakte wie Netzhautgeweberisse, Verzerrungen und Zellverschiebung verursachen, wie in Abbildung 4. Beispiele für Schnittartefakte sind in Abbildung 4D-Fdargestellt. In Abbildung 4D führen schlechte Schnitte und Ausrichtung zu Photorezeptor-Innen- und Außensegmentverzerrungen (Abbildung 4D) und kleinen Geweberissen (Abbildung 4E, Pfeil). In einem anderen Beispiel führt eine schlechte Gewebeorientierung vor dem Abschnitt zu einer suboptimalen Ausrichtung des Muller-Zellsomas und der zytoplasmatischen Prozesse Abbildung 4E. Abbildung 4F zeigt, wie eine schlechte Schnittung, die wahrscheinlich durch ein stumpfes Mikrotommesser verursacht wird, dazu führte, dass horizontale Zellen von der OPL in die GCL abschmierten. Daher muss genau auf die Ausführung jedes im Protokoll beschriebenen Schritts geachtet werden, um die höchste Qualität und Reproduzierbarkeit der IHC-Daten zu gewährleisten.

Abbildung 1 : Werkzeuge für Mausaugenssektion, Einbettung und IHC. (A) Cauterizer; (B) Sezierwerkzeuge von links nach rechts: Dumont #5/45 gekrümmte Zangen, gekrümmte Scheren und Dumont #5 dünne Zangen; (C) 35 mm Sezierschale (Pfeil zeigt auf Sezierkammer); (D) Sezieren des Mikroskops; (E) Gefrorene Werkzeuge von links nach rechts: Isolierter Kühler, Edelstahlbecher für Isopentanbad, Edelstahlflüssigkeit N2 Bad; (F) Titansonde; (G) Schiebeträger und Deckplatte für IHC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 : Maus-Augenbecher-Orientierung und -Beschreibung. (A) Zeitliche Brennmarkierungsposition (roter Pfeil), um die Augenorientierung zu erleichtern (dorso = D, ventral = V, temporal = T, nasal = N). (B) Schemafür die Mausaugensektion. Ein kleiner Schnitt wird an der Brandmarke gemacht, senkrecht in die Hornhaut und knapp über dem Limbus mit einem feinen Skalpell (Mikromesser). Um die Hornhaut schneiden, um den vorderen und hinteren Teil des Auges zu trennen. (C) Augenbecher mit intakter Netzhaut. (D) Dorso-ventrale Ausrichtung des Mausauges mit dem Sehnerv (ON), Linse (L), Hornhaut (C) dem Limbus (OS). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3 : Einbettung von Mausaugen. (A) Dorso-ventral orientierte Mäuse Augentasse in Kryomold gefüllt mit OCT, (B) Gefrorene Maus Netzhautbecher in annotierten Kryomold. (C) Cryostat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4 : Maus-Retina-Immunhistochemie. (A-C) Gute Qualität und (D-F) minderwertige Netzhautabschnitte von P28 WT wurden mit Antikörpern gegen den Rhodopsin (A, C) Amacrine Marker GAD65 (B, E) und den Müller-Zellmarker Glutaminsynthetase (GS; B, E) und horizontale Zellmarker-Calbindin (C, F). Weiße Pfeile weisen auf Geweberisse und abnorme Abstriche des Gewebes hin. Schuppenstange, 20 m. Kerne mit Hoechst 33342 (blau) beschriftet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Keine Angaben.