Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung der chemotaktischen Aktivität von Blutmonozyten in Mausmodellen vor, um die Auswirkungen ernährungsphysiologischer, pharmakologischer und genetischer Interventionen auf die Blutmonozyten zu bewerten und die von Denmonzyten abgeleiteten Makrophagen in Mausmodelle mit monocyt-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-geladenen Kellermembran-gelüfteten Gelsteckern.

Abstract

Gewebehomöostase und -reparatur sind entscheidend von der Rekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen abhängig. Sowohl die Unter- als auch die Überrekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen können die Wundheilung beeinträchtigen. Wir zeigten, dass fettreiche und zuckerreiche Diäten Monozytengrundierung und Dysfunktion fördern und gesunde Blutmonozyten in einen hyperchemotaktischen Phänotyp umwandeln, der bereit ist, sich in Makrophagen mit dysregulierten Aktivierungsprofilen und eingeschränkten phänotypischen Plastizität. Die Überrekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen und die Rekrutierung von Makrophagen mit dysregulierten Aktivierungsprofilen wird als ein wichtiger Beitrag zur Entwicklung chronischer entzündlicher Erkrankungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen, einschließlich Arteriosklerose und Adipositas. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die chemotaktische Aktivität von Blutmonozyten als Biomarker für Monozytengrundierung und Dysfunktion zu quantifizieren und den Makrophagen-Phänotyp Blutmonozyten zu charakterisieren, die in diesen Mausmodellen differenziert werden. Mithilfe der einzelzelligen Western Blot-Analyse zeigen wir, dass nach 24 h 33% der Zellen, die in MCP-1-geladene, von Der Membran geladene Gelstecker rekrutiert wurden, die in Mäuse injiziert wurden, Monozyten und Makrophagen sind; 58% nach Tag 3. Am 5. Tag wurden jedoch die Monozyten- und Makrophagenzahlen deutlich verringert. Schließlich zeigen wir, dass diese Assays auch die Isolierung von lebenden Makrophagen von den chirurgisch abgerufenen, von Kellermembran abgeleiteten Gelsteckern ermöglichen, die dann einer späteren Charakterisierung durch einzellige Western Blot-Analyse unterzogen werden können.

Introduction

Die Rekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen ist für die Entwicklung chronisch erheblicher Erkrankungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen, einschließlich Arteriosklerose und Adipositas^{1,2,3, 4}. Die Anzahl der monozytenabgeleiteten Makrophagen an Stellen von Gewebeverletzungen sowie deren Plastizität sind entscheidend für die Gewebehomöostase und Reparatur. Sowohl die Unter- als auch die Überrekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen können die Wundheilung beeinträchtigen⁵. Auslösen lokaler Gewebeentzündungen, z.B. durch Ansammlung und Oxidation von Low-Density-Lipoprotein (LDL) in der Aortenwand oder entzündliche Aktivierung von Adipozyten durch Fettsäuren oder bakterielles Lipopolysaccharid, das durch das Darmprotein austritt barriere, führt zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren, einschließlich Chemokinen wie Monozytenchemoattractant Protein-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 ist ein Mitglied der C-C Chemokin-Familie und ein schlüsselfertiger Chemoattractant, der für die Rekrutierung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen an Stellen der Gewebeentzündung und -verletzung^{6,7,8 , 9,10}. Die entzündliche Aktivierung des vaskulären Endothels führt zur Expression von Adhäsionenmolekülen wie dem interzellulären Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) und dem Vaskulärenzelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1)^11,12, zirkulierende Monozyten, die von MCP-1 aktiviert werden, um mitzurollen, fest anzuhalten und anschließend in den subendotheliaalen Raum¹²zu transmigisieren. Infiltrierende Monozyten differenzieren sich in Makrophagen, die in einen proinflammatorischen Phänotyp aktiviert werden können, der den akuten Entzündungsprozess antreibt. Angetrieben von der Mikroumgebung können pro-inflammatorische Makrophagen in entzündungslösende Makrophagen umgewandelt werden, die eine entscheidende Rolle bei der Reinigung von Entzündungszellen spielen, entzündungshemmende Signale entfernen und Gewebereparatur und Wunde abschließen. Heilung^12,13.

Chronischer metabolischer Stress grundiert Monozyten für eine dramatisch verbesserte Reaktionsfähigkeit auf Chemo-Anziehenunde und erhöhte Monozytenrekrutierung, und wir zeigten, dass grundierte Monozyten zu Makrophagen mit dysregulierten Aktivierungsprogrammen und Polarisation führen zuständen^14,15,16. Monozytengrundierung fördert Arteriosklerose, Fettleibigkeit und möglicherweise andere chronisch entzündliche Erkrankungen im Zusammenhang mit Stoffwechselstörungen wie Steatohepatitis, Nierenerkrankungen und möglicherweise Krebs. Um monozytierenprimieren in Mausmodellen menschlicher Krankheiten zu bewerten und zu quantifizieren, haben wir eine neue Technik entwickelt, um den Grundierungszustand von Blutmonozyten zu bewerten, indem wir die chemotaktische Aktivität in vivo^14,15,16, ¹⁷. Unser Ansatz beinhaltet die Injektion von Kellermembran-abgeleitetem Gel, das entweder mit einem Chemoattractant geladen ist – wir verwenden häufig MCP-1 – oder ein Fahrzeug in die linke bzw. rechte Flanke von Mäusen. Bei sorgfältiger Subkutane injiziert, bildet das Kellermembran-abgeleitete Gel einen einzigen Stecker, aus dem die Chemokine diffundieren und einen definierten chemotaktischen Gradienten erzeugen können, der nicht durch den metabolischen oder entzündlichen Zustand der Umgebung beeinflusst wird. Gewebe oder die Empfängermaus.

Das von Kellermembran abgeleitete Gel, das wir für unseren Assay verwenden, ist ein lösliches Kellermembranpräparat, das aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkom extrahiert wird, einem Tumor, der reich an solchen extrazellulären Matrixproteinen (ECM) ist. Diese komplexe Proteinmischung enthält Laminin (60%), Kollagen IV (30%), das Überbrückungsmolekül Entactin (8%) und eine Reihe von Wachstumsfaktoren. Der Kellermembran-Matrix-Plug-Assay wurde ursprünglich entwickelt, um angiogenese als Reaktion auf verschiedene Wachstumsfaktoren^18,19zu untersuchen. Jedoch, um Monozyten Chemotaxis zu studieren, Ist es wichtig, Wachstumsfaktor-erschöpfte Keller membranabgeleitete Gel zu verwenden, um Endothelzellrekrutierung und Angiogenese zu minimieren. Was Matrigel (von nun an als Kellermembran-Gel bezeichnetes Gel) einzigartig und besonders nützlich macht, ist, dass es bei Temperaturen unter 10 °C verflüssigt, so dass Chemokine gelöst werden können. Bei Temperaturen über 22 °C durchläuft die aus der Kellermembran abgeleitete Lösung schnell einen Phasenübergang und bildet schnell ein Hydrogel. Die Stecker können operativ ausgeschnitten, gereinigt und mit einem vom Bacillus abgeleiteten neutralen Metalloprotease gelöst werden, um einzellige Suspensionen zu ergeben, die an einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS), mit RNAseq, einzelliger RNA und einer Vielzahl anderer omics Techniken. Hier beschreiben wir die Verwendung von einzelligen Western Blot-Analysen zur Charakterisierung der Zellpopulationen, die ein, drei oder fünf Tage nach der Injektion in die von Derse gewonnenen Gelstecker im Keller rekrutiert wurden.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Wake Forest School of Medicine genehmigt.

1. Vorbereitung der MCP-1-geladenen Mit-Wachstumsfaktor-reduzierten Basement Membrane-abgeleiteten Lösung

HINWEIS: Dies ist ein steriles Verfahren.

1. Reinigen Sie die Zellkulturhaube mit Desinfektionsmittel, bevor Sie die von der Kellermembran abgeleitete Lösung (z.B. Matrigel) vorbereiten.
2. Bereiten Sie einzeln verpackte sterile 1 ml Spritze vor und wischen Sie die Oberseite der Kellermembran-Lösungsflasche mit einem Alkoholtupfer ab, bevor Sie sie in die Spritze laden.
3. Die wachstumsfaktorreduzierte, von Deringinmembran abgeleitete Lösung auf Eis vollständig auftauen.
   ACHTUNG: Wenn die Kellermembranmatrix bei Raumtemperatur (RT) aufgetaut wird, stellen Sie sicher, dass ein kleines Eispartikel übrig bleibt, um zu verhindern, dass die Lösung gegelt wird.
4. Nach dem Auftauen die Durchstechflasche öffnen und MCP-1 oder 1xPBS mit 0,1% BSA in der Zellkulturhaube mischen.
5. 1 ml der sterilen Spritze mit einer 26 G Nadel vorbereiten und auf Eis abkühlen lassen.
6. Bereiten Sie eine Lagerlösung von MCP-1 vor, indem Sie MCP-1 auf eine Endkonzentration von 50 g/ml in 1x PBS mit 0,1% BSA auflösen.
7. MCP-1 in 5 ml kalter Kellermembran-abgeleitete Lösung auf eine Endkonzentration von 500 ng/ml verdünnen. Bereiten Sie eine gleiche Menge an Kellermembran-abgeleitete Lösung mit Fahrzeug nur (1x PBS enthalten 0,1% BSA).
8. Laden Sie 500 l von der Kellermembran abgeleitete Lösung (mit oder ohne MCP-1) in die kalte 1 ml Spritze.
9. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der von der Kellermembran abgeleiteten Lösungsspritze, bevor Sie die Injektion vornehmen, um eine gleichmäßige Steckerbildung zu gewährleisten.

2. Injektion von Basement Membrane-abgeleiteter Lösung

1. Sprühen Sie 70% Ethanol um den Verfahrensbereich vor und während der Injektionen, um die Umwelt zu desinfizieren.
2. Um anästhesiezuden, legen Sie die Maus in eine Anästhesiekammer und stellen Sie den O₂ Durchflussmesser auf 1 Liter/min, dann stellen Sie den Verdampfer auf 2% Isofluran ein.
3. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Atemfrequenz (Rate/min), den Hornhautreflex und die Bewegung von Schnurrhaaren überwachen.
4. Während des gesamten Eingriffs die Anästhesie mit einem Nasenkegel aufrecht erhalten.
5. Während des Eingriffs überwachen Sie die Atemfrequenz (Rate/min), den Hornhautreflex und die Bewegung von Schnurrhaaren, um die Tiefe der Anästhesie zu überprüfen.
6. Nach der Bestätigung der fehlenden Reaktion auf Zehenkneifen, langsam injizieren (ca. 100 l/s) die Kellermembran-abgeleitete Lösung subkutan in die rechte (keine MCP-1) und linke (mit MCP-1) Flanke der Maus. Wenn die Injektion zu langsam ist, können die aus der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker unregelmäßig geformt oder sogar fragmentiert werden und schwer zu entfernen sein.
7. Halten Sie die Spritze für 20-30 s nach der Injektion, um das Auslaufen der Lösung zu verhindern und einen einzigen glatten Gel-Stecker bilden zu lassen.
8. Nach der Injektion, legen Sie die Maus auf dem Wärmepad mit Überwachung bis zur Erholung.
9. Kehren Sie die Maus in den ursprünglichen Käfig zurück, sobald die Maus vollständig wiederhergestellt ist.

3. Ernte der Basement Membrane-abgeleiteten Gelstecker

1. Wiegen Sie zwei separate 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre für jede Maus und beschriften Sie sie.
2. Drei Tage nach Derinspritzung der von der Kellermembran abgeleiteten Lösung, einschläfern Sie die Maus in der Anästhesiekammer mit 3% Isofluran, gefolgt von zervikaler Dislokation.
3. Entfernen Sie das Rückenfell der Maus mit Haarschneidern oder tragen Sie Haarentfernercreme mit Baumwoll-Spitzenstäbchen für 5 min auf und wischen Sie sie dann ab.
4. Halten Sie die Maushaut mit Zangen um den unteren Brust- und Oberen Lendenwirbel und machen Sie einen 2 mm langen Schnitt in die Haut.
5. Schneiden Sie die Mittellinie der Rückseite der Maus von einem Schnitt bis zu Halswirbeln und bis zu 1 cm über kaudalen Wirbelkreuzung (Schwanzkreuzung) mit chirurgischer Schere.
6. Trennen Sie die Haut von der Muskelschicht und fixieren Sie die Haut auf einer Polystyrolschaumplattform.
7. Halten Sie die faserige Kapsel, die den von der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker enthält, vorsichtig mit feinen Zangen fest und entfernen Sie die faserige Kapsel mit einer feinen Schere, um den Stecker zu reinigen.
8. Entfernen Sie den gereinigten, von der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker und übertragen Sie ihn in 1,5 ml Mikrozentrifuge (siehe 3.1).
9. Wiegen Sie das Mikrozentrifugenrohr mit dem gereinigten, von der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker und berechnen Sie das Gewicht des aus der Kellermembran abgeleiteten Gelsteckers.

4. Verdauen Sie die Basement Membrane-abgeleiteten Gelstecker

1. Tauen Dispase (10 ml) auf dem Eis.
2. Mit einer sauberen, feinen Schere wird der aus der Kellermembran gewonnene Gelstecker in das Mikrozentrifugenrohr gehackt.
3. Fügen Sie in jedes Mikrozentrifugenrohr, das aus Kellermembran gewonnener Gelstecker enthält, 800 l Dispase ein.
4. Vortex mit maximaler Geschwindigkeit für 10 s, um den Stecker zu stören.
5. Inkubieren Sie die Mikrozentrifugenrohre für 2 h bei 37 °C bei 1.400 U/min in einem Thermomixer, um den aus der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker vollständig aufzulösen.
6. Nach 2 h Zentrifuge bei 400 x g für 10 min bei RT. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
7. Setzen Sie das Pellet in 1 ml 1x PBS durch Invertieren oder Tippen wieder auf.
8. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 200 x g für 10 min bei RT. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
9. Setzen Sie das Pellet in 300 l PBS wieder aus.
10. Nehmen Sie 50 l Zellsuspension in einem separaten Mikrozentrifugenrohr.
11. Fügen Sie der Zellsuspension 0,5 l Calcein AM (1 M) hinzu.
    HINWEIS: Calcein AM ist ein grüner fluoreszierender Zelllebensfähigkeitsfarbstoff, der sich nur in lebenden Zellen ansammelt.
12. Inkubieren Sie die Zellen in einem CO2-Inkubator bei 37 °C für 10 min.
13. Zählen Sie grüne fluoreszierende (lebende) und nicht fluoreszierende (tote) Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählers.

5. Bestimmung der Zellzusammensetzung in der Zellsuspension mit Einzelzell-Western Blot (scWB) Analyse

1. Rehydrieren Sie den scWB-Chip vor der Verwendung in 15 ml 1x Suspensionspuffer in einer Petrischale für mindestens 10 min bei RT.
2. Fügen Sie 1 ml der verdünnten Einzelzellsuspension (10.000-100.000 Zellen/ml) in den rehydrierten Chip ein. Stellen Sie die Oberfläche auf den Boden einer 10 cm Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche flach eingestellt ist.
3. Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel, um das Trocknen zu verhindern, und lassen Sie die Zellen 5-15 min durch Farbverlauf absetzen.
4. Legen Sie den Chip unter ein Hellfeldmikroskop und inspizieren Sie die Brunnen bei 10-facher Vergrößerung.
   HINWEIS: Ungefähr 15-20% Mikrobrunnen sollten von einer Einzelzelle belegt werden, weniger als 2% der Brunnen sollten 2 oder mehr Zellen enthalten
5. Neigen Sie die 10 cm Petrischale mit dem Chip um 45 Grad.
6. Waschen Sie den Chip mit dem 1x Suspensionspuffer, um nicht gefangene Zellen von der Oberfläche des Chips zu entfernen, indem Sie sanft von oben nach unten des Chips pipetieren. Wiederholen Sie dies 3 Mal.
7. Bereiten Sie das einzellige westliche Instrument vor.
8. Stellen Sie die Lysezeit, die Elektrophoresezeit und die UV-Aufnahmezeit ein. Um rekrutierte Makrophagen zu analysieren, die aus dem von der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker gewonnen wurden, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Lysezeit: 0 s; Elektrophoresezeit: 160 s; UV-Aufnahmezeit 240 s.
9. Laden Sie den Chip vorsichtig in die Elektrophoresezelle des einzelligen westlichen Instruments, gelseitig ausgerichtet. Seien Sie vorsichtig, um die Gelseite des Chips nicht zu beschädigen.
10. Gießen Sie den Lyse/Laufpuffer in die Kammer und decken Sie den gesamten einzelzelligen Westernchip vollständig ab. Starten Sie die Zelllyse.
11. Führen Sie scWB-Instrument mit der in 5.8 aufgeführten Einstellung aus.
12. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, übertragen Sie den Chip auf eine 10 cm Petrischale und waschen Sie den Chip zweimal mit 1x Waschpuffer für 10 min bei RT.
13. Herstellung von Verdünnungen von Primärantikörpern (Antivinculin: 1:10; Anti-CD45: 1:15, Anti-CD11b: 1:20, Anti-F4/80: 1:10) in einem Gesamtvolumen von 80 l Antikörperverdünnungsmittel (Mischung 8 l Antikörper 1 plus 8 l Antikörper 2 plus 64 l Verdünnungsmittel).
14. Fügen Sie der Antikörper-Proprobing-Kammer 80 l der primären Antikörperlösung hinzu und senken Sie das Spangel nach unten, so dass die Antikörperlösung über den Chip ableitet.
15. Inkubieren Sie mit der primären Antikörperlösung für 2 h bei RT.
16. Waschen Sie den Chip dreimal für 10 min in 1x Waschpuffer auf dem Shaker.
17. Waschen Sie den Chip einmal für 10 min im Wasser auf dem Shaker, um das Gel zu entsalzen.
18. Bereiten Sie eine 1:20 Verdünnung des sekundären Antikörpers in einem Gesamtvolumen von 80 l vor (Mischung 2 l Sekundärantikörper plus 78 l Verdünnungsmittel).
19. Inkubieren Sie den Chip mit Sekundärantikörper für 1 h bei RT vor Licht geschützt.
20. Waschen Sie den Chip dreimal für 10 min mit 1x Waschpuffer auf dem Shaker.
21. Drehen Sie den Chip mit einem Schiebespinner, um den verbleibenden Waschpuffer zu entfernen.
22. Scannen Sie den Chip auf einem Dual-Laser-Mikroarray-Scanner mit einer Auflösung von 5 m am Spektralkanal des fluorophors, der an die sekundären Antikörper gekoppelt ist.
23. Analysieren Sie Daten mit scWB-spezifischer Software.

6. Ausziehen des scWB-Chips

1. Bewahren Sie den gescannten Chip im Waschpuffer auf, bis er abstreifen kann.
2. Legen Sie das Wasserbad in eine Dunstabzugshaube.
3. Legen Sie ein 50 ml Rohrgestell in das Wasserbad mit dem Wasser nur 1 cm über dem Rack und stellen Sie die Wassertemperatur auf 60 °C.
4. Bereiten Sie den Abisolierpuffer vor. Für 1 L Abisolierpufferlösung 9,85 g Tris-HCl (pH 6,8) und 20 g SDS in 900 ml destilliertem Wasser auflösen und pH-Wert einstellen. Dann mit destilliertem Wasser auf 1L füllen. Fügen Sie 0,8% (v/v) von .-Mercaptoethanol (-ME; 14,3 M) unmittelbar vor jeder Anwendung hinzu.
5. Legen Sie den Chip nach dem ersten Scan in eine 10 cm Petrischale, bevor Sie ihn ausziehen.
6. Nehmen Sie für jeden Chip 40 ml Abisolierpuffer und fügen Sie 320 l von .-ME hinzu.
   VORSICHT: Das ME ist giftig und gefährlich für Mensch und Umwelt. Das folgende Verfahren sollte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
7. Legen Sie den Chip in den Kanister und versiegeln Sie den Kanister mit Parafilm, um zu verhindern, dass Wasser in den Kanister austritt.
8. Legen Sie den Kanister in das Rohrgestell im vorgewärmten Wasserbad.
9. Inkubieren Sie für 90 min.
10. Entfernen Sie den Chip vorsichtig aus dem Kanister und legen Sie ihn in eine frische Petrischale.
11. Den Chip einmal mit 1x Waschpuffer kurz waschen. Dann 15 ml 1x Waschpuffer in die Petrischale geben.
12. Waschen Sie den Chip für 15 min auf einem Shaker. Wiederholen Sie den Waschschritt viermal.
    HINWEIS: Chip ist bereit für den nächsten primären Antikörper (siehe Schritte 5.12 - 5.21).

Results

Um auf die Reaktionsfähigkeit von Blutmonozyten an Chemolockantien zuzugreifen, injizierten wir eine mit Fahrzeugen beladene und MCP-1-geladene, von Derastemembranen abgeleitete Lösung in die linke und rechte Flanke jeder Maus. Kellermembran-abgeleitete Gelstecker wurden 1, 3 und 5 Tage nach Injektionen entfernt, gelöst und Zellen, die in jeden Stecker rekrutiert wurden gezählt (Abbildung 1A). Durch Subtrahieren der Zellenzahl im fahrzeugbelasteten Stecker (offene Balken) von der Zellenzahl im MCP-1-belasteten Stecker (geschlossene Balken) erhielten wir die Anzahl der Zellen, die speziell als Reaktion auf MCP-1 rekrutiert wurden (Zellennummer, Abbildung 1B). Wir beobachteten eine beschleunigte MCP-1-spezifische Rekrutierung und Akkumulation von Zellen über den 5-Tage-Zeitraum, mit einer Zunahme der Raten von 31.000 Zellen/Tag (Tag 1) auf 78.000 Zellen/Tag (Tag 3) und 136.000 Zellen/Tag am Tag 5 (Abbildung 1B).

Um die Zelltypen zu identifizieren, die in die von Der Kellermembran abgeleiteten Gelstecker gelangten, haben wir die von jedem Stecker isolierten Zellen einer einzelligen Western Blot-Analyse (scWB) unterzogen, die nach CD45-, CD11b- und F4/80-Expression sucht, um Monozyten zu identifizieren (CD11b⁺F4/80). ^-), Makrophagen (CD11b⁺F4/80⁺ plus CD11b^-F4/80⁺) und verbleibende nichtmonozytäre Leukozyten (CD45⁺CD11b^-F4/80^-) (Abbildung 2). Die scWB-Chips wurden dann auf Vinculin untersucht, um die Gesamtzahl der Zellzahlen auf jedem Gel zu bestimmen und die Einzelzellbelegung der Mikrobrunnen auf dem scWB-Chip zu bestätigen. Der Anteil der Monozyten innerhalb der MCP-1-geladenen Kellermembran-gemembranen-abgeleiteten Gelstecker war am Tag 1, 20%, an Tag 3 mit 47% niedrig, bevor er an Tag 5 auf 14% fiel (Abbildung 2D). Die Makrophagenzahlen innerhalb der MCP-1-geladenen, von Der Membran abgeleiteten Gelstecker stiegen stetig von 13 % am ersten Tag auf 22 % am 3. Tag und 23 % am 5. Tag. Bei MCP-1-geladenen Steckern war der Prozentsatz der Monozyten plus Makrophagen innerhalb der isolierten Zellpopulation am höchsten an Tag 3, 31% bei Fahrzeug-beladenen Steckern (Abbildung3A) und 58% in MCP-1-geladenen Steckern (Abbildung 3B), was darauf hindeutet, dass nach 3 Tagen die überwiegende Mehrheit der zellenrekrutiert durch MCP-1-abhängige Chemotaxis sind Monozyten und Makrophagen. Obwohl die Gesamtzahl der Monozyten plus Makrophagen an Tag 5 höher war als an Tag 3 (Abbildung 3C und D), aufgrund des deutlich höheren Anteils von Monozyten und Makrophagen an der gesamten Zellpopulation (Abbildung3A und B), die Zellzahl an Tag 3 reflektiert genauer Blutmonozyten-Chemotaxis und Rekrutierung. Deshalb injizieren wir routinemäßig die aus der Kellermembran abgeleitete Lösung drei Tage vor dem Opfern der Tiere. Ob alle von MCP-1 rekrutierten Makrophagen monozytenabgeleitet sind oder residente Makrophagen, die aus benachbarten Geweben rekrutiert wurden, trugen nicht fest.

Die statistische Auswertung der hier gezeigten Daten wurde mit Analysesoftware (z.B. SigmaPlot 14) durchgeführt. ANOVA gefolgt vom Fischer LSD-Test wurde verwendet, um Mittelwerte zwischen experimentellen Gruppen zu vergleichen. Alle Daten werden als mittlere SD von mindestens 3 unabhängigen Experimenten dargestellt. Die Ergebnisse wurden auf der Ebene P < 0,05 als statistisch signifikant angesehen.

Abbildung 1 : Quantifizierung von Zellen, die in subkutane, von Dermembran abgeleitete Gelstecker im Keller rekrutiert werden. (A) Absolute Zellnummern für fahrzeugbelastete (offene Balken) und MCP-1-belastete Kellermembran-Gelstecker (geschlossene Stäbe). (B) Die Anzahl der Zellen, die von MCP-1 in kellermembranabgeleitete Gelstecker rekrutiert wurden, wurde als Unterschied in den Zellzahlen zwischen MCP-1-belasteten und fahrzeugbelasteten Steckern berechnet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert sD (n=4) angezeigt Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Abbildung 2 : Analyse von Zellpopulationen, die in Kellermembran-abgeleitete Gelstecker durch einzellige Western-Blot-Analyse rekrutiert wurden. (A+B) Repräsentative Beispiele für die scWB-Analyse eines fahrzeugbeladenen (Control) und eines MCP-1-lende Steckers (MCP-1), der drei Tage nach der Injektion von einer Maus isoliert ist, werden gezeigt. Chips, die mit Antikörpern gegen CD45, CD11b und F4/80 gekennzeichnet sind, gefolgt von fluoreszierenden sekundären Antikörpern, wie im Protokoll beschrieben. Die Fluoreszenzintensität des beschrifteten Bandes für jede einzelne Zelle wird als Spitzenfläche dargestellt. (C+D) Zellpopulationen wurden als Monozyten (CD11b⁺F4/80^-, ), Makrophagen (CD11b⁺F4/80⁺ plus CD11b^-F4/80⁺, ) oder als nichtmonozytäre Leukozyten (CD45⁺ , ). Die übrigen Zellen wurden als"andere" ( ) bezeichnet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert sD (n = 3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Abbildung 3 : Monozyten- und Makrophagengehalt von aus Dererampen stammenden Gelsteckern. Quantitative Analyse des rekrutierten Monozyten- und Makrophagengehalts in fahrzeugbeladenen und MCP-1-geladenen Steckern, die am Tag 1, 3 und 5 nach der Injektion entfernt wurden. Die Werte werden als Prozentsatz der gesamten Zellpopulation (A + B) und in absoluten Zellenzahlen pro Stecker ( C +D) angezeigt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert sD (n = 3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 

Discussion

Wir entwickelten einen In-vivo-Chemotaxis-Assay, der die einzigartigen physikalischen Eigenschaften der von DerKellermembran abgeleiteten Matrix und die Fähigkeit nutzt, diese einzigartige Matrix mit Chemokinen zu beladen und in Mäuse zu injizieren. Der Assay ermöglicht es uns, bei lebenden Mäusen die Reaktionsfähigkeit von Monozyten (und Makrophagen) auf Chemokine zu beurteilen, wie hier für MCP-1 dargestellt, und die Auswirkungen von genetischer Manipulation oder pharmakologischen, diätetischen und anderen Umweltexpositionen auf Monozyten Chemotaxis. Da der Chemokingradient, den wir bei diesen Mäusen erzeugen, im Wesentlichen nicht von genetischen, pharmakologischen, diätetischen oder ökologischen Expositionen beeinflusst wird, spiegeln Veränderungen der monozytenchemttaktischen Aktivität tatsächlich funktionelle Veränderungen in diesen Monozyten wider und, wie wir gezeigt haben zuvor auch die Umprogrammierung sowohl auf der Protein- als auch auf der Transkriptionsebene^17,20. Wir berichteten, dass metabolischer Stress bei Mäusen die Monozytenreaktion auf Chemoattractant erhöht und dass diese hyper-chemotaktische Aktivität mit einem erhöhten Protein S-Glutathionylierung korreliert, einer reversiblen, Redox-abhängigen posttranslationalen Proteinmodifikation, die in den meisten Fällen zum Verlust der enzymatischen und Proteinfunktion^21,22führt und in einigen Fällen sogar den Proteinabbau fördert^16,23.

Um dieses Verfahren erfolgreich auszuführen und mit diesem Test optimale Ergebnisse zu erzielen, ist es entscheidend, dass genaue Volumina von Kellermembran-abgeleiteten Lösungen langsam injiziert werden, um einen einzigartigen wohlgeformten Stecker zu erzeugen und faserige Kapseln entfernt werden sollten. vollständig zu erhalten saubere Stecker bei der Ernte Keller Membran abgeleitet Gel-Stecker, erleichtert die Auflösung der gesamten Stecker in der Dispase-Lösung. Unsere Daten zeigen, dass das Verlassen des Steckers in den Tieren für drei Tage optimiert 1) die Signalintensität, d.h. die Anzahl der Monozyten und Makrophagen, die in jeden Stecker rekrutiert werden, 2) die Selektivität des Signals, d.h. den Inhalt von Monozyten und Makrophagen innerhalb der Gesamtzellpopulationen und 3) die Spezifität des Signals, d. h. die Zunahme von Monozyten und Makrophagen als Reaktion auf MCP-1 im Vergleich zum Fahrzeug. Schließlich zeigen wir, wie modernste Einzelzell-basierte Ansätze in Verbindung mit dem von Kellermembran abgeleiteten Gelplug-Assay verwendet werden können, um die in die Stecker rekrutierten Monozyten zu charakterisieren und so eine Momentaufnahme des potenziellen Phänotyps die monozytenabgeleiteten Makrophagen, die in einem bestimmten Mausmodell als Reaktion auf spezifische genetische, pharmakologische, diätetische oder ökologische Interventionen an Verletzungsstellen rekrutiert werden.

Es gibt eine Reihe von Einschränkungen des Assays zu berücksichtigen. Erstens erfordert die Maushandhabung, einschließlich Anästhesie, Injektion von Kellermembran-abgeleiteten Lösungen und chirurgische Rinz, die Praxis, um einzelne Stecker und reproduzierbare Daten zu generieren. Zweitens: Während die meisten Zellen, die in die MCP-1 geladenen Stecker rekrutiert werden, Monozyten und Makrophagen sind, ist eine beträchtliche Anzahl nicht. Dies kann sich auf die Interpretation anderer, nicht-einzelzellbasierter analytischer Assays auswirken, die an dieser Zellpopulation durchgeführt werden. Da die Zelllysebedingungen für scWB mild sind, können die Migrationsabstände von Proteinen von DerStandard-WB abweichen und nicht mit der Proteingröße korrelieren. Daher müssen sowohl die Zelllyse als auch die Laufzeiten für jedes zu prüfende neue Protein und jeden primären Antikörper validiert werden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petrischale	Griner Bio-ONE	664 160
10x Suspensionspuffer	proteinsimple	R101
15 cm Petrischale	Falcon	353025
2-Mercaptoethanol	MP BIOMEDICALS	2194705
5% Waschpuffer	proteinsimple	R252
Antikörper-Verdünnungsmittel	Proteineinfach	042-203
Tischzentrifuge	Beckman Coulter		Microfuge 22R Zentrifuge
Rinder-Serim-Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Calcein AM	ThermoFisher	C3099	1 mL
CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) Kaninchen mAb	Cell Signal Technologies	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
Cellometer Vision	Nexcelom
Dispase	BD	354235	100 mL
Präparierschere
Esel Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper [NL557]	Novus Biologicals	NL004	NL 557 Konjugat
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) Sekundärantikörper [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	DyLight 650 Konjugat
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
Heat Block	effendorf	22331	Thermomixer
Lysis/Running Buffer	Proteinsimple	R200
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced)	BD	354230	10 ml
Microarray Scanner	PerkinElmer	ScanArray Gx
Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-129
Mikroskop	ThermoFisher	Evos fl
Milo	proteinsimple		Single Cell
Western Needle	BD	305111	26 G
Parafilm
Sondierungskammer	proteinsimple	035-020
Rekombinantes Maus-CCL2/JE/MCP-1-Protein	R& D	479-JE-050
scWEST	Chip-Proteineinfach	C300
Shaker	Bioexpress		Gen-Mate-Orbitalschüttler
Einzelzell-Western-Chip-Kanisterproteineinfach		035-118
Slide Spinner	Labnet	C1303-T
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Fisher Scientific	BP 166-500
Spritze	BD	309602	1 mL
Tris-Hydrochlorid	Fisher Scientific	BP 153-500
Pinzette	proteinsimple	035-020
	Wasserbad ThermoFisher