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Immunology and Infection

Séparation de l’épiderme et du derme du rat avec la thermolysine pour détecter l’ARNm et la protéine inflammatoires spécifiques au site

Published: September 29, 2021 doi: 10.3791/59708
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 2, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics, Washington State University
* These authors contributed equally

Summary

Présenté ici est un protocole pour la séparation de l’épiderme du derme pour évaluer la production de médiateur inflammatoire. Suite à l’inflammation, l’épiderme de la patte postérieure du rat est séparé du derme par la thermolysine à 4 °C. L’épiderme est ensuite utilisé pour l’analyse de l’ARNm par RT-PCR et l’évaluation des protéines par transfert de Western et immunohistochimie.

Abstract

Des techniques faciles à utiliser et peu coûteuses sont nécessaires pour déterminer la production spécifique au site de médiateurs inflammatoires et de neurotrophines lors de lésions cutanées, d’inflammation et / ou de sensibilisation. L’objectif de cette étude est de décrire un protocole de séparation épidermique-cutanée utilisant la thermolysine, une protéinase active à 4 °C. Pour illustrer cette procédure, les rats Sprague Dawley sont anesthésiés et les pattes postérieures droites sont injectées avec du carraghénane. Six et douze heures après l’injection, des rats souffrant d’inflammation et des rats naïfs sont euthanasiés, et un morceau de patte postérieure, la peau glabre est placé dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco froid. L’épiderme est ensuite séparé au niveau de la membrane basale du derme par thermolysine dans le PBS avec du chlorure de calcium. Ensuite, le derme est sécurisé par des pinces à microdissection et l’épiderme est doucement taquiné. La coloration bleu toluidine des coupes de tissu montre que l’épiderme est séparé proprement du derme au niveau de la membrane basale. Toutes les couches de cellules kératinocytes restent intactes et les crêtes épidermiques ainsi que les indentations des papilles dermiques sont clairement observées. La RT-PCR qualitative et en temps réel est utilisée pour déterminer le facteur de croissance nerveuse et les niveaux d’expression de l’interleukine-6. Le western blotting et l’immunohistochimie sont enfin effectués pour détecter des quantités de facteur de croissance nerveuse. Ce rapport illustre que la digestion froide par thermolysine est une méthode efficace pour séparer l’épiderme du derme pour l’évaluation des altérations de l’ARNm et des protéines pendant l’inflammation.

Introduction

L’évaluation des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques de la peau peut être limitée en raison de l’hétérogénéité des types cellulaires présents dans le derme et l’épiderme enflammés1,2,3. Plusieurs enzymes, techniques chimiques, thermiques ou mécaniques impliquant la séparation des deux couches ou permettant d’effectuer une dissociation cellulaire pour évaluation ont été revues récemment4. L’acide, l’alcali, le sel neutre et la chaleur peuvent séparer rapidement l’épiderme du derme, mais un gonflement cellulaire et extracellulaire se produit souvent5,6. La trypsine, la pancréatine, l’élastase, la kératinase, la collagénase, la pronase, la dispase et la thermolysine sont des enzymes qui ont été utilisées pour la séparation épidermique-cutanée4,7. La trypsine et d’autres enzymes protéolytiques à grande échelle sont actives à une °C de 37 à 40 °C, mais doivent être surveillées attentivement pour éviter la dissociation des couches épidermiques. Dispase clive l’épiderme à la lamina densa, mais nécessite 24 h pour la séparation dans le froid4,8 ou des points de temps plus courts à 37 ° C4,9. Une caractéristique limitante de toutes ces techniques est la perturbation potentielle de la morphologie des tissus et la perte d’intégrité de l’ARNm et des protéines.

Pour maintenir l’intégrité de l’ARNm et des protéines, une méthode de séparation de la peau doit être effectuée dans le froid pendant une courte période de temps. Dans l’évaluation des techniques de séparation de la peau pour les études sur l’inflammation, la thermolysine est une enzyme efficace pour séparer l’épiderme du derme à des températures froides4. La thermolysine est active à 4 °C, coupe les hémidesmosomes épidermiques de la lamina lucida et sépare l’épiderme du derme en 1–3 h4,8,10. L’objectif de ce rapport est d’optimiser l’utilisation de la thermolysine pour séparer l’épiderme enflammé du rat du derme afin de détecter les niveaux d’ARNm et de protéines pour les médiateurs inflammatoires et les facteurs neurotrophiques. Plusieurs rapports préliminaires ont étéprésentés11,12,13,14,15. L’objectif de ce manuscrit est de décrire une technique optimale de séparation de la peau à l’aide de la thermolysine et de démontrer la détection de 1) marqueurs de l’inflammation, 2) ARNm interleukine-6 (IL-6) et 3) ARNm et protéines du facteur de croissance nerveuse (NGF) dans l’épiderme de rats présentant une inflammation induite par le carraghénane (C-II)16,17. Un rapport préliminaire utilisant le modèle adjuvant complet de Freund indique que les niveaux d’ARNm et de protéines NGF augmentent tôt pendant l’inflammation15. Chez la souris, la sensibilisation cutanée avec l’application topique d’oxazolone provoque une augmentation précoce de l’ARNm IL-6 en utilisant l’hybridation in situ36. L’IL-6 et le NGF ont tous deux été impliqués dans C-II18,19, mais il n’y a eu aucun rapport décrivant les niveaux d’ARNm ou de protéines pour l’IL-6 ou le NGF spécifiquement de l’épiderme pendant les stades aigus de C-II.

La technique de la thermolysine est peu coûteuse et simple à réaliser. De plus, la séparation thermolysine de l’épiderme du derme permet l’ARNm, le transfert de Western et l’analyse immunohistochimique des médiateurs inflammatoires et des facteurs neurotrophiques au cours du processus d’inflammation15. Les investigateurs devraient être en mesure d’utiliser facilement cette technique dans les études précliniques et cliniques de l’inflammation de la peau.

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Protocol

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de l’Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).

1. Inflammation induite par le carraghénane (C-II)

  1. Anesthésier les rats Sprague Dawley mâles et/ou femelles (200–250 g; 8–9 semaines) avec de l’isoflurane (ou un anesthésique injectable).
  2. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en touchant la cornée et en pinçant légèrement la patte postérieure gauche. Lorsque l’animal est correctement anesthésié, aucune réponse cornéenne ou patte ne sera observée.
  3. Injecter par voie sous-cutanée la patte postérieure glabre droite avec 100 μL de 1% (p/v) d’λ-carraghénane dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)20.
    1. Assurez-vous que des témoins appropriés sont utilisés, comme des rats naïfs sans isoflurane dans le présent rapport. Des études préliminaires indiquent que les rats naïfs avec ou sans isoflurane ont la même expression basale d’IL-6 épidermique et de NGF.
      REMARQUE: Les rats naïfs sont des témoins préférés pour les études sur l’inflammation, car une solution saline sous-cutanée ou PBS provoque une inflammation locale23,37.
  4. Évaluer l’œdème des rats C-II pour garantir l’efficacité du carraghénane (Figure 1)20. Déterminez la quantité d’œdème en mesurant l’épaisseur métatarsaire de la patte postérieure avec des étriers.
  5. À 6–12 h, euthanasier les rats avec du CO2 (ou un surdosage anesthésique injectable) et couper des morceaux de 1 mm x 2 mm de peau de patte postérieure glabre avec un scalpel pointu. Si une peau poilue est utilisée, rasez-la avant de couper les morceaux de peau de 1 mm x 2 mm.
    REMARQUE: Assurez-vous que les points temporels appropriés sont choisis en fonction des études spécifiques.
  6. À l’aide de pinces à microdissection, transférer la peau dans 1 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) froid de Dulbecco dans un tube de microcentrifugation sur glace et garder au froid pendant 15 à 60 minutes.

2. Séparation thermolysine de l’épiderme et du derme

  1. Préparer et activer la thermolysine.
    1. Préparer une solution de thermolysine, en ajoutant 5 mg de Geobacillus stearothermophilus à 10 mL de PBS, à pH = 8 (concentration 500 μg/mL).
    2. Préparer une solution 1 M de chlorure de calcium (CaCl2 anhydre) en ajoutant 1,11 g dans 10 mL de H2O distillé.
    3. Pour éviter l’autolyse de la thermolysine, ajouter 10 μL de chlorure de calcium à 10 mL de solution de thermolysine. La concentration finale de chlorure de calcium sera de 1 mM.
    4. Aliquote 1 mL de thermolysine activée dans 10 puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits sur glace.
  2. Utilisez la digestion enzymatique de la thermolysine pour séparer l’épiderme du derme.
    1. À l’aide de pinces à microdissection, transférez un échantillon de peau dans chaque puits de thermolysine activée. Assurez-vous de ne pas immerger la peau dans la solution de thermolysine.
    2. Tapotez doucement la peau sur le côté du puits pour aider à libérer l’échantillon de peau de la pince pour flotter sur la solution de thermolysine.
    3. Faites flotter la peau dans la solution de thermolysine avec la couche cornée (épiderme externe) vers le haut et le derme vers le bas. Il est essentiel que le derme soit face vers le bas, sinon la séparation effective n’aura pas lieu.
      REMARQUE: La durée d’incubation de la thermolysine doit être déterminée empiriquement par l’utilisateur final. La peau glabre de la patte postérieure des rats Sprague Dawley (200–250 g; 8–9 semaines) nécessite souvent 2,0–2,5 h pour la séparation. Le temps d’incubation devrait varier selon l’espèce et l’âge.
    4. Après le temps d’incubation approprié dans la thermolysine, utilisez des pinces à microdissection pour transférer un échantillon de peau dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 6 puits avec 7 à 8 mL de DMEM froid (4 °C). Cela laisse plus de place pour la séparation de l’épiderme du derme.
    5. Plongez la peau dans le DMEM.
    6. Brossez doucement l’épiderme avec la pince autour du périmètre de la peau jusqu’à ce que l’épiderme presque translucide soit observé aux frontières. Si cela ne peut pas être réalisé, retournez l’échantillon de peau dans la solution de thermolysine pendant encore 15 à 30 minutes.
    7. Une fois que l’épiderme se sépare sensiblement du derme, tenez soigneusement l’épiderme et le derme avec une pince à microdissection et tirez très lentement l’épiderme du derme.
    8. Évaluez la translucidité de l’épiderme isolé et assurez-vous qu’il est optiquement cohérent. Voir la figure 2 pour un exemple d’échantillon d’épiderme de rat de 1 mm x 2 mm. S’il y a une variation dans la translucidité, alors la séparation appropriée n’a pas eu lieu.
  3. Inactiver la thermolysine à l’aide d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans les morceaux séparés de l’épiderme et du derme.
    ATTENTION: La thermolysine qui reste dans l’épiderme et le derme est toujours active et peut endommager les couches si elle n’est pas inactivée.
    1. Préparez une solution d’EDTA de 0,5 M. Pour ce faire, ajouter lentement 0,93 g d’EDTA dans 5 mL d’eau double distillée. Ajouter l’hydroxyde de sodium à la solution jusqu’à ce qu’elle se dissiper. Assurez-vous que le pH de la solution est d’environ 8,0.
    2. Créez une solution EDTA de 5 mM dans DMEM. Ajouter 0,25 mL de solution mère EDTA de 0,5 M à 25 mL de DMEM.
    3. Placer l’épiderme et le derme séparés dans la solution EDTA/DMEM de 5 mM à 4 °C pendant 30 min pour désactiver l’activité de la thermolysine.
  4. Évaluer l’épiderme avec l’histologie tinctoriale8,9,10.
    1. Fixer une partie de l’épiderme dans un formoline neutre à 10%, 4% de paraformaldéhyde ou 0,25% de paraformaldéhyde avec une solution d’acide picrique à 0,8% pendant 1 h à température ambiante (RT) avec agitation.
    2. Placer l’épiderme fixe dans du saccharose à 10% dans le PBS pendant 1 h à TA avec agitation.
    3. Congeler l’épiderme dans une matrice d’incorporation tissulaire pour le sectionnement. Couper des sections transversales de 14 μm à l’aide d’un cryostat et décongeler des sections sur des lames de microscope en verre revêtues de gélatine.
    4. Sécher les sections sur un réchauffeur à glissière et tacher avec une solution de travail de bleu de toluidine (TB; 10% TB dans 1% de chlorure de sodium) pendant 90 s. Appose couvre les lèvres avec un support de montage aqueux.
    5. Observez l’épiderme avec la microscopie à fond clair à 50x-250x.
      REMARQUE: Si une séparation correcte s’est produite, l’épiderme sera séparé proprement du derme et les cinq couches seront détectées: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum et stratum corneum. Un exemple d’épiderme séparé de la peau de rat peut être vu à la figure 3.

3. Extraction des protéines et analyse par transfert western

  1. Effectuer un transfert western sur les échantillons de tissus séparés en utilisant le protocole21publié précédemment.
  2. Homogénéiser l’épiderme dans 50 μL de tampon de lyse (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% de glycérol et 1% de Triton X-100) contenant un cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase et de la protéase.
  3. Centrifugez des échantillons à une vitesse maximale de 15 min à 4 °C et évaluez le surnageant pour la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines.
  4. Chargez des concentrations égales de protéines (30 μg) sur des gels SDS, effectuez une électrophorèse, puis transférez des protéines dans des membranes de nitrocellulose ou de PVDF.
  5. Bloquer les membranes avec 5% de lait pendant 2 h et incuber pendant la nuit dans un anticorps primaire (anti-NGF de souris, E12, 1:1000).
  6. Laver 3x avec PBS avec 0,3% d’interpolation pendant 10 min chacun et incuber avec un anticorps secondaire marqué (par exemple, IgG anti-souris de lapin marqué à la phosphatase alcaline).
  7. Utilisez un système de balayage pour évaluer le signal western blot (p. ex., substrat ECF et plateforme d’imagerie).

4. Immunohistochimie

  1. Placer les échantillons de tissus dans un fixateur pour une immunoréactivité optimale : 0,96 % (p/v) d’acide picrique et 0,2 % (p/v) de formaldéhyde dans un tampon phosphate de sodium de 0,1 M, pH = 7,321,22,23 pendant 4 h à RT. Transférer à 10 % de saccharose dans du PBS pendant la nuit à 4 °C.
  2. Effectuer une immunohistochimie standard sur les coupes tissulaires21,22,23.
  3. Incorporez l’épiderme des animaux dans un seul bloc congelé dans la matrice d’incorporation et coupez des sections de 10 à 30 μm sur un cryostat. Montez les sections sur des lames de microscope en verre recouvertes de gélatine et séchez-les à 37 °C pendant 2 h.
  4. Laver les sections pendant trois rinçages de 10 min dans le PBS et incuber pendant 24 à 96 h dans l’antisérum primaire [p. ex., anti-NGF de souris (E12, 1:2000)] et le produit génétique anti-protéique de lapin 9.9 (PGP 9.5, 1:2000) dilué dans du PBS contenant 0,3 % (p/v) de Triton X-100 (PBS-T) PBS-T avec 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,5 % de polyvinylpyrrolidone (PVP).
  5. Après l’incubation primaire de l’antiséum, rincer les sections trois fois pendant 10 min dans du PBS et incuber 1 h à RT dans Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (1:1000) et Alexa Fluor 555 donkey anti-souris IgG (1:1000) dilué dans PBS-T.
  6. Rincez les sections trois fois dans du PBS pendant 10 minutes et apposez des couvercles avec un milieu de montage non décolorant pour retarder la décoloration de l’immunofluorescence.

5. Isolement de l’ARN et synthèse de l’ADNc

  1. Effectuer une réaction en chaîne par polymérase inverse (RT-PCR) standard sur les échantillons de peau21. Isoler l’ARN total à l’aide d’une solution d’isothiocyanate de phénol et de guanidine.
  2. Effectuer une synthèse complémentaire de l’ADN par la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine Moloney.
  3. Utilisez les séquences d’amorce suivantes pour l’amplification NGF et IL-6 :
    NGF (Sens) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF (Antisense) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    IL-6 (Sens) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
    IL-6 (Antisens) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG
  4. Comparez les niveaux de NGF et d’ARNm IL-6 au gène d’entretien ménager de la β-actine :
    β-ACTIN (Sens) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
    β-ACTIN (Antisense) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. Évaluer avec la RT-PCR qualitative à l’aide d’un cycleur thermique et la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) à l’aide d’un système qRT-PCR.

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Representative Results

L’injection de carraghénane dans la patte postérieure du rat a provoqué des symptômes classiques d’inflammation tels que rougeur et œdème16,17. Le gonflement de la patte postérieure a été mesuré avec des étriers mécaniques20. Une valeur de référence de l’épaisseur de la patte a été obtenue pour chaque rat avant le traitement au carraghénane et mesurée à nouveau à 6 h et 12 h. L’épaisseur des pattes a été considérablement augmentée par rapport aux valeurs de référence (Figure 1).

L’incubation de la thermolysine de la peau glabre de la patte postérieure du rat a produit une feuille d’épiderme. La microscopie en champ clair a été utilisée pour évaluer l’efficacité de la séparation thermolysine de l’épiderme et du derme (Figure 2). Les couches de l’épiderme pourraient être déterminées lors de la mise au point à travers la feuille à un grossissement plus élevé. La coloration bleu toluidine des coupes transversales épidermiques a montré que l’épiderme était séparé du derme au niveau de la membrane basale (Figure 3). Les crêtes épidermiques (chevilles épidermiques) ainsi que les indentations des papilles dermiques étaient intactes. Toutes les couches de cellules kératinocytes ont été observées.

Le transfert western de l’épiderme séparé par la thermolysine a produit des résultats cohérents indiquant des niveaux de protéines stables au cours de la technique à 4 ° C. Très peu de protéines NGF ont été détectées dans l’épiderme naïf du rat, mais les niveaux de protéines NGF ont été régulés à la hausse (250%) après 6 h de C-II par rapport aux animaux naïfs(Figure 4). Après 12 h de C-II, les taux de NGF ont été réduits par rapport à 6 h, mais sont restés élevés (55 %) par rapport aux témoins. L’immunohistochimie pour le NGF dans l’épiderme séparé a fourni une immunocoloration fiable et a confirmé les résultats des transferts de Western (Figure 5). L’immunoréactivité NGF (ir) n’a pas été détectée dans l’épiderme témoin naïf, mais à 6 h C-II, il y avait du NGF-ir dans la plupart des kératinocytes de la couche granulosum et de la strate lucidum. Quelques cellules de la couche spinosum étaient immunoréactives (IR) au NGF à 6 h C-II. À 12 h C-II, le NGF-ir s’est produit dans les kératinocytes de la couche granulosum et de la stratum lucidum avec certaines cellules de la couche granulosum intensément NGF-IR. À aucun moment, le NGF-ir n’a été détecté dans la couche basale ou la couche cornée. PGP9.5-IR intraépidermique, fibres nerveuses variqueuses étaient présentes dans l’épiderme séparé de rats naïfs et C-II (Figure 5).

La RT-PCR qualitative a démontré qu’il y avait un ARNm de bonne qualité provenant de l’épiderme séparé par la thermolysine (Figure 6A, Figure 7A). En utilisant l’actine comme gène d’entretien ménager pour la PCR quantitative en temps réel, l’expression de l’ARNm NGF dans l’épiderme au cours de C-II était significativement élevée (>3 fois) à 6 h par rapport aux rats naïfs(Figure 6B). À 12 h, l’ARNm NGF est revenu aux niveaux de base(Figure 6B). En utilisant l’actine comme gène d’entretien ménager pour la PCR quantitative en temps réel, l’ARNm IL-6 dans l’épiderme au cours de C-II était significativement élevé (>6 fois) à 6 h par rapport aux rats naïfs(Figure 7B). À 12 h, les niveaux d’ARNm IL-6 ont chuté de manière significative par rapport aux quantités de 6 h, mais sont restés élevés (2 fois) par rapport aux rats naïfs(Figure 7B).

Figure 1
Figure 1 : L’injection de carraghénane produit un œdème de la patte.
Une valeur de référence a été obtenue pour chaque rat avant le traitement au carraghénane. Après 6 h et 12 h de traitement, l’épaisseur de la patte a augmenté de manière significative par rapport aux valeurs de base. Les résultats sont exprimés comme le SEM avec six rats par traitement (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; le test t de l’élève, non appaire, à deux queues, a été effectué à chaque point temporel). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : La thermolysine produit une feuille d’épiderme.
La microscopie en champ clair a révélé une feuille épidermique translucide d’environ 1 mm x 2 mm. Les couches de l’épiderme pourraient être déterminées lors de la mise au point à travers la feuille à un grossissement plus élevé. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Coloration bleu toluidine de l’épiderme.
La microscopie en champ clair a déterminé que la thermolysine provoquait une séparation efficace de l’épiderme du derme. Des crêtes épidermiques (chevilles épidermiques; pointes de flèches) ont été observées ainsi que des indentations de papilles dermiques (flèches). Toutes les couches de cellules kératinocytes étaient intactes. SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum, SC: stratum corneum. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Expression de la protéine NGF dans l’épiderme au cours de l’inflammation induite par le carraghénane.
Les niveaux de NGF ont augmenté (250%) après 6 h d’inflammation par rapport aux animaux naïfs. Après 12 h, les niveaux ont été réduits par rapport à 6 h mais étaient élevés (55%) contrairement aux animaux naïfs. Les résultats sont exprimés en SEM avec trois rats par groupe (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; le test t de l’élève, non appaire, à deux queues a été effectué à chaque point temporel) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Immunoréactivité (ir) NGF et PGP9.5 pendant C-II.
Les colonnes A, B, C montrent la coloration nucléaire NGF-ir, PGP9.5-ir et DAPI, tandis que les colonnes A1-C1 ne montrent que NGF-ir. Dans toutes les images, la couche cornée est vers la gauche et la couche basale vers la droite. Le NGF-ir n’a pas été détecté dans l’épiderme témoin naïf (A, A1). À 6 h C-II (B,B1),le NGF-ir était présent dans la plupart des kératinocytes de la couche granulosum (flèches courtes) et de la strate lucidum (flèches longues). Quelques cellules de la strate spinosum étaient NGF-ir à 6 h C-II (grandes pointes de flèche). À 12 h C-II (C,C1),le NGF-ir s’est produit dans les kératinocytes de la couche granulosum et de la stratum lucidum (flèches longues) avec certaines cellules de la strate granulosum intensément NGF-ir (flèches courtes). À aucun moment, le NGF-ir n’a été détecté dans la couche basale ou la couche cornée. Des fibres nerveuses intraépidermiques PGP9.5-ir étaient présentes dans l’épiderme séparé de rats naïfs et C-II (petites pointes de flèche, A-C). SB: stratum basale, SS: stratum spinosum, SG: stratum granulosum, SL: stratum lucidum. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : ARNm NGF pendant l’inflammation induite par le carraghénane.
L’expression de l’ARNm NGF dans l’épiderme séparé par la thermolysine au cours de C-II a été évaluée par PCR qualitative(A)et PCR quantitative en temps réel(B). Les transferts qualitatifs d’ARNm (A) pour le NGF et l’actine ont démontré qu’il y avait un ARNm de bonne qualité qui pouvait être évalué pendant l’inflammation. L’expression de l’ARNm NGF dans l’épiderme au cours de C-II a été évaluée par PCR quantitative en temps réel en utilisant l’actine comme gène d’entretien ménager (B). L’ARNm NGF était significativement élevé (>3 fois) après 6 h de C-II par rapport aux rats naïfs non traités, mais les niveaux sont revenus à l’inclusion à 12 h (B). Les résultats sont exprimés en SEM avec trois rats par groupe (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; le test t de l’élève, non appaire, à deux queues a été effectué à chaque point temporel). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : ARNm IL-6 pendant l’inflammation induite par le carraghénane.
L’expression de l’ARNm IL-6 dans l’épiderme séparé par la thermolysine au cours de C-II a été évaluée par PCR qualitative(A)et PCR quantitative en temps réel(B). Des transferts qualitatifs d’ARNm (A) pour l’IL-6 et l’actine ont montré qu’il y avait un ARNm de bonne qualité pour l’évaluation pendant l’inflammation. L’expression de l’ARNm IL-6 dans l’épiderme au cours de C-II a été évaluée par PCR quantitative en temps réel en utilisant l’actine comme gène d’entretien ménager (B). L’ARNm IL-6 était significativement élevé (>6 fois) après 6 h de C-II par rapport aux rats naïfs non traités (B). À 12 h, les taux d’ARNm IL-6 ont été réduits de manière significative par rapport aux niveaux de 6 h, mais sont restés élevés (2 fois) par rapport aux rats naïfs (B). Les résultats sont exprimés comme la moyenne S.E.M. avec deux rats par groupe (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, le test t de l’élève, non appaire, à deux queues a été effectué à chaque point temporel). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’étude a déterminé que l’épiderme de la peau glabre de la patte postérieure du rat était facilement séparé du derme à l’aide de la thermolysine (0,5 mG / mL) dans le PBS avec 1 mM de chlorure de calcium à 4 ° C pendant 2,5 h. L’évaluation histologique a indiqué que l’épiderme était séparé du derme au niveau de la membrane basale et que les crêtes épidermiques étaient intactes. La thermolysine est une métalloendopeptidase extracellulaire produite parBacillus thermoproteolyticus24à Gram positif(Geo). Son activité est stable à 4 °C mais est fonctionnelle sur une large gamme de températures10,24,25. Cette enzyme a été largement utilisée pour la chimie des protéines24,25, mais plusieurs groupes ont montré son application pour la séparation de la peau en feuilles épidermiques et / ou dermiques4,8,10,26,27. Walzer et al. ont été les premiers à signaler une séparation épidermique-cutanée de la peau humaine à l’aide de la thermolysine à 4 °C (250–500 μg/mL pendant 1 h)10. Avec la microscopie optique et électronique, il a été déterminé que la séparation se produisait au niveau de la membrane basale épidermique entre la laminine et le site d’antigène pemphigoïde bulleux10.

De plus, les hémidesmosomes, les fixations des kératinocytes basaux à la membrane basale, ont été perturbés sélectivement10,29. Rakhorst et al. ont comparé la thermolysine (4 °C, 500 μg/mL, pendant la nuit) à la dispase pour la séparation épidermique-cutanée de la muqueuse buccale du lapin8. La thermolysine était incomplète dans la séparation de l’épiderme muqueux du derme, ce qui signifie que des différences peuvent survenir pour les espèces, le temps d’incubation, la composition de la solution (pas de CaCl2 pour empêcher l’autolyse de la thermolysine24),la source de thermolysine et/ou les différences spécifiques au site indiquées dans d’autres études10,26,27. Les utilisateurs finaux du protocole actuel doivent s’assurer d’utiliser de la thermolysine fraîche et toujours inclure du chlorure de calcium, mais doivent également être conscients de ces limitations potentielles.

Bien que certains chercheurs aient utilisé la thermolysine à 37 °C26,29, les utilisateurs de ce protocole doivent garder à l’esprit de maintenir le tissu cutané à 4 °C pour préserver la stabilité des protéines et de l’ARNm. Nous avons utilisé le DMEM à 4 °C comme solution pour la peau avant et après la séparation des thermolysines en raison de son utilité pour maintenir les cellules en culture28, et il a été utilisé précédemment pour la séparation de la peau avec la thermolysine8,26,27,30,31. Cependant, Walzer et al. ont utilisé du PBS stérile complété par 200 μG/mL de streptomycine, 200 U/mL de pénicilline et 2,5 μg/mL de fungizone10,tandis que d’autres ont utilisé des milieux différents (par exemple, des milieux de culture de kératinocytes exempts de facteur de croissance épidermique) suivis d’un rinçage PBS29.

Dans le protocole, la séparation des thermolysines a été réalisée dans 500 μg/mL de thermolysine et 5 mM de chlorure de calcium dans du PBS (pH = 8), similaire à la méthode originale10. Le DMEM a été utilisé comme solution pour la séparation des thermolysines à 4 °C (pendant la nuit)8, et le tampon HEPES a été utilisé efficacement avec une solution de thermolysine de 500 μG/mL à 37 °C pendant 2 h29. Cependant, nous n’avons pas exploré comment le milieu de culture ou d’autres tampons affectent l’activité de la thermolysine pour la séparation épidermique-cutanée. Le chlorure de calcium est un ajout important pour diminuer l’autolyse de la thermolysine24,32 et la délétion de cette étape peut entraîner un clivage incomplet de l’épiderme du derme8.

La taille de l’échantillon de peau semble influencer le temps nécessaire à l’incubation de la thermolysine et l’efficacité du clivage enzymatique de l’épiderme du derme. Les chercheurs doivent évaluer la taille de l’échantillon et le temps d’incubation appropriés pour leurs propres tissus. Faire flotter les échantillons sur la solution de thermolysine avec l’épiderme tourné vers le haut est important pour une efficacité enzymatique optimale10. Comme indiqué précédemment, le site d’action de la thermolysine se situe au niveau des hémidesmosomes kératinocytes et de la membrane basale4,10,29; par conséquent, la thermolysine agit vers l’intérieur à partir des bords de la peau. D’après notre expérience, les bords de la peau se séparent plus tôt que le milieu de l’échantillon, et il est important de prévoir suffisamment de temps pour un décolleté enzymatique complet. Lorsque le décolleté est terminé, l’épiderme doit s’éloigner facilement du derme. S’il est toujours attaché, le tiraillement sur les couches peut faire disparaître des parties du derme avec l’épiderme.

Une limitation de la technique de la thermolysine est le temps requis. L’augmentation de la concentration de thermolysine au-delà de 500 μG/mL ne diminue pas le temps de séparation et la conservation de l’épiderme à des concentrations plus élevées10. Les méthodes de séparation épidermo-cutanée ont été revues récemment4, et de nombreuses méthodes prennent 30 à 60 min à 20-40 ° C. La séparation de la peau par la chaleur (50–60 °C) se produit rapidement (30 s à 10 min)4, mais les protéines et l’ARNm sont connus pour se dégrader rapidement à des températures aussi élevées. Alternativement, le thiocyanate de sodium (2 N) à RT peut être une technique de séparation rapide acceptable (5 min)4,6, mais l’intégrité des protéines et de l’ARNm n’a pas été étudiée avec cette méthode6. La méthode de la thermolysine froide a été choisie pour la préservation des protéines et de l’ARNm, mais aucune comparaison directe n’a été faite entre l’intégrité des protéines et de l’ARNm à l’aide d’autres techniques.

Dans la présente étude, la digestion thermolysine froide s’est avérée être une méthode efficace pour séparer l’épiderme du derme pour l’évaluation des altérations de l’ARNm et des protéines pendant l’inflammation. Au cours de l’inflammation induite par le carraghénane, les niveaux d’ARNm et de protéines NGF et les niveaux d’ARNm IL-6 ont été élevés à 6 h, revenant près de la ligne de base à 12 h. Avec l’immunohistochimie, l’immunoréactivité du NGF a augmenté dans les kératinocytes à 6 h et 12 h. Un avantage de la méthode thermolysine est la possibilité d’effectuer une analyse sélective du site. Par exemple, l’augmentation de la production de NGF et d’IL-6 dans la présente étude provient des kératinocytes, puisque les cellules dermiques sont exclues des essais. Cette méthode permet de mieux comprendre l’emplacement et les types de médiateurs pour la sensibilisation des terminaux afférents primaires33. En outre, cette méthode permet de mieux comprendre l’évolution temporelle de la production de neurotrophine ainsi que l’absorption et le transport dans les afférents primaires au cours de l’inflammation34,35.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Acknowledgments

Le financement de cette recherche a été fourni par les National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
λ-carrageenan Millipore Sigma 22049 Subcutaneous injection of carrageenan induces inflammation
7500 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107 For RT-PCR analysis
Calcium chloride (CaCl2), anhydrous Millipore Sigma 499609 Prevents autolysis of thermolysin
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium Millipore Sigma C0612 Aqueous mounting medium after toluidine blue staining
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-31570 Secondary antibody for immunohistochemistry
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21206 Secondary antibody for immunohistochemistry
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11966-025 To maintain tissue integrity
Ethylenediaminetetraacetic acid Millipore Sigma E6758 Stops thermolysin reaction
Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) Reverse transcriptase Promega M1701 For complementary DNA synthesis
Mouse anti-NGF Antibody (E-12) Santa Cruz Biotechnology sc-365944 For neurotrophin immunohistochemistry
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 To retard immunofluorescence quenching
Rabbit anti-PGP 9.5 Cedarlane Labs CL7756AP For intraepidermal nerve staining
SAS Sprague Dawley Rat Charles River Strain Code 400 Animal used for inflammation studies
Shandon M-1 Embedding Matrix Thermo Fisher Scientific 1310TS Tissue embedding matrix for tinctorial- and immuno-histochemistry
SimpliAmp Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific A24811 For RT-PCR analysis
SYBR Select Master Mix Thermo Fisher Scientific 4472908 For RT-PCR analysis
Thermolysin Millipore Sigma T7902 From Geobacillus stearothermophilus
Toluidine Blue Millipore Sigma 89640 For tinctorial staining for brightfield microscopy
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 For total RNA extraction for RTPCR

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Immunologie et infection numéro 175 épiderme thermolysine facteur de croissance nerveuse interleukine-6 inflammation qPCR western blotting immunohistochimie
Séparation de l’épiderme et du derme du rat avec la thermolysine pour détecter l’ARNm et la protéine inflammatoires spécifiques au site
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Gujar, V., Anderson, M. B., Miller, K. E., Pande, R. D., Nawani, P., Das, S. Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein. J. Vis. Exp. (175), e59708, doi:10.3791/59708 (2021).

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