Methodenartikel

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

DOI:

10.3791/59725

⸱

23. August 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menschliche Darmmikroorganismen sind in letzter Zeit zu einem wichtigen Ziel der Forschung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit und der Prävention von Krankheiten geworden. Daher sind Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika (z.B. Medikamente und Präbiotika) und Darmmikrobiota zu einem wichtigen Forschungsthema geworden. In-vivo-Experimente mit menschlichen Freiwilligen sind jedoch aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen nicht ideal für solche Studien. Als Ergebnis wurden Tiermodelle verwendet, um diese Wechselwirkungen in vivo zu bewerten. Dennoch sind Tiermodellstudien nach wie vor durch bioethische Überlegungen begrenzt, zusätzlich zu unterschiedlichen Zusammensetzungen und Diversitäten von Mikrobiota bei Tieren und Menschen. Eine alternative Forschungsstrategie ist der Einsatz von Batch-Fermentationsexperimenten, die eine Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Darmmikrobiota in vitro ermöglichen. Zur Bewertung dieser Strategie wurden bifidobakterielle (Bif) Exopolysaccharide (EPS) als repräsentatives Xenobiotikum verwendet. Anschließend wurden die Wechselwirkungen zwischen Bif EPS und humaner Darmmikrobiota mit verschiedenen Methoden wie dünnschichtige Chromatographie (TLC), kompositorische Analyse der bakteriengemeinschaft mit 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Gaschromatographie untersucht. von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssystemen vorgestellt. Wichtig ist, dieses Protokoll kann auch geändert werden, um allgemeine Wechselwirkungen zwischen anderen Endobiotika und Darmmikrobiota zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gut Mikrobiota spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des menschlichen Darms und in der Wirtgesundheit. Folglich sind Darmmikrobiota in letzter Zeit ein wichtiges Ziel für die Prävention und Therapie von Krankheiten geworden1. Darüber hinaus interagieren Darmbakterien mit Wirtsdarmzellen und regulieren grundlegende Wirtsprozesse, einschließlich stoffwechselnder Aktivitäten, Nährstoffverfügbarkeiten, Modulation des Immunsystems und sogar Gehirnfunktion und Entscheidungsfindung2,3 . Endobiotika haben erhebliches Potenzial, die bakterielle Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobiota zu beeinflussen. So, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota haben zunehmende Forschungsaufmerksamkeitangezogen 4,5,6,7,8,9.

Es ist schwierig, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota in vivo aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen zu bewerten. Zum Beispiel können Experimente, die die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen, nicht ohne Erlaubnis der Food and Drug Administration durchgeführt werden, und die Rekrutierung von Freiwilligen ist teuer. Daher werden für solche Untersuchungen häufig Tiermodelle verwendet. Die Verwendung von Tiermodellen ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Mikrobiotazusammensetzungen und Diversität in tier- und menschenverbundenen Gemeinschaften begrenzt. Eine alternative In-vitro-Methode zur Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota ist der Einsatz von Batch-Kulturexperimenten.

Exopolysaccharide (EPS) sind Präbiotika, die wesentlich zur Erhaltung der menschlichen Gesundheit beitragen10. Verschiedene EPS, die aus verschiedenen Monosaccharid-Zusammensetzungen und -Strukturen bestehen, können unterschiedliche Funktionen aufweisen. Frühere Analysen haben die Zusammensetzung der Bif EPS bestimmt, die das repräsentative Xenobiotikum sind, das in der aktuellen Studie11ins Visier genommen wird. Die wirtassoziierten metabolischen Effekte wurden jedoch hinsichtlich der EPS-Zusammensetzung und -Vielfalt nicht berücksichtigt.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet die fäkale Mikrobiota von 12 Freiwilligen, um Bif EPS zu fermentieren. Die Dünnschichtchromatographie (TLC), die 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und die Gaschromatographie (GC) werden dann in Kombination verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen EPS und humaner Darmmikrobiota zu untersuchen. Deutliche Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu In-vivo-Experimenten sind seine niedrigen Kosten und die Vermeidung von störenden Effekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Darüber hinaus kann das beschriebene Protokoll in anderen Studien verwendet werden, die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) und der Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, China).

1. Herstellung von Bakterien

  1. Zubereitung von Bifidobacterium mittlerer Brühe
    1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in 950 ml destilliertem Wasser: Fleischextrakt, 5 g/L; Hefeextrakt, 5 g/L; Casein-Pepton, 10 g/L; Soytone, 5 g/L; Glukose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO47H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 ml; Salzlösung, 40 ml (CaCl2.2H2O, 0,25 g/l; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); und Resazurin, 0,4 ml (2,5 mg/L). Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 2 M NaOH ein.
    2. Autoklav bei 121 °C für 15 min und lassen Sie die Brühe auf Raumtemperatur (RT) unter anaeroben Bedingungen abkühlen (10% H2, 10% CO2, 80% N2). Filtersterilisiertes Cystein-HCl (0,5 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) zum Medium hinzufügen.
  2. Fügen Sie ein Aliquot (50 l) gefrorenes Bifidobacterium longum zu einem Kulturrohr mit 5 ml Bifidobacterium-Mediumbrühe unter anaeroben Bedingungen hinzu, dann Kultur in einem anaeroben Inkubator für 24 h bei 37 °C.

2. Herstellung von bifidobakteriellen EPS

  1. Vorbereitung des PYG-Agarmediums
    1. Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 20 g/L; Hefeextrakt, 10 g/L; Glukose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO47H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/l; KH2PO4, 0,04 g/l; NaHCO3, 0,4 g/L; Agar, 12 g/L. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 7,2 ein.
    2. Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min und kühlen Sie auf 50 °C. Dann, pro 1 L Medium, 0,5 ml filtersterilisierte Vitamin K1 Lösung (1 g Vitamin K1 gelöst in 99 ml 99% Ethanol), 5 ml Häminlösung (0,5 g Hämin gelöst in 1 ml 1 mol/L NaOH , dann bis zu 100 ml mit destilliertem Wasser) und 0,5 g Cystein-HCl.
    3. Vor dem Gießen der PYG-Platten, fügen Sie filtersterilisierte 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactopyranosid (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H2 O(5,7 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) auf das Medium.
      HINWEIS: X-Gal und LiCl.3H2O ermöglichen die Identifizierung von B. LongumKolonien auf Platten über Färbungsänderungen.
  2. 20 L B. Longum-Stämme (Schritt 1.2) auf PYG-Platten impfen und 72 h bei 37 °C in einen anaeroben Inkubator geben.
  3. Sammeln Sie Mukoid-Bakterienkolonien aus den PYG-Platten mit einem Wägelöffel, dann vollständig in 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) mit einem Wirbeloszillator wieder aufsetzen.
    HINWEIS: Die Bakteriellen und EPS-Mischungen sollten vollständig durch Wirbeln oder Pipettieren nach oben und unten wiederholt resuspendiert werden, bis die Fasern vollständig in PBS gelöst sind.
  4. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 6.000 x g für 5 min.
  5. Die Überstande vorsichtig auf ein neues Zentrifugenrohr übertragen und durch wiederholte Inversion und Mischung vollständig mit drei Volumen kaltem 99% Ethanol vermischen.
  6. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 6.000 x g für 5 min und entfernen Sie die Überräube vollständig.
  7. Entfernen Sie die Ausscheide aus den Zentrifugenrohren, indem Sie die EPS-Extrakte über Nacht mit einem Geschwindigkeitsvakuum kratzen und trocknen.

3. Herstellung des Fermentationsmediums

  1. Vorbereitung des Grundkulturmediums VI
    1. Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 3 g/L; Trypton, 3 g/L; Hefeextrakt, 4,5 g/L; Mucin, 0,5 g/L; Gallensalze Nr. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2bei 6H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/l; MgSO4bei 7H2O, 3,0 g/L; MnCl24H2O, 0,32 g/L; FeSO47H2O, 0,1 g/L; CoSO47H2O, 0,18 g/L; CaCl22 H2O, 0,1 g/L; ZnSO4bei 7H2O, 0,18 g/L; CuSO4bei 5H2O, 0,01 g/L; und NiCl26H2O, 0,092 g/L. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 mit 1 M HCl ein.
    2. Bereiten Sie Hämin und Cystein wie in Abschnitt 2.1 getan und nach dem Autoklavieren und Kühlen hinzufügen.
  2. Bereiten Sie Kulturmedien vor, die verschiedene Kohlenstoffquellen enthalten, mit einem VI-Basismedium. Vor dem Autoklavieren 8 g/L Bif EPS-Fasern zu Medium VI hinzufügen, bestehend aus Gruppe VI_Bif. Fügen Sie außerdem 8 g/L Stärke zu Medium VI hinzu, um Die Gruppe VI_Starch darzustellen. Schließlich wird Medium VI ohne Zugabe einer Kohlenstoffquelle als Steuerung verwendet (Gruppe VI).
    HINWEIS: Bif EPS und Stärke werden zunächst in heißem Wasser mit einem magnetischen Rührer gelöst und dann mit vorbereitetem VI-Medium gemischt.
  3. Alle Medien bei 121 °C für 15 min autoklavieren und auf RT abkühlen lassen.
  4. Übertragen Sie eine Unterprobe (5 ml) jedes Mediums in Kulturröhren in einem anaeroben Inkubator und lagern Sie die restlichen Medien bei 4 °C.

4. Humane Fäkalienprobenvorbereitung

  1. Sammeln Sie frische Fäkalienproben unmittelbar nach frischer Defäkation von gesunden erwachsenen menschlichen Freiwilligen mit Kotbehältern und anschließend für die Güllezubereitung.
    HINWEIS: Vor der Probenentnahme sollten alle Freiwilligen gescreent werden, um sicherzustellen, dass antibiotika, probiotische oder präbiotische Behandlungen mindestens 3 Monate vor der Entnahme von Proben nicht erhalten werden. Darüber hinaus müssen alle Spender eine informierte, schriftliche Zustimmung erteilen.
  2. Eine frische Fäkalienprobe (1 g) auf 10 ml 0,1 M anaerobe PBS (pH 7,0) in Glasbecher geben, dann Glasstäbe verwenden, um eine 10% (w/v) Gülle zuzubereiten.
  3. Verwenden Sie ein 0,4 mM Großes Sieb, um die Fäkalienschlämme zu filtern. Verwenden Sie dann eine Unterprobe der gefilterten Gülle, um Diefermentationsexperimente zur Chargenkultur zu impfen, und lagern Sie den Rest bei -80 °C für weitere Analysen.
    HINWEIS: Die Schritte 4.2–4.3 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.

5. In-vitro-Chargenfermentation

  1. In Schritt 3.2 in einer anaeroben Kammer hergestellte gefilterte Fäkalienschlämme (500 l) in das Fermentationsmedium geben und dann bei 37 °C inkubieren.
  2. Sammeln Sie 2 ml fermentierte Proben bei 24 h und 48 h in der anaeroben Kammer und zentrieren Sie dann außerhalb der Kammer bei 6.000 x g für 3 min.
  3. Übertragen Sie die Überstande sorgfältig auf ein neues Zentrifugenrohr, das für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) verwendet wird.
  4. Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei -80 °C auf und verwenden Sie anschließend die bakterielle genomische DNA-Extraktion.

6. EPS-Abbau durch menschliche Fäkalienmikrobiota

  1. 0,2 l fermentierte Überstoffe auf vorbeschichtete Kieselgel-60 TLC-Aluminiumplatten geben und anschließend mit einem Haartrockner trocknen.
  2. Entwickeln Sie die Platten in 20 ml einer Ameisensäure/n-Butanol/Wasser (6:4:1, v:v:v) Lösung und trocknen Sie mit einem Haartrockner.
  3. Die Teller im Orcinol-Reagenz einweichen, um zu färben, dann trocknen Sie mit einem Haartrockner.
    1. Bereiten Sie Orcin-Reagenzien vor, indem Sie 900 mg Lichenol in 25 ml destilliertem Wasser auflösen und dann 375 ml Ethanol hinzufügen. Anschließend sollte konzentrierte Schwefelsäure langsam zugesetzt und die Lösung gründlich vermischt werden.
  4. Hitzeplatten bei 120 °C für 3 min im Backofen und bewerten Denkwert von EPS durch Messung von TLC-Bändern.

7. Auswirkungen von EPS auf die menschliche Darmmikrobiota

  1. Gefrieren Sie die in Schritt 4.3 hergestellten Originalfäkalienproben und die in Schritt 5.4 hergestellten fermentierten Proben.
  2. Extrahieren Sie bakterielle genomische DNA (gDNA) aus allen Proben mit einem Stuhl bakterielle genomische DNA-Extraktionkit nach den Anweisungen des Herstellers.
  3. Bestimmen Sie DNA-Konzentrationen, Integrasse und Größenverteilungen mit einem Mikrospektrophotometer und einer Agargelelektrophorese.
  4. Führen Sie PCR von bakteriellen 16S rRNA-Genen aus der extrahierten gDNA mit den zuvor beschriebenen Vorwärts- und Reverse-Primern12:
    -Vorwärtsgrundierung (Barcode-Primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
    -Reverse Primer (806R): GGACTACHVGGWTCTAAT
    Verwenden Sie die folgenden thermischen Cycler-Bedingungen:
    1. 94 °C für 5 min.
    2. 94 °C für 30 s.
    3. 55 °C für 30 s.
    4. 72 °C für 1 min.
    5. Wiederholen Sie 2–4 für 35 Zyklen
    6. 72 °C für 5 min.
    7. 4 °C halten bis zum Entfernen aus dem thermischen Cycler.
  5. Führen Sie die Sequenzierung von PCR-Produkten mit hohem Durchsatz bei einem DNA-Sequenzierungsunternehmen mithilfe einer mikrobiellen Community-Analyse mit ultrahohem Durchsatz durch.
  6. Erhalten Sie saubere, qualitativ hochwertige Sequenzen mit der Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) Sequenzanalysepipeline13.
  7. Definieren Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs) für 16S rRNA-Gensequenzen mit einer Nukleotidähnlichkeit von mehr als 97 % mithilfe von Bioinformatik-Tools wie der Mothur Software Suite14.
  8. Wählen Sie aus jeder OTU eine repräsentative Sequenz aus, und verwenden Sie den RDP-Klassifikator zusammen mit der taxonomischen SILVA-Datenbank, um repräsentative Sequenzen15zu klassifizieren.
  9. Berechnen Sie Goods Abdeckung, Alpha-Diversitätsmetriken (einschließlich Simpson- und Shannon-Index) und Reichtum (beobachtete Anzahl von OTUs) mit Bioinformatik-Tools16.

8. Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion durch menschliche Darmmikrobiota

  1. In Schritt 5,3 bis 2 ml Zentrifugenrohren fermentierte Überräube (1 ml) hinzufügen.
  2. Fügen Sie 0,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure zu jeder der Proben hinzu und mischen Sie die Lösungen gründlich durch Wirbeln.
  3. Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 x g für 20 min und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche.
  4. Gleichzeitig Lösungen von 120 mM Essig-, Propion-, Butyric-, isobutyric-, Valeric- und Isovalersäuren vorbereiten. Dann 1 ml jeder vorbereiteten Säure zu 1,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure hinzufügen und als Standardcocktails verwenden.
  5. Filtern Sie die Proben mit einer 0,22-M-Membran.
  6. SCFA-Konzentrationen mit Hochleistungsgaschromatographie gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen11,17erkennen.
    HINWEIS: Für die Gaschromatographie (GC) wird eine InertCap FFAP-Säule (0,25 mM x 30 m x 0,25 m) verwendet. Die SCFA-Konzentrationen werden dann anhand von Spitzenbereichen mithilfe der internen Single-Point-Standardmethode im GC Solution-Softwarepaket quantifiziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Produktion von Schleimhaut EPS konnte in B. Longumkulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 h beobachtet werden (Abbildung 1A). Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS (Abbildung 1B). Getrocknetes EPS und lösliche Stärke wurden dann als Kohlenstoffquellen für Fermentationskulturen verwendet. TLC wurde für die Oligosaccharid-Trennung und Reinheitsanaly...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung und Der Aktivitäten der menschlichen Darmmikrobiota erzielt. Als Folge dieser Studien ist das holobionische Konzept entstanden, das die Wechselwirkungen zwischen Wirten und assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften darstellt, wie z.B. zwischen Menschen und ihrer Darmmikrobiota19,20. Darüber hinaus werden Menschen sogar jetzt als Superorganismen betrachtet

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Die Zahlen wurden in Yin et al.zitiert. 11.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der National Nature Science Foundation of China (Nr. 31741109), der Hunan Natural Science Foundation (Nr. 2018JJ3200) und dem Konstruktprogramm der angewandten charakteristischen Disziplin an der Hunan University of Science and Engineering finanziert. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für seine sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 &Mikro; m MembranfilterMilliporeSLGP033RBZur Filterung von Proben
0,4-mm-SiebThermo Fischer308080-99-1Zur Vorbereitung von menschlichen Stuhlproben
5-Brom-4-chlor-3-indolyl β-D-Galactopyranosid (X-Gal)SolarbioX1010Zur Vorbereitung der Farbplatte
EssigsäureSigma-Aldrich71251Standardprobe für SCFA-Agar
SolarbioYZ-1012214Die Komponente der
Medium Anaerobe KammerElectrotek AW 400SGBakterienkultur und Fermentation
AutoklavSANYOMLS-3750Verwendung zum Autoklavieren
von Bacto SojatonSigma-Aldrich70178Die Komponente des Mediums
BackofenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240AZum Erhitzen und Backen
RindfleischextraktSolarbioG8270Die Komponente des Mediums
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™Bakterien
GallensalzeSolarbioYZ-1071304Die Komponente des Mediums
Buttersäure Sigma-Aldrich19215Standardprobe für SCFA
CaCl2SolarbioC7250Salzlösung des Mediums
KapillarsäuleSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 mm & mal 30 m - 0,25 % / mu; m)Wird zur SCFA-Detektion
verwendet Kasein, PeptonSigma-Aldrich39396Die Komponente der
Medium ZentrifugeThermo ScientificSorvall ST 8Verwendung für die Zentrifugation
CoSO4.7H2OSolarbioC7490Die Komponente des Mediums
CuSO4.5H2OSolarbio203165Die Komponente des Mediums
Cystein-HClSolarbioL1550Die Komponente des Mediums
Ethanol Sigma-AldrichE7023Zur Herstellung von Vitamin K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614Die Komponente des Mediums
AmeisensäureSigma-Aldrich399388Wird für die DC-Gaschromatographie
verwendet Shimadzu CorporationGC-2010 PlusWird für die SCFA-Detektion
von Glasbechernverwendet Fisher ScientificFB10050Wird für die Schlammvorbereitung
verwendet GlukoseSolarbioG8760Die Komponente des Mediums
HaeminSolarbioH8130Die Komponente des Mediums
HClSigma-Aldrich30721Basische Lösung zur Einstellung des pH-Werts der
Puffer IsobuttersäureSigma-Aldrich46935-UStandardprobe für SCFA
IsovaleriansäurenSigma-Aldrich129542Standardprobe für SCFA
K2HPO4SolarbioD9880Salzlösung des Mediums
KClSolarbioP9921Bestandteil des Mediums
KH2PO4SolarbioP7392Salzlösung des Mediums
LiCl.3H2OSolarbioC8380Zur Herstellung von Farbplatten
FleischextraktSigma-Aldrich-Aldrich70164Bestandteil des Mediums
MetaphosphorsäureSigma-AldrichB7350Standardprobe für SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160Die Komponente des Mediums
MgSO47H2OSolarbioM8300Salzlösung des Mediums
MISEQIlluminaMiSeq 300PE SystemDNA-Sequenzierung
MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179Salzlösung des Mediums
MupirocinSolarbioYZ-1448901Antibiotikum
NaClSolarbioYZ-100376Salzlösung des Mediums
NaHCO3Sigma-Aldrich792519Salzlösung des Mediums
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000Bestimmung der DNA-Konzentrationen
NaOHSigma-Aldrich30620Basische Lösung zur Einstellung des pH-Werts der Puffer
n-ButanolChemSpider71-36-3Zur Gleichbehandlung
von NiCl2Solarbio746460Die Komponente des Mediums
OrcinolSigma-Aldrich447420Zur Herstellung von Orcinol-Reagenzien
PropionicSigma-Aldrich94425Standardprobe für SCFA
QIAamp DNA Stool Mini KitQIAGEN51504Extrakt bakterielle genomische DNA
Gebrauchsfertiges PBS-PulverSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Zur Herstellung der Lipidsuspension
ResazurinSolarbioR8150Anaerober
Gerätedrehzahl-VakuumkonzentratorLABCONCOCentriVapZur Herstellung von EPSs
StärkeSolarbioYZ-140602Zur Verwendung zur Kohlenstoffquelle
SchwefelsäureSigma-Aldrich150692Zur Herstellung von Orcin-Reagenzien
T100 PCRBIO-RADPCR-Amplifikation
TLC-AluminiumblecheMerckMillipore116835Wird zur TLC
von Trypticase PeptonSigma-AldrichZ699209verwendet Die Komponente des Mediums
TryptonSigma-AldrichT7293Die Komponente des Mediums
Tween 80SolarbioT8360Salzlösung des Mediums
ValericSigma-Aldrich75054Standardprobe für SCFA
Vitamin K1Sigma-AldrichV3501Die Komponente des Mediums
Vortex-OszillatorScientific IndustriesVortex.Genie2Verwendung zum Vortexen
HefeextraktSigma-AldrichY1625Die Komponente des Mediums
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251Die Komponente des Mediums
von verwenden 1861096

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309(2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099(2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576(2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889(2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

EndobiotikDarmmikrobiotaIn vitro FermentationBifidobakterielle EPSD nnschichtchromatographieGaschromatographie16S rRNA Sequenzierungkurzkettige Fetts urenanaerobe InkubationStuhlprobenvorbereitungPolysaccharidabbau

Verwandte Artikel