Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

Yunfei Hu; Huahai Chen; Ping Li; Baiyuan Li; Linyan Cao; Changhui Zhao; Qing Gu; Yeshi Yin

doi:10.3791/59725

Method Article

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

DOI:

10.3791/59725

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August 23rd, 2019

Yunfei Hu¹ , Huahai Chen¹ , Ping Li² , Baiyuan Li¹ , Linyan Cao¹ , Changhui Zhao¹ , Qing Gu² , Yeshi Yin¹

¹Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, ²College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

Summary

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Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.

Abstract

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Menschliche Darmmikroorganismen sind in letzter Zeit zu einem wichtigen Ziel der Forschung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit und der Prävention von Krankheiten geworden. Daher sind Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika (z.B. Medikamente und Präbiotika) und Darmmikrobiota zu einem wichtigen Forschungsthema geworden. In-vivo-Experimente mit menschlichen Freiwilligen sind jedoch aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen nicht ideal für solche Studien. Als Ergebnis wurden Tiermodelle verwendet, um diese Wechselwirkungen in vivo zu bewerten. Dennoch sind Tiermodellstudien nach wie vor durch bioethische Überlegungen begrenzt, zusätzlich zu unterschiedlichen Zusammensetzungen und Diversitäten von Mikrobiota bei Tieren und Menschen. Eine alternative Forschungsstrategie ist der Einsatz von Batch-Fermentationsexperimenten, die eine Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Darmmikrobiota in vitro ermöglichen. Zur Bewertung dieser Strategie wurden bifidobakterielle (Bif) Exopolysaccharide (EPS) als repräsentatives Xenobiotikum verwendet. Anschließend wurden die Wechselwirkungen zwischen Bif EPS und humaner Darmmikrobiota mit verschiedenen Methoden wie dünnschichtige Chromatographie (TLC), kompositorische Analyse der bakteriengemeinschaft mit 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Gaschromatographie untersucht. von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssystemen vorgestellt. Wichtig ist, dieses Protokoll kann auch geändert werden, um allgemeine Wechselwirkungen zwischen anderen Endobiotika und Darmmikrobiota zu untersuchen.

Introduction

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Gut Mikrobiota spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des menschlichen Darms und in der Wirtgesundheit. Folglich sind Darmmikrobiota in letzter Zeit ein wichtiges Ziel für die Prävention und Therapie von Krankheiten geworden¹. Darüber hinaus interagieren Darmbakterien mit Wirtsdarmzellen und regulieren grundlegende Wirtsprozesse, einschließlich stoffwechselnder Aktivitäten, Nährstoffverfügbarkeiten, Modulation des Immunsystems und sogar Gehirnfunktion und Entscheidungsfindung²^,³. Endobiotika haben erhebliches Potenzial, die bakterielle Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobi....

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Protocol

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Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) und der Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, China).

1. Herstellung von Bakterien

Zubereitung von Bifidobacterium mittlerer Brühe
1. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in 950 ml destilliertem Wasser: Fleischextrakt, 5 g/L; Hefeextrakt, 5 g/L; Casein-Pepton, 10 g/L; Soytone, 5 g/L; Glukose, 10 g/L; K₂HPO₄, 2,04 g/L; MgSO₄7H₂O, 0,22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 ml; Salzlösung, 40 ml (CaCl₂.2H_2<....

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Results

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Die Produktion von Schleimhaut EPS konnte in B. Longumkulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 h beobachtet werden (Abbildung 1A). Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS (Abbildung 1B). Getrocknetes EPS und lösliche Stärke wurden dann als Kohlenstoffquellen für Fermentationskulturen verwendet. TLC wurde für die Oligosaccharid-Trennung und Reinheitsanaly.......

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Discussion

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In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung und Der Aktivitäten der menschlichen Darmmikrobiota erzielt. Als Folge dieser Studien ist das holobionische Konzept entstanden, das die Wechselwirkungen zwischen Wirten und assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften darstellt, wie z.B. zwischen Menschen und ihrer Darmmikrobiota¹⁹^,²⁰. Darüber hinaus werden Menschen sogar jetzt als Superorganismen betrachtet

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Die Zahlen wurden in Yin et al.zitiert. ¹¹.

Acknowledgements

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Diese Studie wurde von der National Nature Science Foundation of China (Nr. 31741109), der Hunan Natural Science Foundation (Nr. 2018JJ3200) und dem Konstruktprogramm der angewandten charakteristischen Disziplin an der Hunan University of Science and Engineering finanziert. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für seine sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 &Mikro; m Membranfilter	Millipore	SLGP033RB	Zur Filterung von Proben
0,4-mm-Sieb	Thermo Fischer	308080-99-1	Zur Vorbereitung von menschlichen Stuhlproben
5-Brom-4-chlor-3-indolyl β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Solarbio	X1010	Zur Vorbereitung der Farbplatte
Essigsäure	Sigma-Aldrich	71251	Standardprobe für SCFA-Agar
	Solarbio	YZ-1012214	Die Komponente der
Medium Anaerobe Kammer	Electrotek	AW 400SG	Bakterienkultur und Fermentation
Autoklav	SANYO	MLS-3750	Verwendung zum Autoklavieren
von Bacto Sojaton	Sigma-Aldrich	70178	Die Komponente des Mediums
Backofen	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Zum Erhitzen und Backen
Rindfleischextrakt	Solarbio	G8270	Die Komponente des Mediums
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bakterien
Gallensalze	Solarbio	YZ-1071304	Die Komponente des Mediums
	Buttersäure Sigma-Aldrich	19215	Standardprobe für SCFA
CaCl₂	Solarbio	C7250	Salzlösung des Mediums
Kapillarsäule	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0,25 mm & mal 30 m - 0,25 % / mu; m)	Wird zur SCFA-Detektion
verwendet Kasein, Pepton	Sigma-Aldrich	39396	Die Komponente der
Medium Zentrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Verwendung für die Zentrifugation
CoSO₄.7H₂O	Solarbio	C7490	Die Komponente des Mediums
CuSO₄.5H₂O	Solarbio	203165	Die Komponente des Mediums
Cystein-HCl	Solarbio	L1550	Die Komponente des Mediums
	Ethanol Sigma-Aldrich	E7023	Zur Herstellung von Vitamin K₁
FeSO₄.7H₂O	Solarbio	YZ-111614	Die Komponente des Mediums
Ameisensäure	Sigma-Aldrich	399388	Wird für die DC-Gaschromatographie
	verwendet Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Wird für die SCFA-Detektion
von Glasbechern	verwendet Fisher Scientific	FB10050	Wird für die Schlammvorbereitung
verwendet Glukose	Solarbio	G8760	Die Komponente des Mediums
Haemin	Solarbio	H8130	Die Komponente des Mediums
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basische Lösung zur Einstellung des pH-Werts der
Puffer Isobuttersäure	Sigma-Aldrich	46935-U	Standardprobe für SCFA
Isovaleriansäuren	Sigma-Aldrich	129542	Standardprobe für SCFA
K₂HPO₄	Solarbio	D9880	Salzlösung des Mediums
KCl	Solarbio	P9921	Bestandteil des Mediums
KH₂PO₄	Solarbio	P7392	Salzlösung des Mediums
LiCl.3H₂O	Solarbio	C8380	Zur Herstellung von Farbplatten
Fleischextrakt	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	Bestandteil des Mediums
Metaphosphorsäure	Sigma-Aldrich	B7350	Standardprobe für SCFA
MgCl₂.6H₂O	Solarbio	M8160	Die Komponente des Mediums
MgSO₄7H₂O	Solarbio	M8300	Salzlösung des Mediums
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE System	DNA-Sequenzierung
MnSO₄. H₂0	Sigma-Aldrich	M8179	Salzlösung des Mediums
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotikum
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salzlösung des Mediums
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	792519	Salzlösung des Mediums
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Bestimmung der DNA-Konzentrationen
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basische Lösung zur Einstellung des pH-Werts der Puffer
n-Butanol	ChemSpider	71-36-3	Zur Gleichbehandlung
von NiCl₂	Solarbio	746460	Die Komponente des Mediums
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Zur Herstellung von Orcinol-Reagenzien
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standardprobe für SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extrakt bakterielle genomische DNA
Gebrauchsfertiges PBS-Pulver	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Zur Herstellung der Lipidsuspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerober
Gerätedrehzahl-Vakuumkonzentrator	LABCONCO	CentriVap	Zur Herstellung von EPSs
Stärke	Solarbio	YZ-140602	Zur Verwendung zur Kohlenstoffquelle
Schwefelsäure	Sigma-Aldrich	150692	Zur Herstellung von Orcin-Reagenzien
T100 PCR	BIO-RAD		PCR-Amplifikation
TLC-Aluminiumbleche	MerckMillipore	116835	Wird zur TLC
von Trypticase Pepton	Sigma-Aldrich	Z699209	verwendet Die Komponente des Mediums
Trypton	Sigma-Aldrich	T7293	Die Komponente des Mediums
Tween 80	Solarbio	T8360	Salzlösung des Mediums
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standardprobe für SCFA
Vitamin K₁	Sigma-Aldrich	V3501	Die Komponente des Mediums
Vortex-Oszillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Verwendung zum Vortexen
Hefeextrakt	Sigma-Aldrich	Y1625	Die Komponente des Mediums
ZnSO₄.7H₂O	Sigma-Aldrich	Z0251	Die Komponente des Mediums

von verwenden 1861096

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....

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Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

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