Methodenartikel

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

DOI:

10.3791/59733

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19. Juli 2019

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1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zahlreiche intrazelluläre Proteine interagieren physisch in Übereinstimmung mit ihren intrazellulären und extrazellulären Umständen. Tatsächlich hängen die zellulären Funktionen weitgehend von intrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen ab. Daher ist die Forschung über diese Wechselwirkungen unerlässlich, um das Verständnis physiologischer Prozesse zu erleichtern. Die Ko-Ausfällung assoziierter Proteine, gefolgt von einer Massenspektrometrie-Analyse (MS), ermöglicht die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen. In dieser Studie haben wir Details der neuartigen Technik der Immunpräzipitations-Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Analyse in Kombination mit der On-Membran-Verdauung für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen bereitgestellt. Diese Technik eignet sich für rohe Immunpräzipitantien und kann den Durchsatz proteomischer Analysen verbessern. Tagged rekombinante Proteine wurden mit spezifischen Antikörpern gefällt; als nächstes wurden Immunpräzipitanten, die auf Polyvinylidendifluorid-Membranstücke gefleckt wurden, einer reduktiven Alkylierung unterzogen. Nach der Trypsinisierung wurden die verdauten Proteinrückstände mit LC-MS/MS analysiert. Mit dieser Technik konnten wir mehrere kandidatenassoziierte Proteine identifizieren. Daher ist diese Methode praktisch und nützlich für die Charakterisierung neuartiger Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Einleitung

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Obwohl Proteine in lebenden Organismen eine konstitutive Rolle spielen, werden sie in der intrazellulären Umgebung kontinuierlich synthetisiert, verarbeitet und abgebaut. Darüber hinaus interagieren intrazelluläre Proteine häufig physikalisch und biochemisch, was die Funktion eines oder beider1,2,3. Beispielsweise ist die direkte Bindung des spliceosomenassoziierten Proteinhomologs CWC22 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4A3 (eIF4A3) für die Montage des exon-Junction-Komplexes4erforderlich. In Übereinstimmung damit, eine eIF4A3 Mutante, die Affinität für CWC22 fehlt nicht exon Junction komplexe mRNA spleißen4zu erleichtern. Daher ist die Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen entscheidend für das genaue Verständnis der physiologischen Regulation sowie der zellulären Funktionen.

Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) wurden auf die umfassende Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet. Zum Beispiel ermöglicht die Ko-Ausfällung von endogenen Proteinen oder exogen eingeführten markierten Proteinen mit ihren zugehörigen Proteinen, gefolgt von einer MS-Analyse, die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen5. Ein großer Engpass bei der MS/MS-Analyse ist jedoch die schlechte Erholung von tryptischen Digests von Proteinproben. Zur Durchführung proteomischer Analysen an Zelllysaten werden in der Regel In-Gel- und On-Membran-Verdauungstechniken zur Vorbereitung von MS/MS-Proben eingesetzt. Wir haben zuvor ein In-Gel-Verdauungsverfahren mit einer On-Membran-Verdauungstechnik6verglichen und gezeigt, dass letztere mit einer besseren Sequenzabdeckung verbunden war. Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran kann für diesen Zweck geeignet sein, weil es mechanisch robust und beständig gegen hohe Konzentrationen von organischen Lösungsmitteln7,8, ermöglicht die enzymatische Verdauung von immobilisierten Proteine in Gegenwart von 80% Acetonitril9. Darüber hinaus kann die Immobilisierung auf einer Membran konformationale Veränderungen in Denkproteinen auslösen, was zu Verbesserungen der tryptischen Verdauungseffizienz10führt. Dementsprechend haben wir in diesem Artikel die Verwendung von Immunpräzipitation-LC/MS/MS-Analysen von Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membran-Verdauungstechnik beschrieben. Diese einfache Methode erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auch in nicht spezialisierten Laboratorien.

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Protokoll

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1. Immunitizipation

HINWEIS: Wir verwendeten Nicht-Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysepuffer und Citrat-Elution, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben. Die Verwendung einer alternativen internen Immunpräzipitungstechnik kann jedoch auch für die Herstellung von LC-MS/MS-Proben geeignet sein.

  1. Transfekte kultivierte Zellen mit Vektoren, die ein Epitop-Tag allein oder ein Fusionsprotein kodieren. Zur Erfassung repräsentativer Daten übertragen Sie J774-Zellen (1 x 106) mit Vektoren, die allein für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) oder GFP-fused Capn6 (Calpain-6-Gen) mit kationischen Liposomen kodieren.
  2. Konjugieren Sie Antikörper gegen magnetische Perlen.
    1. Zu diesem Zweck anti-GFP-Antikörper (2 l/Reaktion) mit magnetischen Perlen (25 l/Reaktion) in 500 l Citratphosphatpuffer (24,5 mM Zitronensäure, 51,7 mM dibasisches Natriumphosphat; pH 5,0) in einem 1,5 ml-Reagenzglas mischen.
    2. Drehen Sie die Mischung bei 50 Umdrehungen für 1 h bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die IgG-konjugierten Perlen dreimal mit Citratphosphatpuffer, der 0,1% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat enthält.
  3. Lyse die transfizierten Zellen mit einem entsprechenden Lysepuffer. Zur Erfassung repräsentativer Daten lysieren Sie die transfizierten Zellen für 30 min auf Eis in 400 l Lysepuffer (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% Poly(Oxyethelene) Octylphenylether) mit 40 x Mol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 g/ml Leutin, 50g/ mL Aprotinin, 200-Mol/L-Natriumorthovanadate und 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) in 1,5 ml-Reagenzgläsern 24 h nach Transfektion.
  4. Löschen Sie das Lysat durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für 5 min und sammeln Sie den Überstand.
  5. Löschen Sie das Lysat. Fügen Sie unbeschriftete Magnetperlen (25 l/Reaktion) in ein 1,5 ml-Teströhrchen ein. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 l Citratphosphatpuffer. Nach der Entfernung des Citratphosphatpuffers in der Endwäsche, fügen Sie die Zelle Lysat über die magnetischen Perlen. Drehen Sie das Gemisch mit Rotator bei 50 Umdrehungen für 30 min bei Raumtemperatur.
  6. Legen Sie das Reagenzglas für 5 min für die magnetische Trennung auf einen magnetischen Ständer und sammeln Sie das Zelllysat. Die Verwendung des vom Hersteller bezeichneten Magnetständers wird empfohlen.
  7. Binden Sie die Zielproteine an die konjugierten Perlen. Das Immunglobulin (Ig)G-konjugierte Perlen für 5 min für die magnetische Trennung auf einen magnetischen Ständer legen, den Citratpuffer entsorgen und dann das Zelllysat zu den getrennten Perlen hinzufügen.
  8. Drehen Sie die Mischung bei 50 Umdrehungen für 1 h bei Raumtemperatur.
  9. Trennen Sie die Zielproteine von freien Nichtzielproteinen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 l Citratphosphatpuffer, der 0,1% Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monolaurat enthält. Nach der letzten Wäsche 30 l Citratpuffer (pH 2–3) hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zielproteine zu löschen.
    HINWEIS: Wenn die Erholung von der Immunpräzipitation unzureichend ist, kann die Verwendung alternativer Epitop-Tags, wie FLAG oder HIS, die Effizienz verbessern. Wenn die Effizienz der Elution nicht ausreicht, kann die Verwendung anderer Eluants, wie z. B. einer SDS-basierten Lösung, die Effizienz verbessern.

2. On-Membran-Verdauung von Proteinen

HINWEIS: Die Verwendung von proteinfreien Materialien und Geräten ist notwendig, um eine Kontamination mit exogenen Proteinen zu vermeiden. Darüber hinaus wird empfohlen, dass der Bediener eine chirurgische Maske und Handschuhe trägt, um eine Kontamination durch menschliche Proteine zu vermeiden.

  1. SCHNEIDEN Sie PVDF-Membranen mit chirurgischer Schere in 3 mm x 3 mm Stücke, die unmittelbar vor der Verwendung mit Methanol abgewischt und getrocknet wurden.
  2. Fügen Sie 2–5 l Ethanol auf die Stücke der PVDF-Membran auf saubere Aluminiumfolie.
  3. Bevor sie vollständig trocknen, fügen Sie das Eluant (je 2–5 l, 4–6 Stück pro Probe) auf die hydrophilen PVDF-Membranen auf, und trocknen Sie dann die Membranen lufttrocken, bis die Membranoberfläche matt wird. Getrocknete Membranen können bei 4 °C gelagert werden.
  4. Übertragen Sie alle Membranen in 1,5 ml Kunststoffrohre, fügen Sie 20–30 l Ethanol hinzu, um die Membranen hydrophil zu machen, und entfernen Sie dann das Ethanol mit einer Pipette.
  5. Bevor die Membran vollständig austrocknet, fügen Sie 200 L Dithiothreitol (DTT)-basierte Reaktionslösung (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT und 20% Acetonitril) hinzu und inkubieren Sie sie bei 56 °C für 1 h.
  6. Ersetzen Sie die Reaktionslösung durch 300 l Iodoacetamidlösung (80 mM NH4HCO3, 55 mM Iodoacetamid und 20% Acetonitril) und brüten 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  7. Waschen Sie die Membranen zweimal mit 1 ml destilliertem Wasser und einmal mit 1 ml 2% Acetonitril durch Wirbelmischung für >10 s.
  8. Lyophilisiertes Trypsin(Materialtabelle) direkt in der Reaktionslösung auflösen (30 mM NH4HCO3 mit 70% Acetonitril). Fügen Sie 100 l der Reaktionslösung hinzu, die 1 g Trypsin (Materialtabelle) (30 mM NH4HCO3 mit 70 % Acetonitril) enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  9. Übertragen Sie die Reaktionslösung, die die tryptischen Digests enthält, mit einer Pipette in ein sauberes 1,5 ml-Reagenzglas.
  10. 100 l Waschlösung (70% Acetonitril/1% Trifluoressigsäure) in die Membran geben und bei 60 °C für 2 h inkubieren. Die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung vermischen. Fügen Sie der Membran weitere 100 L Waschlösung hinzu und beschallen Sie sie 10 min. Dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen.
  11. Bedecken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie und machen Sie ein paar kleine Löcher mit einer Nadel. Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator.
  12. Lösen Sie den Rückstand in 10 l 0,2% Ameisensäure. Nach der Zentrifugation (12.000 g, 3 min bei Raumtemperatur) den Überstand in ein Probenrohr geben.
    HINWEIS: Die Washes sind die kritischen Schritte dieses Abschnitts. Bei der Proteinverdauung auf der Membran ist das Waschen der Membranen, die die immobilisierten Proteine enthalten, nach Reduktion und Alkylierung mit destilliertem Wasser, gefolgt von 2% Acetonitril, jeweils mehr als 10 Sek., entscheidend für die Entfernung der Reagenzien.

3. LC-Elektrospray-Ionisation (ESI)-MS/MS-Analyse

  1. Aktivieren Sie ein ESI-MS/MS-Instrument (Materialtabelle) gekoppelt mit einem Nano-LC-HPLC-System (Materialtabelle). Verknüpfen Sie eine Vorspalte (Materialtabelle) und eine analytische Spalte (Materialtabelle).
  2. Kalibrieren Sie vor der Analyse das Massenspektrometer mit tryptischen Digests von Rinderserumalbumin, gelöst in 0,2% Ameisensäure, die Standardpeptide liefert.
  3. Analysieren Sie die Proben im positiven Ionenmodus und einem Massenbereich von 400–1.250 m/z; dann erreichen Sie bis zu 10 MS/MS-Spektren (je 100 ms) mit einem Massenbereich von 100–1.600 m/z und einem linearen Gradienten von 2%–80% Acetonitril und 0,2% Ameisensäure für 80 min bei einer Durchflussrate von 300 nL/min.
  4. Analysieren Sie die Ausgabedaten mithilfe einer Software zur Proteinidentifikation (Materialtabelle), um die zugeordneten Proteine zu identifizieren. Für die positive Identifizierung eines Kandidatenproteins ist der Nachweis von mindestens einem Hochtreue-Peptidfragment (> 95% Treue) erforderlich.
  5. Lassen Sie die Proteine, die in GFP-exzipierten Lysaten (Transfektion von Vektoren, die ein GFP-Tag allein exzessiieren) aus der Liste der Kandidatenproteine ausgefällt werden.
    HINWEIS: Wenn in der Datenbankanalyse nur wenige Proteine identifiziert werden, kann die Änderung der MS/MS-Erfassungsbedingungen (z. B. Änderung der Zeit von jeweils 100 ms auf 50 ms) die Anzahl der identifizierten Proteine erhöhen.

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Ergebnisse

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Mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurden Immunpräzipitantien mit LC-MS/MS analysiert (Abbildung 1). Nach dem Ausschluss exogen abgeleiteter Proteine (Proteine anderer Arten und IgGs) wurden 17 Proteine in Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitantien (Tabelle 1) und 15 Proteinen in GFP-assoziierten Immunpräcipitantien ( Tabelle 2). Von den Calpain-6- und GFP-assoziierten Proteinen wurden 11 in beiden Immunpräcipitantie...

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Diskussion

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Wir haben zuvor eine Analyse der oxidativen Modifikationen von Apolipoprotein B-100 in oxidiertem Low-Density-Lipoprotein mit LC-MS/MS beschrieben, der eine On-Membran-Verdauungstechnik vorausgegangen ist6. In der vorliegenden Studie haben wir diese Technik mit Immunpräzipitation kombiniert und mehrere Calpain-6-assoziierte Proteine identifiziert. Diese neuartige Technik stellt eine bequeme Methode zum Screening auf Kandidaten-assoziierte Proteine dar. Calpain-6 ist ein nicht-proteolytisches Mitgl...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Studie wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), einem Forschungsstipendium der Kanehara Ichiro Medical Science Foundation, unterstützt. und ein Forschungsstipendium der Suzuken Memorial Foundation (alle an TM).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetonitrilWako014-00386
ZitronensäureWako030-05525
DiNAKYA Tech Co.nanoflow Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
DiNa AIKYA Tech Co.Nanoflow, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, ausgestattet mit Autosampler,
DTTNacalai Tesque14112-94
Dynabeads, Protein GThermo, Fisher Scientific10003D
AmeisensäureWako066-00461
HiQ, Sil, C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000,10 mmID * 100 mmL
IodacetamidWako095-02151
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Living Colors A.v. Monoklonaler Antikörper (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH4HCO3Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507Poly(oxyethelen)-octylphenylether (n=9)
peptid standardKYA Tech Co.tBSA-04tryptische Verdaue von Rinderserumalbumin
PP-FläschchenKYA Tech Co.03100SProbenröhrchen aus Kunststoff
Protease-Inhibitor CooctailSigmaP8465
ProteinPilot-SoftwareSciex5034057Software zur Proteinidentifizierung
Modifiziertes Trypsin in SequenzierungsqualitätPromegaV5111Trypsin
NatriumorthovanadatSigmaS6508
Natriumphosphat zweibasisches DihydratSigma71643
TFAWako206-10731
FallensäuleKYA Tech Co.A03-05-0010,5 mmID * 1 mmL
TripleTOF 5600 SystemSciex4466015Hybrid-Quadrupol-Flugzeit-Tandem-Massenspektrometer
TrisWako207-06275
Tween-20Wako160-21211
, , , , , , ,

Referenzen

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Schlagwörter

Immunpr zipitation LC MS MSPVDF MembranTrypsin VerdauMagnetbeadsMassenspektrometrieproteomische AnalyseRohimmunpr zipitatereduktive Alkylierung

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