Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Zusammenfassung

Zelluläre Organellen, wie Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER), bilden ein Netzwerk, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Diese hochgekrümmten Strukturen werden in verschiedene Formen gefaltet, um je nach zellulären Bedingungen ein dynamisches Netzwerk zu bilden. Die Visualisierung dieses Netzwerks zwischen Mitochondrien und ER wurde mit superauflösungsklarer Fluoreszenz-Bildgebung und Lichtmikroskopie versucht; Die begrenzte Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Membranen zwischen den Mitochondrien und ER im Detail zu beobachten. Transmissionselektronenmikroskopie bietet einen guten Membrankontrast und eine Nanometer-Auflösung für die Beobachtung von Zellorganellen; Bei der Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Struktur hochgekrümmter Organellen ist es jedoch außerordentlich zeitaufwändig. Daher beobachteten wir die Morphologie von Mitochondrien und ER mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie (CLEM) und Volumenelektronenmikroskopie-Techniken mit verbesserter Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung. Zur Beobachtung der 3D-Struktur wurden eine en bloc-Färbemethode, ultradünne serielle Schnitte (Arraytomographie) und Volumenelektronenmikroskopie angewendet. In diesem Protokoll schlagen wir eine Kombination von CLEM und 3D-Elektronenmikroskopie vor, um detaillierte Strukturstudien von Mitochondrien und ER durchzuführen.

Einleitung

Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) sind membrangebundene Zellorganellen. Ihre Verbindung ist für ihre Funktion notwendig, und Proteine, die mit ihrem Netzwerk zusammenhängen, wurden beschrieben¹. Der Abstand zwischen den Mitochondrien und ER wurde mit Hilfe der Lichtmikroskopie²als etwa 100 nm gemeldet; Jüngste Studien der Superresolution-Mikroskopie³ und der Elektronenmikroskopie (EM)⁴ haben jedoch ergeben, dass sie mit etwa 10-25 nm erheblich kleiner ist. Die in der Hochauflösenden Mikroskopie erreichte Auflösung ist niedriger als EM, und eine spezifische ....

Protokoll

1. Zellkultur mit gemusterter Gitterkulturschale und Zelltransfektion mit SCO1-APEX2 und HRP-KDEL Plasmidvektor

1. Samen 1 x 10⁵ HEK293T Zellen, indem sie sie in 35-mm-Glasgitter-Boden-Kulturschalen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin.
2. Am Tag nach der Aussaat der Zellen, wenn sie auf 50%-60% Konfluenz angewachsen sind, führen Sie die Plasmids SCO1-APEX2¹⁰ und HRP-KDEL¹² mit Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Zellen ein (SCO1-APEX2 cDNA 0....

Ergebnisse

Abbildung 1 beschreibt den Zeitplan und den Workflow für dieses Protokoll. Das Protokoll benötigt 7 Tage; Abhängig von der Zeit, die für die SEM-Bildgebung aufgewendet wird, kann dies jedoch zunehmen. Bei der Zelltransfektion sollte die Konfluenz der Zellen so gesteuert werden, dass der Boden der gesamten Gitterplatte nicht abgedeckt wird (Abbildung 1A). Eine hohe Zelldichte könnte die Identifizierung der von Interesse sindden Zelle während der Lichtmikroskop- und EM-Beobachtung verhinde.......

Diskussion

Die Bestimmung der zellulären Lokalisierung bestimmter Proteine bei einer Nanometerauflösung mit EM ist entscheidend, um die zellulären Funktionen von Proteinen zu verstehen. Im Allgemeinen gibt es zwei Techniken, um die Lokalisation eines Zielproteins über EM zu untersuchen. Das eine ist die Immunogold-Technik, die seit 1960 in EM verwendet wird, und die andere ist eine Technik mit neu entwickelten genetisch kodierten Tags¹⁶. Herkömmliche Immunogold-Techniken haben antikörperkonjugierte Goldparti.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glutaraldehyd	EMS	16200	Nur im Abzug verwenden
Paraformaldehyd	EMS	19210	Nur im Abzug
Natriumcacodylat	EMS	12300
Osmiumtetroxid 4 % wässrige Lösung	EMS	16320	Nur im Abzug
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml
Ultramikrotom Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranylacetat	EMS	22400	Gefährliche Chemikalie
Bleicitrat	EMS	17900
35mm Gerasterte Deckglasschale	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glühentladung	Pelco	easiGlow
Formvar kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter	Ted Pella	01805-F
Salzsäure	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycin	SIGMA	G8898
3,3′ -Diaminobenzamidin (DAB)	SIGMA	D8001	Gefährliche Chemikalie
30% Wasserstoffperoxidlösung	Merck	107210
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat	SIGMA	P3289
0,22 μm Spritzenfilter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazid	SIGMA	223220	Nur im Abzug verwenden
Kaliumhydroxid Fluka		10193426
L-Asparaginsäure	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmissionselektronenmikroskopie	FEI	Tecnai G2
Deckgläser aus mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichtetem Glas	SPI	06489-AB	zerbrechliches
Glas Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamantmesser	Leica	AT-4
Inveted Lichtmikroskopie	Nikon	ECLipse TS100
Rasterelektronenmikroskopie	Zeiss	Auriga

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