Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muskelbiopsien

Zusammenfassung

Beschrieben hier ist ein Protokoll zur direkten Immunkennzeichnung von nekrotischen Myofikern in Muskelkryosektionen. Nekrotische Zellen sind durchlässig für Serumproteine, einschließlich Immunglobulin G (IgG). Die Enthüllung der Aufnahme von IgG durch Myofiber ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Myofiberen, die einer Nekrose unabhängig von Muskelproblemen unterzogen werden.

Zusammenfassung

Die Nekrose der Muskelfasern (Myonecrosis) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese mehrerer Muskelerkrankungen, einschließlich Muskeldystrophien. Therapeutische Optionen zur Bekämpfung der Ursachen der Muskeldystrophie Pathogenese werden erwartet, um Muskeldegeneration zu lindern. Daher ist eine Methode erforderlich, um das Ausmaß des Zelltodes in Muskelbiopsien zu asse- und zu quantifizieren. Herkömmliche Methoden zur Beobachtung der Myofiberdegeneration vor Ort sind entweder schlecht quantitativ oder verlassen sich auf die Injektion lebenswichtiger Farbstoffe. In diesem Artikel wird ein Immunfluoreszenzprotokoll beschrieben, das nekrotische Myofiber durch gezielte Immunglobulin-G-Aufnahme (IgG) durch Myofiber stutzt. Die IgG-Aufnahmemethode basiert auf Zellmerkmalen, die den nekrotischen Untergang charakterisieren, einschließlich 1) des Verlusts der Plasmamembranintegrität mit der Freisetzung von schadensassoziierten molekularen Mustern und 2) der Aufnahme von Plasmaproteinen. In murinen Querschnitten ermöglicht die Co-Immunolabelling von Myofibiden, extrazellulären Matrixproteinen und Maus-IgG eine saubere und unkomplizierte Identifizierung von Myofiberen mit nekrotischem Schicksal. Diese einfache Methode eignet sich für die quantitative Analyse und gilt für alle Arten, einschließlich menschlicher Proben, und erfordert keine Injektion von Vitalfarbstoff. Die Färbung nekrotischer Myofiber durch IgG-Aufnahme kann auch mit anderen Co-Immunolabelling gekoppelt werden.

Einleitung

Gestreifter Skelettmuskel besteht hauptsächlich aus Muskelfasern (Myofiber), die für die charakteristische freiwillige kontraktile Funktion verantwortlich sind. Diese Zellen sind multinukleierte, post-mitotische Strukturen, die mechanische Beanspruchung unterstützen, die während der Kontraktion auftritt. Die strukturelle Stabilität der Myofibermembran (Sarcolemma) und ihrer extrazellulären Matrix sind entscheidend für die Gewebehomöostase. Satellitenzellen bilden die Hauptmuskelvorläuferpopulation in reifen Skelettmuskeln und existieren in einem ruhestillen Zustand in gesunden Muskeln. Nach dem Myofibertod wird die Muskelregeneration von Satellitenzellen nach einem my....

Protokoll

Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den französischen und europäischen Rechtsvorschriften (Lizenznummer 11-00010) durchgeführt.

1. Tragacanth-Kaugummi-Präparat

1. In einem Glasbecher 6 g Tragacanthpulver in 100 ml entionisiertem Wasser auflösen. Mit Folie abdecken und mindestens 3 h ablassen. Gelegentlich manuell mit einem Metallspachtel rühren, wenn die Mischung schnell zähflüssig wird.
2. Lassen Sie die Tragacanth-Mischung bei 60 °C über Nacht im Wasserbad oder im Ofen. Versiegeln Sie das Becherglas vorsichtig, um ein Trocknen zu vermeiden. Mindestens einmal umrühren, bevor man aliquotiert.
3. Aliquot und lager....

Ergebnisse

Myofiber sind von einer lamininhaltigen extrazellulären Matrix umgeben. Rote Färbung begrenzt Myofibers Peripherie und ermöglicht ihre Identifizierung. IgG wird grün dargestellt. Kerne sind mit DAPI gefärbt und finden sich blau unter dem Mikroskop. Allerdings sind Die Kerne hier weiß dargestellt (Abbildung 1). Im extrazellulären Fach wird eine schwache IgG-Immunreaktivität erwartet, die bei Entzündungen erhöht werden kann. Grüne Färbung innerhalb der Myofiber.......

Diskussion

Myofiber-Nekrose ist eine häufige Folge traumatischer Bewegung in normalen Muskeln. Es wird durch eine starke Regenerationsfähigkeit der lokalen Muskelvorläufer gut kompensiert. Bei mehreren Muskelerkrankungen, wie z. B. bei MDs, wird die Regenerationsfähigkeit von Satellitenzellen jedoch durch chronische Myonekrose und übermäßige Fibrose beeinträchtigt. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass Muskelfasern durch Nekkrotose, eine regulierte Form der Nekrose, absterben können. Genauer gesagt, die Hemmung der Nekrotose kann eine ne.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kreisförmige Korkscheiben	Pyramid Innovation	R30001-E	Vergessen Sie nicht, den Korken deutlich zu beschriften, damit die ID der Probe nach dem Einfrieren bestimmt werden kann
Kryostat	Leica	CM3050 sn34	Die Kryosektion der Muskeln sollte zwischen -20 und -25 °C durchgeführt werden. Dicke: 7-10 Mikrometer.
Dakopen	Dako	S2002	Eine hydrophobe Barriere um die Muskelpartien. Es verhindert die Auflösung des Mediums während der Inkubation
Pinzette	FST	91117-10	/
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Verdünnung: 1/500
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Verdünnung: 1/500
Ziegenserum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Verwenden Sie beim Blockieren eine 10%ige Verdünnung in PBS. Für die Inkubation von Antikörpern verwenden Sie eine 5%ige Verdünnung in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Gefriermedium. Sollte in einem Becherglas abgekühlt werden, das in flüssigen Stickstoff gegeben ist.
mdx-Maus	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx-Mäuse sind für das Dystrophin-Gen mutiert. Ab einem Alter von drei Wochen sind die Muskeln durch chronische Degeneration gekennzeichnet
Mikroskop	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Einbettungsmatrix
PFA (Paraformaldehyd)	ThermoFischer Scientific	28908	Wird zur Fixierung der Kryosektion verwendet (2% oder 4% PFA kann verwendet werden)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Verdünnungsmedium für Immunmarkierung
Präzisionsscheren	FST	fst 14001-12 und fst 14001-14	Wird für die Muskelentnahme verwendet
Kaninchen Antikörper gegen Maus pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Verdünnung: 1/1000
Traganth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquote bei +4°; C