Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

Zusammenfassung

Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt einen kulturbasierten, coinkubischen Test zur Erkennung und Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen zwei Bakterienpopulationen. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die es ermöglichen, jede Population mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzfähigkeiten und fluoreszierenden Proteinen für die Selektion bzw. visuelle Diskriminierung jeder Population unterschiedlich markiert zu werden. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Koinkubation konkurrierender Vibrio fischeri-Stämme, die Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung und die quantitative Datenanalyse. Dieser Ansatz ist einfach, liefert schnelle Ergebnisse und kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Population tötet oder das Wachstum einer anderen Population hemmt, und ob Der Wettbewerb durch ein diffusibles Molekül vermittelt wird oder einen direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Da jede Bakterienpopulation ein anderes fluoreszierendes Protein ausdrückt, ermöglicht der Assay die räumliche Diskriminierung konkurrierender Populationen innerhalb einer gemischten Kolonie. Obwohl die beschriebenen Methoden mit dem symbiotischen Bakterium V. fischeri unter Verwendung von für diese Art optimierten Bedingungen durchgeführt werden, kann das Protokoll für die meisten kultivierbaren Bakterienisolate angepasst werden.

Einleitung

Dieses Manuskript skizziert eine kulturbasierte Methode, um festzustellen, ob zwei bakterielle Isolate zu wettbewerbsorientierten Wechselwirkungen fähig sind. Bei der Untersuchung gemischter Populationen ist es wichtig zu beurteilen, inwieweit die bakteriellen Isolate interagieren, insbesondere ob Isolate direkt durch Interferenzmechanismen konkurrieren. Interferenzwettbewerb bezieht sich auf Wechselwirkungen, bei denen eine Bevölkerung das Wachstum direkt hemmt oder eine konkurrierende Bevölkerung tötet¹. Diese Wechselwirkungen sind wichtig zu identifizieren, da sie tiefgreifende Auswirkungen auf die Struktur und Funktion einer mikrobiellen Ge....

Protokoll

1. Bereiten Sie Stämme für die Coinkubation vor

1. Wählen Sie einen geeigneten Referenzstamm, der als Ziel für den bakteriellen Wettbewerb während des Coinkubationstestes dient. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion über bewährte Methoden bei der Auswahl eines Referenzstamms und darüber, wie sich der Referenzstamm auf die Ergebnisse auswirkt. In diesem Protokoll dient der V. fischeri-Stamm ES114 als Referenzstamm.
2. Bestimmen, welche Selektions- und Screening-Methoden verwendet werden, um zwischen den Isolaten in der Coinkubation zu unterscheiden
   1. In der Regel transformieren Sie Stämme mit....

Ergebnisse

Um die Wechselwirkungen zwischen Bakterienpopulationen zu bewerten, wurde ein Coinkubations-Assay-Protokoll entwickelt und für V. fischerioptimiert. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Proteine kodieren, was eine Differenzauswahl und visuelle Diskriminierung jedes Stammes ermöglicht. Durch die Analyse der Daten, die aus dem Coincubation-Test gesammelt wurden, können das Wettbewerbsergebnis einer Interaktion und der Mechanismu.......

Diskussion

Der oben beschriebene Coincubation-Assay bietet eine leistungsstarke Methode, um interbakterielle Konkurrenz zu entdecken. Dieser Ansatz ermöglichte die Ermittlung des intraspezifischen Wettbewerbs zwischen V. fischeri Isolaten und die Charakterisierung des Wettbewerbsmechanismus¹⁹. Obwohl die beschriebene Methode für das marine Bakterium V. fischerioptimiert wurde, kann es leicht modifiziert werden, um andere Bakterienarten einschließlich klinischer und ökologischer Isolate aufz.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher	05-408-129
10 μ L Mehrkanalpipette
100 μ L Mehrkanalpipette
300 μ L Mehrkanalpipette
10 μ L Einkanalpipette
20 μ L Einkanalpipette
200 μ L Einkanalpipette
1.000 μ L Einkanalpipette
24-Well-Platten	Fisher	07-200-84	steril mit Deckel
96-Well-Platten	VWR	10062-900	steril mit
Deckel Taschenrechner
Chloramphenicol	Sigma	C0378	Stamm (20 mg/mL in Ethanol); Endkonzentration in Medien (2 & mu; g/mL LBS)
Fluoreszenz-Präpariermikroskop mit Kamera und Bildgebungssoftware
Pinzette	Fisher	08-880
Kanamycinsulfat	Fisher	BP906-5	Stamm (100 mg/mL in Wasser, Filter sterilisieren); Endkonzentration in Medien (1 & mu; g/mL LBS)
Nitrozellulosemembran (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0,22 μ m Nitrozellulosemembran (pk à 100)
Petriplatten	Fisher	FB0875713	steril mit Deckel
Spektralphotometer
Semi-Mikroküvetten	VWR	97000-586
TipOne 0,1-10 μ L Startersystem	USA Scientific	1111-3500	10 Racks
TipOne 200 μ L Startersystem	USA Scientific	1111-500	10 Racks
TipOne 1000 μ L Startersystem	USA Scientific	1111-2520	10 Racks
Vortex
Name	Company<	strong>Katalognummer	<>Comments
LBS media
1 M Tris Puffer (pH ~7,5)			50 mL 1 M Stammpuffer (62 mL HCl, 938 mL DI Wasser, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Nur für Platten hinzufügen)
DI Wasser			950 mL
Natriumchlorid	Fisher	S640-3	20 g
Trypton	Fisher	BP97265	10 g
Hefeextrakt	Fisher	BP9727-2	5 g