Method Article

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

DOI:

10.3791/59759

⸱

July 22nd, 2019

 , 
1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

Abstract

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Dieses Manuskript beschreibt einen kulturbasierten, coinkubischen Test zur Erkennung und Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen zwei Bakterienpopulationen. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die es ermöglichen, jede Population mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzfähigkeiten und fluoreszierenden Proteinen für die Selektion bzw. visuelle Diskriminierung jeder Population unterschiedlich markiert zu werden. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Koinkubation konkurrierender Vibrio fischeri-Stämme, die Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung und die quantitative Datenanalyse. Dieser Ansatz ist einfach, liefert schnelle Ergebnisse und kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Population tötet oder das Wachstum einer anderen Population hemmt, und ob Der Wettbewerb durch ein diffusibles Molekül vermittelt wird oder einen direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Da jede Bakterienpopulation ein anderes fluoreszierendes Protein ausdrückt, ermöglicht der Assay die räumliche Diskriminierung konkurrierender Populationen innerhalb einer gemischten Kolonie. Obwohl die beschriebenen Methoden mit dem symbiotischen Bakterium V. fischeri unter Verwendung von für diese Art optimierten Bedingungen durchgeführt werden, kann das Protokoll für die meisten kultivierbaren Bakterienisolate angepasst werden.

Introduction

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Dieses Manuskript skizziert eine kulturbasierte Methode, um festzustellen, ob zwei bakterielle Isolate zu wettbewerbsorientierten Wechselwirkungen fähig sind. Bei der Untersuchung gemischter Populationen ist es wichtig zu beurteilen, inwieweit die bakteriellen Isolate interagieren, insbesondere ob Isolate direkt durch Interferenzmechanismen konkurrieren. Interferenzwettbewerb bezieht sich auf Wechselwirkungen, bei denen eine Bevölkerung das Wachstum direkt hemmt oder eine konkurrierende Bevölkerung tötet1. Diese Wechselwirkungen sind wichtig zu identifizieren, da sie tiefgreifende Auswirkungen auf die Struktur und Funktion einer mikrobiellen Gemeinschaft haben können2,3.

Mechanismen für mikrobielle Konkurrenz wurden weit in Genomen von Bakterien aus verschiedenen Umgebungen entdeckt, einschließlich sowohl wirtassoziierter als auch freilebender Bakterien4,5,6,7, 8,9. Eine Vielzahl von Wettbewerbsstrategien wurden beschrieben10,11 einschließlich diffusible Mechanismen, wie bakterizide Chemikalien1,12 und abgesonderte antimikrobielle Peptide13 , sowie kontaktabhängige Mechanismen, die einen Zell-Zell-Kontakt erfordern, um einen hemmenden Effektor in die Zielzellen9,14,15,16,17 zu übertragen ,18.

Obwohl kulturbasierte Coinkubationen häufig in der Mikrobiologie5,8,19verwendet werden, skizziert dieses Manuskript, wie der Assay verwendet werden kann, um den Mechanismus des Wettbewerbs zu charakterisieren, sowie Vorschläge zur Anpassung das Protokoll für die Verwendung mit anderen Bakterienarten. Darüber hinaus beschreibt diese Methode mehrere Ansätze zur Analyse und Darstellung der Daten, um verschiedene Fragen zur Art der Wettbewerbsinteraktionen zu beantworten. Obwohl die hier beschriebenen Techniken zuvor verwendet wurden, um den interbakteriellen Tötungsmechanismus zu identifizieren, der dem intraspezifischen Wettbewerb zwischen symbiotischen Stämmen von koisolierten Vibrio fischeri-Bakterien19zugrunde liegt, eignen sie sich viele Bakterienarten, einschließlich Umweltisolate und menschliche Krankheitserreger, und können verwendet werden, um sowohl kontaktabhängige als auch diffusible Wettbewerbsmechanismen zu bewerten. Schritte im Protokoll erfordern möglicherweise eine Optimierung für andere Bakterienarten. Angesichts der Tatsache, dass mehr Modellsysteme ihre Studien über die Verwendung isogener Organismen hinaus erweitern, um verschiedene Genotypen10,16,20,21, wird diese Methode eine wertvolle Ressource sein für Forscher, die verstehen wollen, wie sich der Wettbewerb auf Multi-Stamm- oder Multi-Arten-Systeme auswirkt.

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Protocol

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1. Bereiten Sie Stämme für die Coinkubation vor

  1. Wählen Sie einen geeigneten Referenzstamm, der als Ziel für den bakteriellen Wettbewerb während des Coinkubationstestes dient. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion über bewährte Methoden bei der Auswahl eines Referenzstamms und darüber, wie sich der Referenzstamm auf die Ergebnisse auswirkt. In diesem Protokoll dient der V. fischeri-Stamm ES114 als Referenzstamm.
  2. Bestimmen, welche Selektions- und Screening-Methoden verwendet werden, um zwischen den Isolaten in der Coinkubation zu unterscheiden
    1. In der Regel transformieren Sie Stämme mit stabilen Plasmiden, die verschiedene Antibiotikaresistenzgene (z. B. Kanamycin oder Chloramphenicol) enthalten, um für jeden Stamm auszuwählen, sowie Gene, die für verschiedene fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder RFP) für die visuelle Unterschiedliche Dehnungsarten in der Cokultur.
      HINWEIS: Die Verwendung stabiler Plasmide ist erforderlich, denn wenn ein Stamm das Plasmid ohne Selektion verliert, werden die Zahlen dieses Stammes bei der Quantifizierung unterschätzt und sind mit der Fluoreszenzmikroskopie nicht visuell nachweisbar.
    2. Tag-geprägte V. fischeri-Stämme differenziell, so dass ein Stamm das Plasmid pVSV102 enthält, das ein grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin (KanR) ausdrückt, und der zweite Stamm enthält Plasmid pVSV208, das ein rotes fluoreszierendes Protein (dsRed) und eine Resistenz gegen das Antibiotikum Chloramphenicol (CmR)22ausdrückt.
      HINWEIS: Andere Differentialauswahlen können verwendet werden, um Coincubating-Stämme zu unterscheiden. Weitere Methoden finden Sie unter Diskussion.
    3. Fügen Sie die folgende Steuerung während der ersten Optimierung des Coinkubations-Assays ein, um sicherzustellen, dass die Auswahl robust ist. Platten Sie jeden Stamm, der differenziell auf Agarplatten markiert ist, die das Antibiotikum enthalten, das gegen ihn ausgewählt werden sollte (d. h. Plattenstamm 1 auf Medien, die für Stamm 2 auswählen, und umgekehrt).
  3. Zwei Tage vor dem Coinkubationstest, Streifenreferenzstamm pVSV102, Referenzstamm pVSV208 und jeder Konkurrentstamm pVSV208 von -80 °C Beständen auf LBS-Agarplatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten (z. B. 100 g/ml Kanamycin oder 2 g/ml Chloramphenicol) und über Nacht bei 24 °C inkubieren. Eine Antibiotika-Auswahl ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Zellen das Plasmid zu Beginn des Experiments enthalten.
  4. Einen Tag vor dem Test vier einzelne Kolonien pro Stammtyp (biologische Nachbildungen) auf frische LBS-Agarplatten mit entsprechendem Antibiotikum zu pflücken und umzudrehen und über Nacht bei 24 °C zu bebrüten.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann eine Optimierung für andere Bakterienarten erfordern, da längere oder kürzere Inkubationszeiten erforderlich sein können, um ausreichende Zellen zu erhalten, abhängig von der Wachstumsrate des organismus von Interesse.

2. Coincubate Bakterienstämme

  1. Vorbereitung jedes Bakterienstamms zur Inkubation (Abbildung 1A)
    1. Mit einem sterilen Zahnstocher die Zellen von der Agarplatte (so viel wie die Größe eines Reiskorns) kratzen und die Zellen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das 1 ml LBS-Brühe enthält, wieder aufhängen. Brechen Sie die Zellklumpen auf, indem Sie sie in die Seite des Rohres drücken und kräftig nach oben und unten pfeifen.
    2. Kappen Sie das Rohr und den Wirbel für 1-2 s. Wenn die Zellklumpen noch sichtbar sind, fahren Sie mit Wirbel oder Pipette nach oben und unten fort, bis die Probe visuell gleichmäßig ist.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.2 für alle Proben.
  2. Messen und erfassen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) für alle Proben. Proben müssen wahrscheinlich bis zum Zehnfachen mit LBS-Brühe verdünnt werden, um eine genaue OD-Messung zu erhalten. Normalisieren Sie jede Probe auf die gewünschte OD600. Stämme werden in der Regel auf eine OD600 1,0 normalisiert, was für V. fischeri106 Bakterien/ml bedeutet.
    HINWEIS: Dieser Schritt kann eine Optimierung für verschiedene Bakterienarten erfordern, da die Inokulumzelldichte die Coinkubationsergebnisse je nach Wettbewerbsmechanismus beeinflusst. Siehe Diskussion zur Optimierung.
  3. Coincubating-Stämme(Abbildung1B, C)
    1. Mischen Sie die Referenzdehnung und die Konkurrenzdehnung in einem Verhältnis von 1:1 (v/v), indem Sie 100 ml jeder Dehnung (normalisiert zu OD 1.0) zu einem beschrifteten 1,5 ml Zentrifugenrohr hinzufügen. Mischen Sie als Steuerung die Referenzdehnung mit einer differenziell getaggten Version von sich selbst (Referenzstamm pVSV102 + Referenzstamm pVSV208). Diese Kontrolle ist für eine spätere statistische Analyse erforderlich, um festzustellen, ob das Vorhandensein eines Mitbeanspruchungsstamms das Wachstum des Referenzstamms beeinflusst. Wirbel die Mixed-Stamm-Kultur für 1-2 s.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann eine Optimierung erfordern, da das Startverhältnis die Ergebnisse erheblich beeinflussen kann und möglicherweise angepasst werden muss. Siehe Diskussion zur Optimierung.
    2. Wiederholen Sie Schritt 2.3.1 für jede biologische Replikation. Nach Abschluss dieses Schritts sollten insgesamt acht gemischte Dehnungsrohre vorhanden sein: vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenzstämmen (Kontrolle) und vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenz- und Mitbewerberstämmen ( experimentell).
    3. Spot 10 ml jeder Kontroll- und Versuchsmischung auf Petriplatten, die LBS-Agar enthalten; diese Kulturflecken werden nach der Inkubation für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet.
    4. Lassen Sie die Flecken vollständig auf der Bank trocknen, bis die gesamte Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde und bebrüten Sie die Petriplatten bei 24 °C für 24 h. Mindestens 15 h sind für V. fischeri-Stämme erforderlich, die mit pVSV102 und pVSV208 markiert sind, um eine hohe Zelldichte zu erreichen, um GFP bzw. RFP auf Populationsebene mit einem Fluoreszenz-Sezierendes Mikroskop zu visualisieren. Hier verwenden wir eine 24 h Inkubation für die Abbildung von Mischflecken.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Platten zu verwenden, die nicht zu feucht oder zu trocken sind. Wenn die Platten zu feucht sind, werden Coinkubationsstellen nicht in die Agarplatte absorbiert; vermeiden Sie die Verwendung von Platten, die am selben Tag gegossen werden. Wenn die Platten zu trocken sind, können sich kleine Wellen oder Risse auf der Agaroberfläche bilden, wodurch Coinkubationsflecken unregelmäßig in der Form sind.
    5. Mit den gleichen bakteriellen Suspensionen wie in Schritt 2.3.3, Punkt 10 ml jeder Kontrolle und experimentelle Mischungen in 24-Well-Platten mit 1 ml LBS Agar pro Brunnen. Wie in Schritt 2.3.3, stellen Sie sicher, dass der Agar in 24-Well-Platten die entsprechende Feuchtigkeit hat. Die Flecken vollständig trocknen lassen und bei 24 °C 5 h inkubieren. Diese Kulturflecken werden verwendet, um die Koloniebildenden Einheiten (KBE) für jeden Stamm am Ende des Experiments zu quantifizieren.
      HINWEIS: Das Erkennen bakterieller Suspensionen für das Wachstum in einzelnen Brunnen ermöglicht eine einfachere Resuspension am Endzeitpunkt. Dieser Schritt kann mit quadratischen sterilen Filterstücken als wirtschaftlicherer Ansatz für die Verwendung von 24-Well-Platten durchgeführt werden. Quadratische sterile Filterstücke können auf eine Agarplatte gelegt werden und 10 ml jeder experimentellen Mischung können auf diesen Filtern und nicht auf 24-Well-Platten gesichtet werden. Nach der Coinkubationszeit können die Filter in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen und der Coinkubationspunkt durch Wirbeln oder Pipetieren nach oben und unten resuspendiert werden. Eine Inkubationszeit von 5 h reicht aus, um die interbakterielle Tötung zwischen V. fischeri Isolaten19zu erkennen, allerdings muss diese Inkubationszeit für andere Arten oder Wettbewerbsmechanismen kürzer oder länger sein. Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion.
  4. Serielle Verdünnung zum Starten von Inokulum
    1. Um eine serielle Verdünnung von Anfangs-Coinkubationsmischungen durchzuführen, drehen Sie eine 96-Well-Platte um 90°, so dass es acht Spalten und zwölf Reihen gibt. Jede Zeile enthält eine Probe der unverdünnten Mischung in der ersten Spalte, gefolgt von sieben zehnfachen seriellen Verdünnungen über die verbleibenden Bohrungen in der Reihe (Abbildung2A).
    2. Beschriften Sie jede Zeile mit der Stamm-ID, der Replikationsnummer und der Zeit (Start inoculum = T0). Etikettieren Sie die LBS-Agarplatten, die mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt werden, um die Verdünnungsserie zu erkennen. Achten Sie darauf, zu identifizieren, für welchen Stamm jede Antibiotikaplatte ausgewählt wird.
    3. Mit einer Mehrkanalpipette 180 ml LBS-Brühe zu jedem Brunnen hinzufügen, so dass die erste Säule für die unverdünnte Coinkubationsmischung leer bleibt.
      HINWEIS: Die Forscher können phosphatgepufferte Kochstoff (PBS) verwenden, um Coinkubationsflecken wieder auszusetzen und eine serielle Verdünnung durchzuführen, wenn sie mit einer besonders schnell wachsenden Bakterienart arbeiten oder konsequent große Experimente durchführen, bei denen serielle Verdünnungen eine lange Zeit, um durchzuführen. Die Verwendung von PBS in diesen Fällen verhindert ein signifikantes Auswachsen von Bakterien während des Prozesses der Durchführung von seriellen Verdünnungen. Es ist jedoch wichtig, in allen Experimenten, unabhängig von ihrer Größe oder Dauer, mit der verwendeten Lösung (z. B. PBS oder LBS) konsistent zu sein.
    4. Mit einer 200 ml Einkanalpipette 100 ml des Coinkubationsgemisches vom Rohr in die erste Säule geben. Entsorgen Sie die Spitze und wiederholen Sie für alle Coinkubationsmischungen.
    5. Mit einer Mehrkanalpipette 20 ml von Spalte 1 auf 2 übertragen und durch Pipettieren nach oben und unten mischen. Entsorgen Sie die Spitzen, und wiederholen Sie für jede Spalte, so dass am Ende jede Zeile eine zehnfache serielle Verdünnung der ursprünglichen Coinkubationsmischung enthält.
      HINWEIS: Seien Sie konsistent mit der Häufigkeit, wie oft Verdünnungen nach oben und unten pipettiert werden. Drücken Sie beispielsweise den Pipettengriff fünfmal, damit jede Verdünnung in der Verdünnungsserie konsistent ist.
    6. Mit einer Mehrkanalpipette mit acht Spitzen 5 ml aus jedem Brunnen in einer Verdünnungsserie (d.h. eine Reihe von acht Brunnen) aspirieren und auf die LBS-Agarplatte einsehen, die für den Referenzstamm (ergänzt durch Kanamycin) ausgewählt wird. Wiederholen Sie diesen Schritt Spotting auf der Platte Auswahl für die Konkurrenz Stamm (ergänzt mit Chloramphenicol) (Abbildung 2B). Lassen Sie die Flecken vollständig trocknen, bevor Sie sie in den Inkubator legen.
      HINWEIS: Dieselben Spitzen können verwendet werden, um eine Replikationsverdünnungsserie auf Platten zu erkennen, die für die Referenz- und Konkurrenzdehnung ausgewählt werden, müssen jedoch zwischen Replikationen geändert werden. Vermeiden Sie es, das Ende der Pipettenspitze zu den LBS-Agarplatten zu berühren, da dies eine Depression erzeugen kann, die einer Bakterienkolonie ähneln kann und schiefe Ergebnisse während der Plattenzahl. Wenn die Spitze die Platte berührt, machen Sie eine Notiz und schließen Sie die Depression nicht in Koloniezählt ein.
  5. T-Endmessungen
    1. Nachdem die Coinkubationsstellen in den 24-Well-Platten für 5 h bei 24 °C inkubiert wurden, fügen Sie 1 ml LBS-Brühe zu jedem Brunnen hinzu und setzen die Coinkubationsflecken durch Pipetten auf und ab, bis alle Zellen resuspendiert sind. Seien Sie konsistent mit der Kraft, in der die Zellen über alle Replikationen resuspendiert werden. Drücken Sie beispielsweise den Pipettengriff achtmal, um jede Probe vollständig wieder aufzusetzen.
    2. Sobald jeder Coinkubationspunkt resuspendiert ist, bereiten Sie eine 96-Well-Platte für eine serielle Verdünnung und LBS-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika vor, auf denen die Verdünnung auf die gleiche Weise wie Schritt 2.4.1 zu erkennen ist.
    3. Führen Sie die Schritte 2.4.2-2.4.6 aus, um die serielle Verdünnung für T-Endmessungen abzuschließen.
      HINWEIS: Eine wichtige Kontrolle sollte bei der anfänglichen Optimierung des Coinkubations-Assays enthalten sein. Am Ende der Coinkubationszeit, Platte die gemischten Stämme auf Medien, die beide Antibiotika umfasst. Keiner der Stämme sollte wachsen können, es sei denn, 1) eine spontane Mutation tritt auf, oder 2) wählbare Marker werden zwischen Stämmen ausgetauscht.

3. Visualisierung von Coinkubationen mittels Fluoreszenzmikroskopie

  1. Bild jeden Coinkubationspunkt auf LBS-Agar-Petriplatten aus den Schritten 2.3.3 und 2.3.4 mit einem Stereomikroskop, das für die Grüne und rote Fluoreszenzdetektion ausgestattet ist und mit den Fluoreszenzproteinen korrespondiert, die auf den stabilen Plasmiden exprimiert werden.
  2. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern des Kontrollkoinkubationspunkts (Referenzstamm pVSV102 + Referenzstamm pVSV208).
    1. Passen Sie die Vergrößerung so an, dass der Spot im Fokus steht.
    2. Mit dem geeigneten Anregungslicht und Filter zur Beobachtung von GFP, stellen Sie die Belichtungszeit so ein, dass nur fluoreszenz vom Coinkubationspunkt nachweisbar ist und jede Hintergrundfluoreszenz von den Medien gering oder nicht sichtbar ist.
    3. Ändern Sie das Anregungslicht und den Filter, um RFP zu beobachten, und passen Sie die Belichtungszeit an, um den Hintergrund vom Medium zu minimieren.
  3. Für jeden Coinkubationspunkt aus den experimentellen Behandlungen bildweise für den Referenzstamm unter Verwendung des GFP-Filters und der Belichtungszeit in Schritt 3.2.2.
  4. Stellen Sie die Konkurrenzdehnung mit dem RFP-Filter auf und passen Sie die Belichtungszeit so an, dass die Fluoreszenz nur vom Coinkubationspunkt und der Hintergrundfluoreszenz aus dem Medium beobachtet wird. Speichern Sie beide Bilder, und benennen Sie sie, um beide Dehnungs-IDs, die Replikationsnummer, die Inkubationszeit beim Aufnehmen des Bildes (z. B. 24 h) einzuschließen. Wiederholen Sie dies für alle Replikationen.
    HINWEIS: Die Coinkubationszeit muss möglicherweise für verschiedene Plasmide oder Bakterienarten angepasst werden. Siehe Diskussion zur Optimierung.

4. Datenanalyse

  1. Berechnung von KBE für jede Steuerung und experimentelle Behandlung zu jedem Zeitpunkt (T-Start und T-Finale)
    1. Sobald die Kolonien auf seriellen Verdünnungsplatten sichtbar sind (z.B. 24 h bei 24 °C für V. fischeri), identifizieren Sie den Verdünnungsfaktor, bei dem einzelne Kolonien gezählt werden können und nicht zu großen, mehrkolonien Clustern zusammengewachsen sind (Abbildung 2B). Zählen und erfassen Sie für jede Replikation die Anzahl der einzelnen Kolonien für eine gegebene Verdünnung. Diese Zahl stellt die KBE für diese Replikation dar.
    2. Konvertieren Sie KBE für die Verdünnung in die Gesamt-KBE für jeden Stamm in der Coinkubation mit der folgenden Formel:
      [ KBE -(Verdünnungsfaktor x Vol. des Verdünnungsflecks)] x Vol. der unverdünnten Probe = Gesamt-KBE
      Beispiel: T0: [(6 KBE) (10 x 6 x 0,005 ml)] x [0,01 ml] = 1,2E7 Gesamt-KBE-Stamm 1 am gemischten Punkt zu Beginn des Experiments
      T5: [(4 KBE) -(10x-3 x 0,005 ml)] x [1,0 ml] = 8,0E5 Gesamt-KBE-Stamm 1 im mischen den Ort nach 5 h Coinkubierung
      Die CFU-Werte für jeden Stamm zu jedem Zeitpunkt sind die Rohdaten, die für verschiedene Analysen und statistische Tests verwendet werden können (siehe Abschnitt 4.2 unten).
  2. Führen Sie die folgenden Datentransformationen durch, um festzustellen, ob eine Konkurrenzdehnung die Referenzbelastung übertrifft, indem Sie (i) bestimmen, ob der Anteil der Referenzdehnung in Gegenwart der Konkurrenzdehnung abnimmt, oder (ii) die Berechnung der relativen Wettbewerbsindex (RCI). Diese Analysen wandeln Rohdaten in Verhältnisse um und können nützlich sein, um das Wettbewerbsergebnis einer Wechselwirkung zu bestimmen, können jedoch den Mechanismus des Wettbewerbs (d. h. Tötung vs. Wachstumshemmung) nicht bestimmen.
    1. Berechnung des Anteils jedes Stammes für jeden Zeitpunkt während der Coinkubation
      1. Konvertieren Sie KBE-Daten in den Anteil jeder Sorte in einer Behandlung. Dividieren Sie für die Referenzdehnung (RS) bei T0 die Gesamt-KBE für die Referenzdehnung bei T0 durch die Summe der Gesamt-KBE für die Referenzdehnung und den Wettbewerber (CS) bei T0:
        RS T0-KBE (RST0 KBE + CST0 KBE) = Anteil der Referenzdehnung bei T0.
        Führen Sie dieselbe Berechnung durch, um den Anteil der Konkurrenzdehnung bei T0 zu bestimmen:
        CS T0-KBE (RST0 KBE + CST0 KBE) = Anteil der Referenzdehnung bei T0
        Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Zeitpunkt und replizieren Sie sowohl für die experimentelle Behandlung als auch für die Kontrollbehandlung (differenziell markierte Referenzstammkoinkubation).
      2. Grafisch den durchschnittlichen Anteil jedes Dehnungstyps bei T0 und T5 in einem gestapelten Balkendiagramm (Abbildung 3A).
      3. Stellen Sie sicher, dass das gewünschte Ausgangsverhältnis der Dehnungen erreicht wurde. Bei Koinkubationen, bei denen die Stämme zunächst 1:1 gemischt wurden, sollte jeder Stammtyp 0,5 USD der Bevölkerung bei T0 umfassen und sich nicht statistisch untereinander mit Hilfe eines Schüler-T-Tests unterscheiden (P > 0,05). Wenn der Anteil einer Sorte signifikant größer ist als der der anderen Sorte bei T0, wiederholen Sie das Experiment, bis ein Startverhältnis von 1:1 erreicht ist.
      4. Bestimmen Sie, ob der Mitbewerberstamm einen signifikant größeren Anteil der Bevölkerung nach 5 h ausmacht. Führen Sie einen Studenten-T-Test durch, in dem der Anteil der einzelnen Stämme in der experimentellen Behandlung bei T0 und T5 verglichen wird. Wenn sich der Anteil der Konkurrenzstämme erheblich von dem der Referenzsorte bei T5 (P < 0,05) unterscheidet, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass ein Dehnungswettbewerb stattgefunden haben könnte. Fahren Sie mit Schritt 4.2.1.5 fort.
      5. Um festzustellen, ob das Vorhandensein der Konkurrenzdehnung den Anteil der Referenzdehnung nach 5 h verringert, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, in dem der Anteil der Referenzdehnung in der Steuerung mit dem Anteil der Referenzspannung in der experimentelle Behandlung (Referenzstamm gegen Konkurrenzstamm).
        ANMERKUNG: Wenn der Anteil der Referenzspannung in der experimentellen Behandlung statistisch niedriger ist als die Kontrolle (P < 0,05), verringerte die Konkurrenzdehnung den Anteil der Referenzdehnung nach 5 h und übertraf die Referenzbelastung.
    2. Berechnung des Protokoll-RCI-Werts für jede Behandlung (einschließlich des Steuerelements)
      HINWEIS: Der relative Wettbewerbsindex (RCI) ist ein einzelner Wert, der vergleicht, wie sich das Endverhältnis von Dehnungsarten vom Ausgangsverhältnis unterscheidet. Der RCI-Wert wird so log-transformiert, dass ein Log-RCI-Wert größer als Null angibt, dass der Konkurrentstamm (CS) den Referenzstamm (RS) übertraf, ein Log-RCI-Wert kleiner als Null angibt, dass der Referenzstamm den Mitbewerberstamm übertraf, und ein Protokoll-RCI Wert von Null gibt an, dass keine der Beiden Stämme übertroffen wurde.
      1. Berechnen Sie die RCI-Werte für jede Steuerung und experimentelle Behandlung mit der folgenden Gleichung:
        Log [(CST5 CFU - RST5 CfUs)
      2. Diagramm-Protokoll-RCI-Werte mit einem getrennten Box- und Whisker-Plot, in dem Daten in horizontaler Richtung dargestellt werden (Abbildung 3B).
      3. Bestimmen Sie, ob sich jede Behandlung signifikant von Null unterscheidet, indem Sie den t-Test eines Schülers durchführen, der die Protokoll-RCI-Werte jeder Behandlung (einschließlich des Steuerelements) mit einem Datensatz vergleicht, der die gleiche Anzahl von Replikationen mit einem Nullwert vergleicht. Wenn die Log-RCI-Werte für die experimentelle Behandlung statistisch größer als Null sind (P < 0,05), dann übertraf die Konkurrenzsorte die Referenzsorte.
        HINWEIS: Das Steuerelement sollte sich statistisch nicht von Null unterscheiden (P > 0,05), da die differenziell markierten Referenzstämme isiserisch sind.
      4. Führen Sie einen T-Test eines Schülers durch, um festzustellen, ob die RCI-Log-Werte für die experimentelle Behandlung signifikant größer waren als die Kontrolle (P < 0,05). Wenn die Log-RCI-Werte aus der experimentellen Behandlung statistisch höher sind als die Kontrollbehandlung, dann übertraf die Konkurrenzsorte den Referenzstamm.
  3. Führen Sie die folgende statistische Analyse durch, um den Mechanismus zu bestimmen, mit dem der Konkurrent-Stamm den Referenzstamm übertrifft: (i) analysieren Sie rohe Gesamt-CFU-Daten oder (ii) untersuchen Sie die prozentuale Wiederherstellung des Referenzstamms. Diese Analysen können im Vergleich zu den Analysen aus Schritt 4.2 umständlicher zu sehen sein, werden jedoch feststellen, ob die Konkurrenzbelastung die Referenzbelastung übertrifft, indem sie sie überwindet, das Wachstum der Referenzstämme hemmt oder den Referenzstamm aktiv eliminiert.
    1. Analysieren von rohen Gesamt-CFU-Daten
      1. Graphische Gesamt-CFU-Daten für beide Stämme mithilfe eines überkreuzten Streudiagramms, wobei Replikationen als einzelne Datenpunkte angezeigt werden (Abbildung 4A). Zeigen Sie Daten auf einer Protokollskala an, und fügen Sie eine horizontale Linie hinzu, die die durchschnittliche T0-KBE für beide Stämme angibt.
      2. Um festzustellen, ob sich das Vorhandensein des Mitbewerberstamms negativ auf den Referenzstamm auswirkt, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, der Referenzstamm-KBE für die Kontrolle und experimentelle Behandlungen bei T5 vergleicht. Wenn die Referenzstamm-KBE in der experimentellen Behandlung statistisch niedriger sind als bei der Kontrolle (P < 0,05), dann wirkte sich das Vorhandensein der Konkurrenzdehnung signifikant auf die Referenzdehnung aus.
      3. Um festzustellen, ob das Vorhandensein der Konkurrenzstämme das Wachstum des Referenzstamms hemmte oder eliminierte, führen Sie einen T-Test eines Schülers durch, der die Referenzstamm-KBE bei T0 und T5 für die Kontroll- und experimentellen Behandlungen vergleicht.
        HINWEIS: In Ermangelung eines Wettbewerbers sollte die Referenzsorte beim Vergleich von T0 und T5 bei der Kontrollbehandlung einen signifikanten Anstieg der KBE aufweisen. Bei der Analyse der experimentellen Behandlung, wenn referenzierte Stamm KBE bei T5 nicht statistisch anders sind als T0 (P > 0,05), dann hemmte die Konkurrenzstamm das Wachstum der Referenzstamm. Wenn die Referenzsorte T5 KBE deutlich niedriger ist als T0-KBE (P < 0,05), dann hat die Konkurrenzstammdie Referenzstamm abgetötet.
    2. Berechnung der prozentualen Rückgewinnung des Referenzstamms
      1. Transformieren Sie die gesamten CFU-Daten für den Referenzstamm (RS) in prozentuale Wiederherstellungsdaten mithilfe der folgenden Gleichung:
      2. (RS T5-KBE bei RS T0-KBE) x 100 = % Rückgewinnung des Referenzstamms
      3. Zeigen Sie die prozentuale Wiederherstellung des Referenzstamms mithilfe eines getrennten Balkendiagramms an, in dem jeder Balken entweder die Steuerung oder die experimentelle Behandlung darstellt (Abbildung 4B). Fügen Sie eine gestrichelte Linie bei y = 100 hinzu, um eine 100%ige Wiederherstellung des Referenzstamms anzuzeigen (keine Erhöhung oder Abnahme der Referenzstamm-KBE von 0 h auf 5 h).
      4. Um festzustellen, ob sich der Beibewerberstamm negativ auf den Referenzstamm ausgewirkt hat, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, in dem die Rückgewinnung der Referenzstammprozente für die Kontrollbehandlung mit der experimentellen Behandlung verglichen wird. Wenn die prozentuale Erholung deutlich geringer ist als die Kontrolle (P < 0,05), dann hat sich die Konkurrenzbelastung negativ auf die Referenzbelastung ausgewirkt.
      5. Um festzustellen, ob der Konkurrenzstamm das Wachstum des Referenzstamms hemmte oder eliminierte, führen Sie einen Schüler-T-Test durch, der die Anpassung der Referenzstammprozente für die experimentelle Behandlung vergleicht, und einen Datensatz mit der gleichen Anzahl von Replikationen, die alle mit einem Wert von 100.
        HINWEIS: Wenn sich die experimentelle Behandlung statistisch nicht von 100 unterscheidet (P > 0,05), hemmte die Konkurrenzstämme das Wachstum der Referenzsorte. Wenn die Referenzstammprozentuale Erholung in der experimentellen Behandlung deutlich niedriger als 100 ist (P < 0,05), dann hat die Konkurrenzstammdiel den Referenzstamm abgetötet.
    3. Interpretation von Fluoreszenzmikroskopiebildern
      1. Sobald Fluoreszenzmikroskopie-Bilder aufgenommen wurden, bestimmen Sie, ob jeder Stamm im Coinkubationspunkt sichtbar nachweisbar ist. Für die Kontrollkoinkubation (Referenzstamm pVSV102 + Referenzstamm pVSV208) sollten sowohl GFP als auch RFP von einem Coinkubationspunkt aus sichtbar sein. Wenn dies nicht der Fall ist, richten Sie das Experiment erneut ein, um sicherzustellen, dass die Stämme ordnungsgemäß gekennzeichnet und auf antibiotikafreien Platten kodieriert werden.
      2. Überprüfen Sie für jeden experimentellen Coinkubationspunkt, ob mögliche Ergebnisse erzielt werden können.
        HINWEIS: Wenn der Konkurrenzstamm sichtbar ist, aber der Referenzstamm nicht erkannt wird, deutet dies darauf hin, dass die Konkurrenzstammbelastung das Wachstum des Referenzstamms abgetötet oder gehemmt hat. Wenn beide Stämme vorhanden und gleichmäßig gemischt sind (GFP und RFP sind während des gesamten Coinkubationsspots vorhanden), deuten diese Daten darauf hin, dass die Konkurrenzsorte nicht mit der Referenzsorte konkurriert und beide Stämme nebeneinander existieren. Wenn beide Stämme vorhanden sind, aber räumlich getrennt sind (Mikrokolonien von GFP oder RFP sind im gesamten Coinkubationspunkt vorhanden), deutet dies darauf hin, dass die Referenz- und die Konkurrenzbelastung zu Wettbewerbsinteraktionen und Modifikationen der Referenzstamm oder das anfängliche Coinkubationsverhältnis erforderlich sein. Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion.

5. Bestimmen, ob die Interaktion kontaktabhängig ist

HINWEIS: Wenn Sie feststellen, dass eine Sorte den Referenzstamm abtötet oder hemmt, kann die Wechselwirkung diffusierbar oder kontaktabhängig sein. Um festzustellen, ob die Wechselwirkung vom Zell-Zell-Kontakt abhängig ist, führen Sie einen Coinkubationstest durch, wie oben beschrieben für die Schritte 1-2 mit den folgenden Modifikationen beschrieben.

  1. Führen Sie die Schritte 1.1-2.2 aus.
  2. Sobald die Stämme normalisiert sind, trennen sich die Stämme physikalisch mit einem Nitrozellulosefilter mit einer Porengröße von 0,22 mm. Diese Porengröße ermöglicht die Diffusion von antimikrobiellen und kleinen Molekülen, verhindert aber den physischen Kontakt zwischen V. fischeri-Zellen.
    HINWEIS: Wenn die Wechselwirkung vom Zell-Zell-Kontakt abhängt, sollte die Trennung des Referenzstamms vom Konkurrenzstamm mit dem Filter den tötenden oder hemmenden Phänotyp abschalten und der Referenzstamm sollte keine reduzierte KBE haben. Wenn die Wechselwirkung nicht vom Zell-Zell-Kontakt abhängig ist und ein diffusierbarer Mechanismus ist, sollte die Trennung der Stämme nicht verhindern, dass die Konkurrenzstämme den Referenzstamm abtöten.
    1. Spot 5 ml der Referenzbelastung auf die Mitte eines Filters und Spot 5 ml der Konkurrenz Belastung auf die Mitte eines anderen Filters. Platzieren Sie den Filter, der den Referenzstamm enthält, auf die Oberfläche einer LBS-Agarplatte. Platzieren Sie den Filter, der die Konkurrenzbelastung enthält, direkt auf den Filter mit der Referenzdehnung.
      HINWEIS: Jede Sorte wird auf Filtern und nicht auf die Bodensorte, die direkt auf der Agarplatte gefleckt wird, gesichtet, sodass die Dehnungen leichter direkt übereinander platziert werden können.
    2. Wenn befürchtet wird, dass Stämme nicht direkt übereinander gestapelt werden, verringern Sie das Volumen des Referenzstamms Inokulum, das auf den Filter gefleckt wird. Dadurch wird sichergestellt, dass der Bereich des Referenzstamms kleiner und vollständig über oder unter der Konkurrenzdehnung liegt. Alternativ, welche Sorte auf der Oberseite und auf dem Boden ist, um Unterschiede in der Diffusion von Nährstoffen aus dem Agar-Medium zu berücksichtigen.
    3. Um sicherzustellen, dass der Filter die Diffusion kleiner Moleküle ermöglicht, schließen Sie eine Kontrollbehandlung ein, bei der der Referenzstamm auf einem Filter und ein Antibiotikum, auf das er empfindlich ist (Chloramphenicol), auf dem anderen gesichtet wird. Stapeln Sie die Filter direkt übereinander und legen Sie sie auf eine LBS-Agarplatte. Das Antibiotikum sollte durch den Filter diffundieren und den Referenzstamm abtöten können.
  3. Inkubieren Sie die Platten mit Filtern bei 24 °C für 5 h. Umdie Agarplatte nicht beim Inkubieren umkehren, um das Verschieben der Filter zu vermeiden.
  4. Führen Sie serielle Verdünnungen für das Startinokulum nach Schritt 2.4 durch.
  5. T-Endmessungen
    1. Übertragen Sie jeden Filtersatz mit steriler Pinzette in ein 50 ml Falcon-Rohr, das 5 ml LBS-Brühe enthält. Stellen Sie sicher, dass die Filter innerhalb des Rohrs physisch getrennt sind, um eine vollständige Resuspension jedes Dehnungstyps zu ermöglichen.
    2. Setzen Sie die Stämme von Filtern wieder auf, indem Sie nach oben und unten pipetieren, bis die Filter alle Zellen frei sind. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Filter zu drehen und Zellmaterial von beiden Seiten zu löschen. Sterilisieren Sie eine Pinzette mit Ethanol zwischen den Proben.
    3. Führen Sie die serielle Verdünnung für T final gemäß Schritt 2.5 durch. Bei der Berechnung der Gesamt-KBE für T-End wird das "Gesamtvolumen der unverdünnten Probe" von 1 ml auf 5 ml angepasst.

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Results

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Um die Wechselwirkungen zwischen Bakterienpopulationen zu bewerten, wurde ein Coinkubations-Assay-Protokoll entwickelt und für V. fischerioptimiert. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Proteine kodieren, was eine Differenzauswahl und visuelle Diskriminierung jedes Stammes ermöglicht. Durch die Analyse der Daten, die aus dem Coincubation-Test gesammelt wurden, können das Wettbewerbsergebnis einer Interaktion und der Mechanismu...

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Discussion

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Der oben beschriebene Coincubation-Assay bietet eine leistungsstarke Methode, um interbakterielle Konkurrenz zu entdecken. Dieser Ansatz ermöglichte die Ermittlung des intraspezifischen Wettbewerbs zwischen V. fischeri Isolaten und die Charakterisierung des Wettbewerbsmechanismus19. Obwohl die beschriebene Methode für das marine Bakterium V. fischerioptimiert wurde, kann es leicht modifiziert werden, um andere Bakterienarten einschließlich klinischer und ökologischer Isolate aufz...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Wir danken den Rezensenten für ihr hilfreiches Feedback. A.N.S. wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation durch Grant GBMF 255.03 an die Life Sciences Research Foundation unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenFisher05-408-129
10 μ L Mehrkanalpipette
100 μ L Mehrkanalpipette
300 μ L Mehrkanalpipette
10 μ L Einkanalpipette
20 μ L Einkanalpipette
200 μ L Einkanalpipette
1.000 μ L Einkanalpipette
24-Well-PlattenFisher07-200-84steril mit Deckel
96-Well-PlattenVWR10062-900steril mit
Deckel Taschenrechner
ChloramphenicolSigmaC0378Stamm (20 mg/mL in Ethanol); Endkonzentration in Medien (2 & mu; g/mL LBS)
Fluoreszenz-Präpariermikroskop mit Kamera und Bildgebungssoftware
PinzetteFisher08-880
KanamycinsulfatFisherBP906-5Stamm (100 mg/mL in Wasser, Filter sterilisieren); Endkonzentration in Medien (1 & mu; g/mL LBS)
Nitrozellulosemembran (FS MCE, 25MM, NS)FisherSA1J788H50,22 μ m Nitrozellulosemembran (pk à 100)
PetriplattenFisherFB0875713steril mit Deckel
Spektralphotometer
Semi-MikroküvettenVWR97000-586
TipOne 0,1-10 μ L StartersystemUSA Scientific1111-350010 Racks
TipOne 200 μ L StartersystemUSA Scientific1111-50010 Racks
TipOne 1000 μ L StartersystemUSA Scientific1111-252010 Racks
Vortex
NameCompany<strong>Katalognummer<>Comments
LBS media
1 M Tris Puffer (pH ~7,5)50 mL 1 M Stammpuffer (62 mL HCl, 938 mL DI Wasser, 121 g Trizma Base)
Agar TechnicalFisherDF0812-17-915 g (Nur für Platten hinzufügen)
DI Wasser950 mL
NatriumchloridFisherS640-320 g
TryptonFisherBP9726510 g
HefeextraktFisherBP9727-25 g

References

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  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086(2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068(2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869(2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031(2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734(2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).

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