Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

Zusammenfassung

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Zusammenfassung

Neben linearen mRNAs erzeugen viele eukaryotische Gene kreisförmige RNAs. Die meisten kreisförmigen RNAs werden generiert, indem eine 5' Spleißstelle mit einer vorgelagerten 3' Spleißstelle innerhalb einer Pre-mRNA, einem Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird, angeschlossen wird. Diese Zirkularisierung wird wahrscheinlich durch sekundäre Strukturen in der Pre-mRNA unterstützt, die die Spleißstellen in die Nähe bringen. In menschlichen Genen werden Alu-Elemente gedacht, um diese sekundären RNA-Strukturen zu fördern, da Alu-Elemente reichlich vorhanden sind und Basiskomplementaritäten miteinander aufweisen, wenn sie in entgegengesetzten Richtungen in der Pre-mRNA vorhanden sind. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Analyse großer Alu-Elemente, die Reportergene enthalten, die kreisförmige RNAs bilden. Durch die Optimierung von Klonprotokollen können Reportergene mit bis zu 20 kb Insert-Länge erzeugt werden. Ihre Analyse in Co-Transfektionsexperimenten ermöglicht die Identifizierung regulatorischer Faktoren. So kann diese Methode RNA-Sequenzen und zelluläre Komponenten identifizieren, die an der kreisförmigen RNA-Bildung beteiligt sind.

Einleitung

Zirkuläre RNAs
Circular RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene einsträngige RNAs, die in den meisten Organismen exprimiert werden. Sie werden erzeugt, indem sie eine nachgelagerte 5' Spleißstelle zu einem vorgelagerten 3' Spleißstandort verbinden, ein Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird (Abbildung 1A)¹. Sequenzen in der Pre-mRNA, die eine Basis komplementär wie 30-40 nt aufweisen, bringen Back-Splice-Sites in die richtige Ausrichtung für die zirkRNA-Bildung². Beim Menschen bilden Alu-Elemente ¹, die etwa 11....

Protokoll

1. Konstruktion der Konstrukte

1. Verwenden Sie den UCSC-Genombrowser^24, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung erforderlich sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen.
2. Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz(Supplemental Abbildung 1 ist eine Testsequenz) in https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start ein und wählen Sie den richtigen Organismus aus. Senden Sie die Sequ....

Ergebnisse

Reportergene ermöglichen die Bestimmung regulatorischer Faktoren, die die zirkuläre RNA-Bildung beeinflussen. Diese Reportergene sind jedoch groß und enthalten sich wiederholende Elemente, die DNA-Konstrukte oft instabil machen. Aufgrund ihrer großen Größe ist es oft notwendig, Teile der Introns zu löschen, was durch die Verstärkung genomischer Teile mit den Exons und kleineren flankierenden intronischen Teilen erreicht wird. Diese DNA-Stücke werden enzymatisch zusammengesetzt, so dass Enzyme ohne Einschränkung aufgebaut.......

Diskussion

Im Allgemeinen sind kreisförmige RNAs niedrig reichlich¹, was die Untersuchung ihrer Funktion und Bildung erschwert. Ähnlich wie bei linearen RNAs¹³ermöglicht die Verwendung von Reporter-Minigenes die Identifizierung von cis und trans-wirkenden Faktoren, die die Bildung von kreisförmigen RNAs regulieren. So erzeugt dieser Ansatz Hypothesen, die mit den endogene Genen weiter getestet werden können.

Der wichtigste Schritt ist das Design des Reporte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(PEI) Hydrochlorid	Polysciences	24765-1
Bauwerkzeug	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.	Clare Chemical Research
Assemblierungskit für enzymatische DNA	NEB	E2621S
Gel- und PCR-Aufreinigungskit	Promega	A9282
Glyco Blue	Thermo	Fisher AM9516
pcDNA3.1 Klonierungsstelle	Polyklonierungsstelle		https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1	NEB	M0491L	Q5 DNA-Polymerase
Polymerase 2	Biorad	1725310	Long Range Polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2	Qiagen	206402	Qiagen Long Range Polymerase
Kit Reverse Transkriptase	Thermo Fisher	18080044 RNA-Isolationskit
	Life Technologies	12183025	Ambion von Life Technologies
RNAse R	Lucigen	RNR07250	Epicenter/Lucigen
Stabile kompetente Zellen	NEB	C3040H	NEB stabile Zellen
Standard Klonierung von Bakterien	NEB	C2988J	NEB5-alpha kompetentes Web-Tool
zum Entwerfen von Primern	NEB		https://nebuilder.neb.com/#!/Webbasierte
Temperaturberechnungen	NEB		https://tmcalculator.neb.com/#!/main