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Methodenartikel

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

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DOI:

10.3791/59760

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10. März 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Zusammenfassung

Neben linearen mRNAs erzeugen viele eukaryotische Gene kreisförmige RNAs. Die meisten kreisförmigen RNAs werden generiert, indem eine 5' Spleißstelle mit einer vorgelagerten 3' Spleißstelle innerhalb einer Pre-mRNA, einem Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird, angeschlossen wird. Diese Zirkularisierung wird wahrscheinlich durch sekundäre Strukturen in der Pre-mRNA unterstützt, die die Spleißstellen in die Nähe bringen. In menschlichen Genen werden Alu-Elemente gedacht, um diese sekundären RNA-Strukturen zu fördern, da Alu-Elemente reichlich vorhanden sind und Basiskomplementaritäten miteinander aufweisen, wenn sie in entgegengesetzten Richtungen in der Pre-mRNA vorhanden sind. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Analyse großer Alu-Elemente, die Reportergene enthalten, die kreisförmige RNAs bilden. Durch die Optimierung von Klonprotokollen können Reportergene mit bis zu 20 kb Insert-Länge erzeugt werden. Ihre Analyse in Co-Transfektionsexperimenten ermöglicht die Identifizierung regulatorischer Faktoren. So kann diese Methode RNA-Sequenzen und zelluläre Komponenten identifizieren, die an der kreisförmigen RNA-Bildung beteiligt sind.

Einleitung

Zirkuläre RNAs
Circular RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene einsträngige RNAs, die in den meisten Organismen exprimiert werden. Sie werden erzeugt, indem sie eine nachgelagerte 5' Spleißstelle zu einem vorgelagerten 3' Spleißstandort verbinden, ein Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird (Abbildung 1A)1. Sequenzen in der Pre-mRNA, die eine Basis komplementär wie 30-40 nt aufweisen, bringen Back-Splice-Sites in die richtige Ausrichtung für die zirkRNA-Bildung2. Beim Menschen bilden Alu-Elemente 1, die etwa 11% des Genoms3darstellen, aufgrund ihrer Selbstkomplementärität4,5 umfangreiche doppelsträngige RNA-Strukturen in pre-mRNA und fördern damit die Bildung von CircRNAs1.

Derzeit wurden drei Hauptfunktionen von circRNAs beschrieben. Einige circRNAs binden microRNAs (miRNAs) und wirken durch Sequestrierung wie miRNA Schwämme6. CircRNAs wurden in die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulierung, durch Wettbewerb mit linearer Spleißung7 oder Modulation der Transkriptionsfaktoraktivität8verwickelt. Schließlich enthalten circRNAs kurze offene Leserahmen und Grundsatzstudien zeigen, dass sie9,10übersetzt werden können. Die Funktion der meisten circRNAs bleibt jedoch rätselhaft. Die meisten zirkulären RNAs wurden mit den Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation11erkannt. Detaillierte Analysen einzelner Gene mit gezielten RT-PCR-Ansätzen zeigen, dass eine große Anzahl von kreisförmigen RNAs noch entdeckt werden muss12.

Einsatz von Reportergenen zur Analyse der Pre-mRNA-Verarbeitung
Die Analyse von mRNA, die von DNA-Reporterkonstrukten abgeleitet wurde, die in Zellen transfiziert werden, ist eine etablierte Methode zur Untersuchung alternativer Pre-mRNA-Spleißungen, die auf kreisförmige RNAs angewendet werden können. Im Allgemeinen werden das alternative Exon, seine umgebenden Introns und konstitutive Exons verstärkt und zu einem eukaryotischen Expressionsvektor geklont. Häufig werden die Introns verkürzt. Die Konstrukte werden in eukaryotische Zellen transfiziert und in der Regel von RT-PCR13,14analysiert. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um regulatorische Spleißstellen und transacting Faktoren in Co-Transfektionsexperimenten13,15,16,17,18zu kartieren. Darüber hinaus ermöglichte die Erzeugung von proteinexstigen Minigenen das Screening von Substanzen, die alternative Spleißen ändern19,20.

Die Methode wurde auf zirkuläre RNAs angewendet. Derzeit sind mindestens 12 Minigen-Rückgrate in der Literatur beschrieben und in Tabelle 1zusammengefasst. Mit Ausnahme des tRNA-basierten Expressionssystems21,22sind sie alle von Polymerase-II-Promotoren abhängig. Hier beschreiben wir eine Methode zur Generierung menschlicher Reporter-Minigene, um cis und trans-acting Faktoren zu bestimmen, die an der Erzeugung von kreisförmigen RNAs beteiligt sind. Eine Übersicht über die Methode anhand von Sequenzen eines veröffentlichten Reportergens23 ist in Abbildung 1dargestellt.

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Protokoll

1. Konstruktion der Konstrukte

  1. Verwenden Sie den UCSC-Genombrowser24, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung erforderlich sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen.
  2. Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz(Supplemental Abbildung 1 ist eine Testsequenz) in https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start ein und wählen Sie den richtigen Organismus aus. Senden Sie die Sequenz und gehen Sie zur Browseransicht, zoomen Sie 1,5x oder ggf. (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Die Suchsequenz wird in der oberen Zeile(Abbildung 2A, 1) angezeigt. Abhängig von der Reihenfolge der Exons in der kreisförmigen RNA verbindet BLAT nicht alle Exons. In diesem Beispiel ist exon 12 (Abbildung 2A, 4) nicht mit 11 verbunden ( Abbildung2A, 2, 3), da exon 12 vor Exon 11 in der kreisförmigen RNA-Sequenz (Supplementale Abbildung 1) liegt. Die sich wiederholenden Elemente befinden sich in der Spur "Wiederholungsmasker", die durch Kästchen gekennzeichnet ist, wobei die farbeschwarze bis graue Farbe die evolutionäre Konservierung anzeigt (Abbildung 2A, 5).
  3. Bewegen Sie die Maus über die sich wiederholenden Elemente, um ihren Subtyp in einem unverankerten Fenster zu identifizieren. Alu-Elemente befinden sich in der SINE-Linie (kurz durchsetztes Kernelement). Verwenden Sie die Schaltfläche "Standardspuren" unter dem Fenster, um den Browser zurückzusetzen, wenn ein anderes Bild als Abbildung 2 erhalten ist.
    HINWEIS: Das Mousing über die Exons in der Genanzeige erzeugt ein Fenster mit Exon-Nummern, die computergeneriert sind. Diese Zahlen entsprechen nicht der in der Literatur festgelegten Exonnummerierung und wechseln auch zwischen Isoformen.

2. Wählen Sie die Sequenz aus, die in einem Ausdrucksvektor geklont werden soll.

  1. Laden Sie die im Fenster gezeigte DNA-Sequenz herunter, indem Sie in der oberen Zeile des UCSC-Genombrowsers die Ansichts-DNA aufrufen. Wählen Sie in der Option Sequencing Formatting OptionErweiterte Fall-/Farboptionenaus.
  2. Wählen Sie die Standardgroß-Kleinschreibung als Niedriger aus, und wählen Sie die Umschaltanfrage für NCBI refseqaus. Wählen Sie Unterstreichung und Fett und Kursiv für Repeat Maskeraus. Klicken Sie auf Senden. Es wird Exons als Großbuchstaben und Introns als kleine Buchstaben geben. Überprüfen Sie die Exon-/Intron-Grenzen.
  3. In diesem Beispiel gibt es eine 'ccctttacCTTTTT' Sequenz, die angibt, dass der Browser die umgekehrte Ergänzung anzeigt. Wenn dies der Fall ist, gehen Sie zurück und wählen Sie das umgekehrte Komplementfeld aus, bis Sie die richtigen Exon-Intron-Grenzen (agEXONgt) sehen, in diesem Beispiel AAAAAGgtaaaggg.
  4. Kopieren Sie die Datei mit der richtigen Ausrichtung (interne Exons sind von intronic ag umgeben... gt) in ein Textverarbeitungsdokument einfließen und die Exons hervorheben (Ergänzende Abbildung 2).
    HINWEIS: In diesem Beispiel ist das genomische Fragment, das die Exons 9-12 umfasst, etwa 24 kb groß und damit zu groß, um aus der genomischen DNA verstärkt zu werden. Daher wird jedes Exon, das von ca. 1 kb intronic-Region umgeben ist, individuell verstärkt und diese vier Fragmente werden in einem Klonvektor zusammengesetzt.
  5. Wählen Sie die zu verstärkenden Fragmente aus (exon 500 nt intron). Stellen Sie sicher, dass das Intron nicht in einem sich wiederholenden Bereich beginnt oder endet, da Primer in diesen Regionen bestimmte Sequenzen nicht verstärken. Die ausgewählten Regionen sind in Abbildung 2Bdargestellt, ihre Sequenzen in der ergänzenden Abbildung 3.
    ANMERKUNG: Im Allgemeinen gilt: Je größer die Konstrukte, desto schwieriger wird das Klonen. Die Fragmente können entweder schrittweise zusammengesetzt werden (d.h. exon 9 wird mit dem Vektor kombiniert und im nächsten Schritt wird exon 10 durch Klonen in dieses Konstrukt eingeführt, bis alle Exons an Ort und Stelle sind), oder alternativ werden alle Fragmente gleichzeitig zusammengesetzt. Ein schrittweiser Ansatz funktioniert immer, erfordert aber mehr Zeit. Eine gleichzeitige Baugruppe funktioniert nicht immer und hängt davon ab, wie gut die einzelnen Fragmente aus der genomischen DNA verstärkt werden können und wie groß das Konstrukt ist. Wir beginnen daher in der Regel mit beiden Ansätzen gleichzeitig.

3. Design-Primer zum Klonen

  1. Verwenden Sie ein Web-Tool (https://nebuilder.neb.com/#!/), um die Primer für das Klonen zu entwerfen. Geben Sie beispielsweise die Fragmente 9, 10, 11 und 12 und die Vektorsequenz (Ergänzende Abbildung 3) in dieses Werkzeug ein.
  2. Fügen Sie für die Vektorsequenz die Einfügestelle als letztes Nukleotid hinzu, und fügen Sie anschließend die Fragmente hinzu. Da die Vektornummerierung nicht mit einer bestimmten Einfügestelle beginnt, befindet sich die Einfügestelle im Vektor und das nachgeschaltete Teil wird vor der Upstream-Sequenz eingelagert. In diesem Beispiel beginnen die Einfügungen direkt nach der HindIII [AAGCTT]-Site und enden direkt nach der PmeI [GTTTAAAC]-Site von pcDNA3.1. Die Sequenz von cccgctgatcag ... ccgtaaaaaggccgc wird vor Position 1 in der pcDNA3.1-Sequenz (gttgctggcgtttttcc ...) eingefügt.
  3. Passen Sie Primer an, wenn ihre Schmelzpunkte mehr als 4 °C voneinander entfernt sind, da sie bei der Verstärkung nicht funktionieren. Die Montage der entworfenen Fragmente und Primersequenzen ist in der ergänzenden Abbildung 4dargestellt. Primer zum Klonen können auch manuell25entworfen werden.

4. PCR- und Amplicon-Erkennung

  1. Standard-PCR-Reaktion: Machen Sie einen Reaktionsmix für ein Gesamtvolumen von 50 l pro Reaktion. Unten ist das Rezept für eine Reaktion mit Polymerase 1:
    10 l 5x Reaktionspuffer
    1 L mit 10 mM dNTPs
    2,5 l von 10 m Vorwärts-Primer
    2,5 l von 10 m Reverse Primer
    0,5 l Polymerase 1
    32,5 l Nukleasefrei H2O
    1. Optional fügen Sie 10 l 5x GC Enhancer hinzu, wenn das Produkt einen hohen GC-Gehalt aufweist; eine separate Mischung mit GC Enhancer herstellen, um die PCR-Reaktion zu testen.
  2. Aliquot 49 l der Mischung in PCR-Röhren pro Reaktionsprobe.
  3. Fügen Sie der PCR 1 l DNA hinzu, die Menge reicht von 10 pg bis 1 ng.
  4. Drehen Sie die Proben herunter, um Rückstände von den Seiten zu entfernen und legen Sie sie in eine PCR-Maschine. Verwenden Sie bei der Optimierung der PCR-Bedingungen die gleiche Maschine sowie die gleichen Stellen in der Maschine.

5. Optimierung für längere DNA-Fragmente für die Verwendung verschiedener Polymerasen

  1. Temperatur
    1. Optimieren Sie die Langstrecken-Polymerase 2.
      1. Verwenden Sie eine niedrigere Denaturierungstemperatur (Polymerase 1: 98 °C, Polymerase 2: 94 °C).
      2. Verwenden Sie eine längere Denaturierungszeit (Polymerase 1: 10 s, Polymerase 2: 30 s).
      3. Verwenden Sie eine längere Glühzeit (Polymerase 1: 30 s, Polymerase 2: 60 s).
      4. Verwenden Sie eine längere Verlängerungszeit (Polymerase 1: 30 s/kb, Polymerase 2: 50 s/kb).
      5. Verwenden Sie eine niedrigere Durchwahltemperatur (Polymerase 1: 72 °C, Polymerase 2: 65 °C).
      6. Verwenden Sie eine Glühtemperatur 5 °C unter dem Tm der Primer.
    2. Optimieren Sie die Primerkonzentrationen (5x weniger bis 5x mehr als die ursprüngliche Primerkonzentration). Optimieren Sie DNA-Konzentrationen von 10 pg bis 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.
    3. Als Beispiel für ein PCR-Programm zur Verstärkung einer Produktgröße von 15 kb mit Polymerase 2 eine anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 30 s, DNA-Denaturierung bei 94 °C für 30 s, gefolgt von Glühen bei 58 °C für 30 s und DNA-Verlängerung bei 65 °C für 12 min 30 s. Führen Sie eine Endverlängerung bei 65 °C für 10 min mit einem letzten 4 °C Halten durch.
      HINWEIS: Die glühende Temperatur (Ta) spezifisch für die Primer, die durch webbasierte Temperaturberechnungen bestimmt werden, die für jede Polymerase spezifisch sind. Erweiterungszeiten können variieren und müssen optimiert werden, wenn Fragmente größer als 10 KB sind.
  2. Verlängerungszeiten und DNA-Konzentrationen
    1. Verwenden Sie längere Verlängerungszeiten für DNA-Fragmente über 6 kb: 1 min pro 1 kb. Längere Fragmente sollten weniger DNA verwenden.
    2. Führen Sie Verdünnungen der DNA durch, um die optimale DNA-Konzentration für die Amplifikation zu finden, in der Regel 1 pg bis 1 ng für Plasmide oder 1 ng bis 1 g für genomische DNA.
      HINWEIS: Für die meisten Klonen verwenden Polymerase 1, entwickelt durch Verschmelzung der Sso7d DNA-Bindungsdomäne zu einer proprietären thermostabilen DNA-Polymerase26. Die Polymerase hat eine niedrige Fehlerrate und aufgrund der Sso7d-Domäne eine hohe Prozessivität, die benötigt wird, um große (10-15 kb) genomische Fragmente zu verstärken. Aufgrund dieser großen Fragmentgröße wird die enzymatische Montage von DNA-Molekülen27 zum Einführen in Vektoren verwendet, da diese Methode keine Restriktionsenzyme erfordert. Die Verstärkung von Fragmenten mit mehr als 15 kb wird mit polymerase 1 immer schwieriger. Für große Fragmentverstärkung verwenden Polymerase 2 aus Pyrococcus-wie Korrektur-Polymerase verschmolzen zu Sso7d oder die Langstrecken-PCR-Kit, die jedoch höhere Fehlerraten gibt.

6. Reinigung von PCR-Produkten zum Klonen

  1. Führen Sie die Hälfte der PCR-Produkte auf 1% Agarose-Gelen, die einen interkalierenden Nukleinsäurefleck enthalten (z. B. 1x GelGreen). Visualisieren Sie die gefärbten Gele auf einem dunklen Lesetransilluminator. Diese gebeizte DNA läuft nicht größengetreu.
    HINWEIS: GelGreen intercalates in DNA, ähnlich wie Ethidiumbromid, aber es wird durch Licht um 500 nm (Cyan) angeregt, eine Wellenlänge, die dna nicht schädigt, was das Klonen stark verbessert.
  2. Parallel dazu die Hälfte der PCR-Produkte auf einem 1%-Gel ausführen, das nach dem Lauf mit Ethidiumbromid gebeizt wird (Abbildung 3A,B).
  3. Verbrauchen Sie Bänder der richtigen Größe aus dem gebeizten Gel (Schritt 6.1) und isolieren SIE DNA mit einem Gel und PCR Cleanup Kit. Abweichend von seinem Standardprotokoll wird die DNA in nur 20 l doppelt destilliertem Wasser, da die DNA-Konzentrationen in der Regel niedrig sind, elute.
  4. Überprüfen Sie vor dem Klonen die isolierte DNA eines Agarose-Gels auf Konzentration und Integrität (Abbildung 3B). Ziel für eine 2:1 Molaren-Einsatz-Vektor-Verhältnis. Bei Verwendung mehrerer Einsätze beträgt das Verhältnis 2:2:2:1.

7. DNA-Montage und Klon-Erkennung

HINWEIS: Das Klonen erfolgt mit einem enzymatischen DNA-Montagekit mit geringfügigen Modifikationen. Die Montage erfolgt für 60 min bei 50 °C und in der Regel wird der untere DNA-Bereich für die Montage verwendet (20-100 fmol/20 l Reaktion). Der gesamte Reaktionsmix wird chemisch kompetenten Zellen zugesetzt und die ganzen Zellen auf einer 6 cm Agarplatte plattiert.

  1. Kombinieren Sie den Vektor und fügen Sie in einem 1:2-Molarenverhältnis (je 20-500 Fmol) in 10 l Wasser ein.
  2. Fügen Sie 10 L DNA Assembly Master Mix hinzu.
  3. Proben 60 Minuten bei 50 °C inkubieren.
  4. Als nächstes transformieren Sie kompetente Zellen mit der Gesamtmontagereaktion. Verwenden Sie hier E. coli-Stamm 1-Zellen für kürzere Konstrukte oder E. coli-Stamm 2-Zellen für längere oder instabile Konstrukte. Die Zellen sollten in einem Volumen von 50 l sein.
  5. Die Zellen auf Demeis auftauen und den kompetenten Zellen 2 L des gekühlten, zusammengesetzten Produkts hinzufügen. Mischen Sie durch sanftes Streichen der Röhre 4-5 mal. Wirbel nicht.
  6. Lassen Sie die Mischung 30 min auf dem Eis sitzen.
  7. Hitzeschock bei 42 °C für 30 s. Nicht mischen.
  8. Übertragen Sie die Röhre für 2 min zurück auf das Eis.
  9. Fügen Sie dem Rohr 950 L RAUMtemperatur-SOC-Medien hinzu.
  10. Inkubieren Sie das Reaktionsrohr bei 37 °C für 60 min. Kräftig schütteln (300 U/min).
  11. Warme Selektionsplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum während der Inkubation bei 37 °C.
  12. Pellet die Zellen durch Zentrifugation (10.000 x g, 30 s) und Platte aus 1/4 und 3/4 der Zellen auf zwei Selektionsplatten und inkubieren bei 37 °C über Nacht.

8. Validierung von Klonen

  1. Verwenden Sie Kolonie-PCR, wobei PCR-Primer verwendet werden, die die Montagestandorte überspannen (Abbildung 1C) für die Erkennung.
  2. Nehmen Sie einen sterilen Zahnstocher und berühren Sie eine einzelne Bakterienkolonie.
  3. Berühren Sie den Boden eines PCR-Rohrs mit dem Zahnstocher, der die Kolonie hat, und streifen Sie dann den Zahnstocher auf einer Antibiotikum-Agarplatte, bebrüten Sie die gestreifte Platte bei 37 °C oder Raumtemperatur für empfindliche Konstrukte über Nacht.
  4. Überlagerung der PCR-Röhre, die mit der Kolonie berührt wurde, mit einem PCR-Mix, der die Erkennungsprimer enthält. Diese werden mit Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) entwickelt. Das Programm hat die Möglichkeit, das Primerdesign über eine definierte Sequenz zu erzwingen, indem die "[ccc]"-Zeichen verwendet werden, um Primer über den Baugruppenknoten auszuwählen. DNA von positiven Stämmen wird isoliert und durch Sequenzierung verifiziert.

9. Analyse von kreisförmigen RNA-exemittiven Reportergenen

  1. Zur Analyse, transfekieren Reporter Gene in eukaryotische Zellen. Verwenden Sie hier HEK293-Zellen (ATTC #CRL-1573), da sie eine hohe Transfektionseffizienz bieten. Um Kosten zu sparen, verwenden Sie PEI-Lösungen (Polyethylenimin).
  2. Für die PEI-Lösung lineares Polyethyleneiminhydrochlorid (PEI) bei 1 mg/ml in Wasser bei niedrigem pH-Wert, pH2 auflösen. Den pH-Wert mit NaOH auf 7 hochbringen. Sterilfilter mit 0,22 m Filtern und bei 4 °C lagern.
  3. Teilen Sie Zellen in sechs Brunnen (ca. 150.000 Zellen pro Brunnen) auf und lassen Sie sie über Nacht in 10% FBS in DMEM-Medien wachsen.
  4. Aliquot 1 g des Reporter-Gens in einer sterilen Röhre und fügen Sie 200 l steril gefiltert150 mM NaCl hinzu. Mischen Sie mit der DNA durch Wirbeln.
  5. Fügen Sie PEI-Lösung zu dieser Mischung und Wirbel, kurz Zentrifuge, um Proben am Boden des Rohres zu sammeln. Verwenden Sie ein Verhältnis von 1 g DNA pro 3 l PEI.
  6. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren und dann direkt zu HEK 293 Zellen hinzufügen.
  7. HEK293-Zellen bei 37 °C, 5%CO2über Nacht inkubieren.
  8. Isolieren Sie RNA für RT-PCR über ein RNA-Isolationskit.

10. RNase R Behandlung zur Entfernung linearer RNAs

  1. Verwenden Sie 10 g Gesamt-RNA in einer RNase-freien Röhre.
  2. 10 l 10x RNase R Puffer (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 M KCl, 1 mM MgCl2) zur RNA geben.
  3. RNase R der RNA hinzufügen (1 l = 20U).
  4. Fügen Sie der RNA 1 l Glykolblau hinzu und bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf bis zu 100 l.
  5. Proben bei 37 °C für 30 min inkubieren.
  6. 1 min Phenol/Chloroform und Wirbel hinzufügen.
  7. Zentrifuge bei 21.000 x g für 1 min zu trennenden Phasen.
  8. Nehmen Sie den Überstand (wässrige Phase) und fügen Sie 1 Volumen (ca. 80 l Chloroform) hinzu.
  9. Wirbel für 1 min, und dann Zentrifuge für 1 min zu trennen Phasen.
  10. Überstand nehmen, 1:10 vol KAc und 2,5 Vol Ethanol hinzufügen und bei -20 °C für 1-4 h niederschlagen. Zentrifuge bei 4 °C für 30 min bei voller Geschwindigkeit (21.000 x g). Es wird ein kleines blaues Pellet an der Unterseite sein.
  11. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 80% Ethanol. Lassen Sie die Luft für 5 min bei Raumtemperatur trocknen und lösen Sie sie in 10 l Wasser auf.

11. RT-PCR-Analyse

  1. Verwenden Sie pro RT-Reaktion 1 g RNA.
  2. Machen Sie eine Reaktionsmischung für ein Endvolumen von 20 l pro Reaktion. Für eine Reaktion verwenden Sie 1 l mit 10 mM dNTPs, 1 l 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 4 l 5x First-Strand Buffer und 0,5 l Reverse Transcriptase.
  3. Aliquot 6,5 L Reaktionsmischung in neue PCR-Röhren.
  4. Mischen Sie bis zu 5 Primer in einem Mix. Einige Primer können jedoch mit anderen Primern in der PCR(Abbildung 5) nicht miteinander verzahnt werden. Primersequenzen befinden sich in Tabelle 2. Wir verwenden routinemäßig genspezifische Exon-Junction-Primer, aber auch das Priming mit zufälligen Hexamern ist möglich.
  5. Fügen Sie dem gewünschten RT-Reaktionsrohr 1 l von 10 M Reverse Primer hinzu.
  6. Fügen Sie dem PCR-Reaktionsröhrchen 1 g RNA hinzu.
  7. Fügen Sie RNase-freieH2O bis zu einem Gesamtvolumen von 20 l hinzu.
  8. Spin Rohre nach unten, um Rückstände auf der Seite der Rohre zu entfernen und in Thermocycler zu platzieren.
  9. Führen Sie die RT-Reaktion im Thermocycler bei 50 °C 50 Minuten lang aus.
  10. Bewahren Sie RT cDNA bei -20 °C auf oder fahren Sie mit der PCR-Reaktion fort.

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Ergebnisse

Reportergene ermöglichen die Bestimmung regulatorischer Faktoren, die die zirkuläre RNA-Bildung beeinflussen. Diese Reportergene sind jedoch groß und enthalten sich wiederholende Elemente, die DNA-Konstrukte oft instabil machen. Aufgrund ihrer großen Größe ist es oft notwendig, Teile der Introns zu löschen, was durch die Verstärkung genomischer Teile mit den Exons und kleineren flankierenden intronischen Teilen erreicht wird. Diese DNA-Stücke werden enzymatisch zusammengesetzt, so dass Enzyme ohne Einschränkung aufgebaut...

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Diskussion

Im Allgemeinen sind kreisförmige RNAs niedrig reichlich1, was die Untersuchung ihrer Funktion und Bildung erschwert. Ähnlich wie bei linearen RNAs13ermöglicht die Verwendung von Reporter-Minigenes die Identifizierung von cis und trans-wirkenden Faktoren, die die Bildung von kreisförmigen RNAs regulieren. So erzeugt dieser Ansatz Hypothesen, die mit den endogene Genen weiter getestet werden können.

Der wichtigste Schritt ist das Design des Reporte...

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Offenlegungen

Nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom DoD-Zuschuss des Verteidigungsministeriums AZ180075 unterstützt. Stefan Stamm dankt Jacqueline Noonan Endowment. Unterstützt wurde Anna Pawluchin vom DAAD, dem deutschen akademischen Austauschprogramm, Justin R. Welden erhielt den Max Steckler Award der University of Kentucky.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(PEI) HydrochloridPolysciences24765-1
BauwerkzeugNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.Clare Chemical Research
Assemblierungskit für enzymatische DNANEBE2621S
Gel- und PCR-AufreinigungskitPromegaA9282
Glyco BlueThermoFisher AM9516
pcDNA3.1 KlonierungsstellePolyklonierungsstellehttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polymerase 1NEBM0491LQ5 DNA-Polymerase
Polymerase 2Biorad1725310Long Range Polymerase (NEB), iproof (BioRad)
Polymerase 2Qiagen206402Qiagen Long Range Polymerase
Kit Reverse TranskriptaseThermo Fisher18080044 RNA-Isolationskit
Life Technologies12183025Ambion von Life Technologies
RNAse RLucigenRNR07250Epicenter/Lucigen
Stabile kompetente ZellenNEBC3040HNEB stabile Zellen
Standard Klonierung von BakterienNEBC2988JNEB5-alpha kompetentes Web-Tool
zum Entwerfen von PrimernNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/Webbasierte
TemperaturberechnungenNEBhttps://tmcalculator.neb.com/#!/main

Referenzen

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