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Methodenartikel

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

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DOI:

10.3791/59768

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13. Juni 2019

 , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll für die Beschriftung von Blutgefäßen in einem teleost Fisch durch Herzvermischung von DiI verdünnt in Fixierung, mit medaka(Oryziaslatipes) als Modell und die Konzentration auf Gehirn und Hypophyse Gewebe.

Zusammenfassung

Blutgefäße innervate alle Gewebe in Wirbeltieren, so dass ihr Überleben durch die Bereitstellung der notwendigen Nährstoffe, Sauerstoff und hormonellen Signale. Es ist eines der ersten Organe, das während der Entwicklung zu funktionieren beginnt. Mechanismen der Blutgefäßbildung sind zu einem Gegenstand von hohem wissenschaftlichem und klinischem Interesse geworden. Bei Erwachsenen ist es jedoch schwierig, die Vaskulatur bei den meisten lebenden Tieren zu visualisieren, da sie tief in anderen Geweben lokalisiert sind. Dennoch bleibt die Visualisierung von Blutgefäßen für mehrere Studien wie Endokrinologie und Neurobiologie wichtig. Während mehrere transgene Linien in Zebrafischen entwickelt wurden, wobei Blutgefäße direkt durch die Expression fluoreszierender Proteine visualisiert wurden, gibt es für andere Teleost-Arten keine solchen Werkzeuge. Mit medaka (Oryziaslatipes) als Modell präsentiert das aktuelle Protokoll eine schnelle und direkte Technik, um Blutgefäße im Gehirn und Hypophyse zu kennzeichnen, indem es durch das Herz mit Fixativ-haltigen DiI pariert. Dieses Protokoll ermöglicht eine Verbesserung unseres Verständnisses darüber, wie Gehirn-und Hypophysenzellen mit der Blutvaskulatur in ganzerem Gewebe oder dicken Gewebescheiben interagieren.

Einleitung

Blutgefäße spielen einen wesentlichen Teil des Wirbelkörpers, da sie allen Organen die notwendigen Nährstoffe, Sauerstoff und Hormonsignale liefern. Seit der Entdeckung ihrer Beteiligung an der Krebsentwicklung1 habensie auch in der klinischen Forschung viel Aufmerksamkeit erhalten. Obwohl eine Reihe von Publikationen die Mechanismen untersucht haben, die das Wachstum von Blutgefäßen und die Morphogenese ermöglichen, und eine große Anzahl von Genen identifiziert wurden, die für ihre Entstehung wichtig sind, bleibt eine Menge hinsichtlich der Interaktion zu verstehen. Zwischen Zellen oder Gewebe und dem zirkulierenden Blut.

Die Visualisierung der Blutvaskulatur im Gehirn und der Hypophyse ist wichtig. Neuronen im Gehirn benötigen eine hohe Versorgung mit Sauerstoff und Glukose 3, und die Hypophyseenthältbis zu acht wichtige hormonproduzierende Zelltypen, die den Blutfluss nutzen, um Signal aus dem Gehirn zu empfangen und ihre jeweiligen Hormone an verschiedene Peripheriegorgeln4,5. Während bei Säugetieren das Portalsystem an der Basis des Hypothalamus, der Median eminence genannt wird, das Gehirn mit der Hypophyse6verbindet, ist eine so klare Blutbrücke bei Teletischen Fischen nicht beschrieben worden. In der Tat projizieren präoptiko-hypothalamische Neuronen in Teleoern ihre Axone direkt in die Pars nervosa der Hypophyse 7 und innervate die verschiedenen endokrinen Zelltypen direkt8,9. Einige dieser Neuronen haben jedoch ihre Nervenenden im extravaskulärenRaum, in unmittelbarer Nähe zu Blutkapillaren 10. Daher ist der Unterschied zwischen Teleostfischen und Säugetieren nicht so klar, und die Beziehung zwischen der Blutvaskulatur und dem Gehirn und Hypophysen erfordert eine stärkere Untersuchung bei Teleost-Fischen.

Zebrafische haben in vielerlei Hinsicht ein anatomisch und funktionell vergleichbares Gefäßsystem mit anderen Wirbeltierarten 11. Es ist ein leistungsfähiges Wirbelsäulenmodell für die kardiovaskuläre Forschung geworden, vor allem dank der Entwicklung mehrerer transgener Linien, bei denen Komponenten des Gefäßsystems mit fluoreszierenden Reporterproteinen 12 gekennzeichnet sind. Die genaue Anatomie des Kreislaufsystems kann jedoch zwischen den Arten oder sogar zwischen zwei Individuen der gleichen Art variieren. Daher kann die Visualisierung von Blutgefäßen auch bei anderen Teleost-Arten von großem Interesse sein, für die es keine Transgenese-Werkzeuge gibt.

Es wurden verschiedene Techniken beschrieben, um Blutgefäße sowohl bei Säugetieren als auch bei Teleosten zu kennzeichnen. Dazu gehören die In-situ-Hybridisierung für vaskulurspezifische Gene, die alkalische Phosphatase-Färbung, die Mikroangiographie und die Farbstoffinjektionen(für eine Rezension siehe 13). Fluoreszierender lipophiler kationischer Indocarbocyanin-Farbstoff (DiI)wurde zum ersten Mal verwendet, um Membran-Lipide seitliche Beweglichkeit zu untersuchen, da es in den Lipidbilayern gespeichert wird und durch sie 14,15,16wandernkann. Tatsächlich besteht ein Molekül von DiI aus zwei Kohlenwasserstoffketten und Chromophoren. Während sich die Kohlenwasserstoffketten in die Lipidbilayer-Zellmembran der Zellen integrieren, die mit ihr in Kontakt stehen, bleiben die Chromophores auf ihrer Oberfläche17. Einmal in der Membran, diffundieren DiI-Moleküle seitlich innerhalb des Lipidbilayers, was hilft, Membranstrukturen zu verfärben, die nicht in direktem Kontakt mit der DiI-Lösung stehen. Die Injektion einer DiI-Lösung durch Herzdurchblutung wird daher alle Endothelzellen in Kontakt mit der Verbindung kennzeichnen, die eine direkte Kennzeichnung der Blutgefäße ermöglicht. Heute wird DiI auch für andere Färbezwecke verwendet, wie zum Beispiel die Bildgebung von Einzelmolekülen, die Schicksalskartierung und die neuronale Verfolgung. Interessanterweise gibt es mehrere Fluorophores (mit unterschiedlichen Wellenlängen der Emission), die die Kombination mit anderen Fluoreszenzetiketten ermöglichen, und die Einverleibung sowie die seitliche Diffusion von DiI kann sowohl in lebendenals auch festen Geweben 18auftreten, 19. November

Formaldehyd,dasFerdinand Blum 1893 entdeckte, wird bis heute als bevorzugte Chemikalie für die Gewebefixierung20,21weitverbreitet. Es zeigt eine breite Spezifität für die meisten zellulären Zieleundbewahrt die Zellstruktur 22,23. Es bewahrt auch die fluoreszierenden Eigenschaften der meisten Fluorophoren und kann so zur Fixierung transgener Tiere verwendet werden, für die gezielte Zellen fluoreszierende Reporterproteine ausdrücken.

In diesem Manuskript wurde ein früheres Protokoll entwickelt, um Blutgefäße in kleinen experimentellen Säugetiermodellen24 zu kennzeichnen, um die Verwendung in Fischen zu verwenden. Die gesamte Prozedur dauert nur ein paar Stunden. Es zeigt, wie man eine fixierte Lösung von Formaldehyd, das DiI im Fischherz enthält, perfektioniert, um alle Blutgefäße im Gehirn und die Hypophyse des Modells Fisch medaka direkt zu kennzeichnen. Medaka ist ein kleiner Süßwasserfisch, der in Asien beheimatet ist, vor allem in Japan. Es handelt sich um einen Forschungsmodellorganismus mit einer Reihe von molekularen und genetischen Werkzeugen, diezurVerfügung stehen 25. Daher wird die Identifizierung von Blutgefäßen in dieser Art und in anderen ermöglichen, unser Verständnis darüber zu verbessern, wie das Gehirn und Hypophysen mit Blutvaskulatur in ganzen Gewebe oder dicken Gewebeseischen interagieren.

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Protokoll

Der gesamte Umgang mit Tieren wurde nach den Empfehlungen für die Pflege und das Wohlergehen von Forschungstieren an der Norwegischen Universität für Lebenswissenschaften und unter der Aufsicht von autorisierten Forschern durchgeführt.

1. Vorbereitung von Instrumenten und Lösungen

  1. Bereiten Sie die DiI-Lagerösung vor, die 5 mg DiI-Kristall in 1,5 ml Kunststoffrohr mit 1 ml von 96% EtOH auflöst. Wirbel für 30 s und mit Aluminiumfolie bedeckt halten.
    NOTE: Die DiI-Lagerösung kann im Dunkeln bei-20 ° C für mehrere Monate konserviert werden.
  2. Bereiten Sie den Fischhalter(Abbildung 1A) vor, indem Sie ein Stück Polystyrol auf 5 cm Länge, 3 cm Breite und 2 cm Dicke schneiden und auf eine Plastikschale mit einem Durchmesser von 9 cm kleben. Ein 3 cm großes, bootförmiges Loch mit einer Skalpellklinge im Polystyrol herstellen.
  3. Bereiten Sie das Parfümerie-System (Abbildung 2) vor, indem Sie eine 30-50 cm lange Kunststoffkanüle an der Extremität der Nadel hinzufügen.
  4. Bereiten Sie 40 ml frische 4% Paraformaldehyd-Lösung (PFA) vor, indem Sie 10 ml von 16% PFA mit 30 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) in einem 50 mL Kunststoffrohr verdünnen.
  5. Bereiten Sie 10 ml fixative/DiI-Lösung vor, indem Sie 1 ml DiI-Lagerösung in 9 ml frisch zubereiteter 4% PFA in einem 10 mL Kunststoffrohr verdünnen. Im Dunkeln bleiben, bis sie benutzt werden.
    NOTE: Die nicht gelösten DiI-Kristalle können im Lagerröhröhrchen aufbewahrt werden, und zur Vorbereitung neuer DiI-Bestandslösung kann neues Ethanol hinzugefügt werden (siehe Schritt 1.1).
  6. Bereiten Sie 50 ml Tricaine (MS-222) Lager.
    1. 200 mg Tricaine-Pulver in 48 mL von H 2 Oauflösen. 2 mL 1 M Tris-Basis (pH 9) hinzufügen. PH 7 mit 1 M HCl anbringen und bei-20 ° C lagern.
  7. Dilüme 5 ml Tricaine Lager in 50 ml sauberem Wasser in einem kleinen Glas.
  8. Bereiten Sie mehrere 5 cm Glaspipetten (Abbildung 2) vor, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Pipette-Puller nach den Anweisungen des Herstellers strecken.

2. Dissektion und Perfusion

NOTE: PFA ist eine toxische flüchtige Verbindung, daher sollte die Trennung und Perfusion in einer Kapuze oder in einem belüfteten Raum durchgeführt werden, und der Benutzer muss eine Gasmaske tragen.

  1. Bereiten Sie die Sektionswerkzeuge einschließlich kleiner Schere und eine scharfe und eine starke Zange vor der Trennung.
  2. Füllen Sie die Spritze mit der vorbereiteten Lösung von PFA/DiI, indem Sie sie in das 50 mL Rohr legen und die Erstellung. Dann die Nadel mit der Kanüle an der Extremität der Spritze platzieren (Abbildung 2).
  3. Fixieren Sie die Spritze mit mehreren Bandstücken, die in verschiedene Richtungen gelegt werden, stellen Sie die Position des Mikroskops und des Sitzes ein, um eine gute Position für die Trennung und das Drücken der Spritzenkolben zu erhalten (Abbildung1B).
    NOTE: In diesem Protokoll wird der Ellenbogen verwendet, um den Spritzenkolben herunterzudrücken, aber es können auch andere Möglichkeiten genutzt werden, z.B. die Hilfe einer anderen Person.
  4. Sterbeweise die Fische mit einer Überdosis Trikaine, indem die Fische in die Lösung, die in Schritt 1.7 vorbereitet wird, gesetzt werden. Warten Sie 30 s und testen Sie die Reflexe der Fische, indem Sie ihre kaudale Flosse mit den Zangen greifen. Der Fisch kann verwendet werden, wenn er aufgehört hat, auf die Reize zu reagieren.
  5. Legen Sie den Fisch in den Fischhalter mit dem Bauch nach oben und stecken Sie eine Nadel in die Extremität des Kopfes und eine andere über dem Schwanz, um die Fische an Ort und Stelle zu halten.
  6. Öffnen Sie den vorderen Bauch mit der Schere, indem Sie die oberflächliche Schicht der Haut horizontal schneiden.
  7. Mit Hilfe von Zangen die Haut über dem Herzen entfernen, bis ein klarer Zugang zur Herzkammer und zum Bulbus arteriosus vorgesehen ist (Abbildung3).
  8. Fügen Sie eine Glaspipette an der Extremität der Kapillare hinzu und brechen Sie das Ende der Spitze der Glaspipette.
    NOTE: Das Loch der gebrochenen Spitze sollte groß genug sein, um die Flüssigkeit rauslassen zu lassen, aber immer noch klein genug, um leicht in das Gewebe einzudringen. Die Glaspipette kann wiederverwendet werden, wenn sie nicht kaputt oder verstopft ist.
  9. Bringen Sie die Glaspipette nahe an die Herzkammer und drücken Sie den Spritzenkolben mit dem Ellenbogen, um die Flüssigkeit herauszudrängen.
  10. Die Herzkammer mit der Glaspipette verpumpen und gleichzeitig Druck in die Spritze geben.
  11. Direkt danach, perforieren Sie den Sinus venosus mit Zangen, damit Blut den Kreislauf verlassen.
    NOTE: Die Herzkammer wird durch das Fixierungsmittel brüchiger. Es wird auch weniger rot, da das Blut mit der fixative/DiI-Lösung verdünnt wird.
  12. Von der Herzkammer, stellen Sie den Winkel der Glaspipette, um den Eingang des Bulbus arteriosus zu finden. Bringen Sie die Pipette, die sich in den Bulbus-Arteriosus öffnet, wie in Abbildung2 gezeigt, und fügen Sie mehr Druck in die Spritze.
    NOTE: Der Bulbus arteriosus ist transparent und das Gewebe ist elastisch. Wenn man das Blut durch DiI/Fixativ ersetzt, sollte die Glaspipette im Inneren des Herzens sichtbarer werden und durch den Zusatz von Druck sollte sich die Größe des Bulbus arteriosus ausdehnen. Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass genügend Druck verwendet wurde, um das gesamte Blut durch die fixative/DiI-Lösung zu ersetzen, und dass alle Blutgefäße erreicht wurden. Oft provoziert die PFA bei einem Erfolg Muskelkontraktionen und die Fische werden sich bewegen.
  13. Setzen Sie den Druck auf die Spritze für 30-60 s noch immer die Glaspipette in der Bulbus arteriosus.
  14. Die Glaspipette und die Nadeln vom Fisch entfernen.
  15. Sekten Sie das Gehirn und die Hypophyse, und inkubieren Gewebe in frischen 4% PFA in PBS für 2 h in der Dunkelheit bei Raumtemperatur.
    NOTE: Der Zerfall von Gehirn und Hypophyse wurde zuvor von Fontaine et al. 26 und Ager-Wick u.a.27 auf zwei verschiedene Arten ausführlich beschrieben. Durch die Fixierung wird das Gewebe ziemlich hart und das fragile Bindeglied zwischen Gehirn und Hypophyse kann gebrochen werden. Nach der Teilung kann die Nachbefestigung auch über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden.
  16. Spülen Sie das Gewebe zweimal in PBS für 10 Minuten, bevor Sie sich auf die Bildgebung vorbereiten.
    NOTE: Das Gewebe kann dann zwischen Rutsche und Abdeckrutsch mit Zwischenabständen und Befestigungsmedium für konfokale Bildgebung (siehe Abbildung 4) montiert werden, oder mit einem Vibratom, wie es in Fontaine et al . 26 ausführlich beschrieben wird, abgetrennt werden. Rutsch-und Deckungsrutsche für die Bildgebung mit Stereomikroskop (siehe Abbildung4).

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Ergebnisse

Dieses Protokoll zeigt ein schrittweises Verfahren, um Blutgefäße im Medaka-Gehirn und Hypophyse zu kennzeichnen und gleichzeitig das Gewebe zu fixieren. Nach der Kennzeichnung einer fixierenden Lösung, die DiI in das Herz einspeist, durch die Herzinjektion können Blutgefäße mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop (Abbildung 4) oder auf gandem Gewebe mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet werden (Abbildung5). Entweder an der dicken Gewebescheize oder am ge...

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Diskussion

Die Herzvermischung mit DiI wurde zuvor zur Kennzeichnung von Blutgefäßen in mehreren Modellarten24verwendet, darunter auch Teleost-Fische 13.

Da DiI durch Perfusion in der Vaskulatur direkt in die Endothelzellmembran geliefert wird, ist es möglich, das Signal-Rauschen-Verhältnis zu erhöhen, indem die DiI-Konzentration in der Fixlösung erhöht wird. Darüber hinaus sorgt das Fluorophor für eine intensive Färbung, wenn es mit minimalen Bl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Danksagungen

Wir danken Dr. Shinji Kanda für die Demonstration der Herzversionen mit fixierender Lösung in Medaka, Frau Lourdes Carreon G Tan für die Hilfe bei der Medaka-Haltung und Herrn Anthony Peltier für Illustrationen. Diese Arbeit wurde von der NMBU und vom Forschungsrat Norwegens, Grant Nummer 248828 (Digital Life Norway Programm), finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16% ParaformaldehydElektronenmikroskopie SciencesRT 15711
5 mL Spritze PP/PE ohneNadel SigmaZ116866-100EASpritzen
BD Precisionglide SpritzenkanülenSigmaZ118044-100EANadeln 18G (1,20*40)
Borosilikatglas 10 cm OD 1,2 mmSutter InstrumentBF120-94-10Glaspipette
DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat)InvitrogenD-282
LDPE-Röhrchen Außendurchmesser 1,7 mm und Innendurchmesser 1,1 mmPortex800/110/340/100Kanüle
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)SigmaD8537-6X500ML
PipettenabzieherNarishigePC-10
Petrischalen aus KunststoffVWR391-0442
Sekundenkleber GelLoctitec4356
Tricain (ms-222)sigmaE10521-50G

Referenzen

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