Hier wurde in Anwesenheit eines Antikoagulanten Mausblut gesammelt. Die Blutplättchen wurden mit einer niedrigen Drehzahlenzentrifugation durch Iohexol-Gradientenmedium gereinigt. Die Blutplättchen wurden mit Thrombin aktiviert, um zu untersuchen, ob sie lebensfähig sind. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde durch Strömungszytometrie und Mikroskopie analysiert.
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Methodenartikel
Reinigung von Plateletten aus dem Mausblut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Plateletten werden von Vollblut gereinigt, um ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, die frei sein sollten von roten Blutkörperchen (RBC), weißen Blutkörperchen (WBC) und Plasma-Proteinen. Wir beschreiben hier die Reinigung von Blutplättchen aus dem Mausblut mit dem Dreifach mehr Iohexol-Gradientenmittel im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Erträge der gereinigten Blutungen lagen bei 18,2-38,5%, und die gereinigten Blutplättchen befanden sich in einem ruhenden Zustand, der keine nennenswerte Anzahl von RBC und WBC enthielt. Die gereinigten Blutplättchen, die mit Thrombin behandelt wurden, zeigten bis zu 93% Aktivierung, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Wir haben bestätigt, dass die gereinigten Blutplättchen mit Hilfe von Strömungszytometrie und mikroskopischer Auswertung ausreichend rein sind. Diese Blutplättchen können für die Genexpression, Aktivierung, Granulatfreigabe, Aggregation und Haftungsanalysen verwendet werden. Diese Methode kann zur Reinigung von Blutplättchen aus dem Blut anderer Arten auch verwendet werden.
Einleitung
Blutplättchen sind ein Bestandteil des Blutes, der als Initiator der Blutgerinnung als Reaktion auf Schäden im Blutgefäß fungiert. Sie versammeln sich an der Stelle der Verletzung, um die Gefäßwand1zu stopfen. Plattenets sind Zusammenhänge von Zytoplasma, die aus den Megakaryozyten des Knochenmarks unter dem Einfluss von Thrombopoietin abgeleitet werden und in den Kreislauf2gelangen. Sie gelten als metabolisch aktiv und können die extrazelluläre Umgebung durch die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden erkennen, die zu der Ausbreitung, Aggregation und Hämodizatische Steckerbildung 1, 3füh....
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Protokoll
Die Blutentnahme von Maus sollte mit entsprechender institutioneller Tierpflege und Zustimmung des Ausschusses durchgeführt werden.
NOTE: Das Platelet-Reinigungsprotokoll wird in einem Strömungsdiagramm in Abbildung1 beschrieben.
1. Sammlung von Blut
- 25 μL von 3,2% Natriumcitrat (pH 7,2) als Anti-Gerinnungsmittel und 0,4 mM Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in ein Polypropylen-Rohr geben.
-
Sammeln Sie etwa 200 μL Blut aus der C57BL/6-Maus mit Retro-Orbital-Blutungen.
Hinweis: Blut kann von jeder Art von Maus-Stamm gesammelt werden, unabhä....
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Ergebnisse
Die Zusammenfassung der Plattenreinigung wird in einem Strömungsdiagramm beschrieben (Abbildung 1). Zu den Schritten gehören die Blutentnahme von der Maus mit Retro-Orbitalblutungen in Anwesenheit eines Gerinnungshaus, die Zugabe von Blutprobe auf das Iohexol-Gradientenmedium, Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde nach der Färbung mit Antikörper mit Mikroskopie und Strömungszytometrie bewe.......
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Diskussion
Häufig werden Blutplättchen durch eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit isoliert, die plateletreichem Plasma liefert, das eine beträchtliche Anzahl von Blutkörperchen, Zellabfall und Plasmaproteinen enthält, die die biochemischen und physiologischen Assays und Bedürfnisse stören können. Weitere Reinigung21. Daher ist es wichtig, eine schnelle und einfache Methode zu verwenden, die reine Blutplättchen ohne größere Verunreinigungen erzeugen kann. Das hier vorgestellte Protokoll beschreib.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch eine Start-up-Finanzierung der Cincinnati Children es Research Foundation und ein Stipendium der Universität von Cincinnati Pilot Translational Granate an M.N. Wir danken dem Cincinnati Children es Hospital Research Flow Cytometry Core für seine Dienste.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| APC Ratte Anti-Maus/Mensch CD62P (P-Selektin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Thrombozyten-Aktivierungsmarker |
| Eppendorf-Röhrchen | Fisher Scientific | 14-222-166 | Röhrchen für Zentifugen |
| FACS DIVA Software | BD Biosciences | Nicht-Katalogartikel | Analyse von Blutplättchen und Vollblut |
| FACS-Röhrchen | Fisher Scientific | 352008 | Röhrchen für den Fluss Zytomterie |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Inhaltsstoff für Färbepuffer |
| FITC Ratte Anti-Maus CD41 | BD Biosciences | 553848 | Thrombozytenmarker |
| Durchflusszytometer | BD Biosciences | Nicht-Katalogartikel | Analyse von Blutplättchen und Vollblut |
| FlowJo Software | FlowJo, Inc. | Analyse | von Blutplättchen und Vollblut |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Verhindern Sie die Bildung von Blutplättchengerinnseln |
| Hämatokrit Kapillarröhrchen | Fisher Scientific | 22-362566 | Blutentnahme Kapillarröhrchen |
| Hemavet | Drew Scientific | Nicht-Katalogartikel | Blutzellanalysator |
| Hämozytometer | Hausser Scientific | 3100 | Zellzählkammer |
| Isofluran | Baxter | 1001936040 | Zur Betäubung von Mäusen |
| Mikroskop (Olympus CKX41) | Olympus | Nicht-Katalogartikel | Zellüberwachung und -zählung |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient Medium |
| PE Ratte Anti-Maus CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC Marker |
| PE-Cy7 Anti-Maus für Ratten TER 119 | BD Biosciences | 557853 | Erythrozytenmarker |
| Pipettenspitzen 200 & Mikro; L, mit breiter Bohrung | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Übertragen von Blut- und Thrombozytenproben |
| Pipettenspitzen 1000 & Mikro; L, mit breiter Bohrung | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transfer von Blut- und Thrombozytenproben |
| Phosphat-Kochsalzlösung (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Puffer zum Waschen und Verdünnen |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiologische Kochsalzlösung |
| Natriumcitrat | Fisher Scientific | 02-688-26 | Antikoagulans |
| Färbepuffer | In-house | Nicht-Katalogartikel | - und Verdünnungspuffer |
| Steile Wasser | Solvent | ||
| Tischzentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Schwingrotorzentrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Thrombozytenaktivierung Agonist |
| Tricin | Sigma-Aldrich | T0377 | Puffer für Nycodenz Medium |
Referenzen
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
