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Methodenartikel

Reinigung eines hochmolekularen Proteins in Streptococcus mutans

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DOI:

10.3791/59804

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14. September 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Beschrieben hier ist eine einfache Methode zur Reinigung eines Genprodukts in Streptococcus mutans. Diese Technik kann bei der Reinigung von Proteinen, insbesondere Membranproteinen und Proteinen mit hoher Molekularmasse, von Vorteil sein und kann mit verschiedenen anderen Bakterienarten verwendet werden.

Zusammenfassung

Die Aufklärung der Funktion eines Gens beinhaltet in der Regel den Vergleich von phänotypischen Merkmalen von Wildstämmen und Stämmen, bei denen das Gen von Interesse gestört wurde. Funktionsverlust nach Einer-Störung wird anschließend durch exogene Zugabe des Produkts des gestörten Gens wiederhergestellt. Dies hilft, die Funktion des Gens zu bestimmen. Eine zuvor beschriebene Methode beinhaltet die Erzeugung eines gtfC-Gen-gestörten Streptococcus-Mutans-Stamms. Hier wird eine anspruchslose Methode zur Reinigung des gtfC-Genprodukts aus dem neu erzeugten S. mutans Stamm nach der Genstörung beschrieben. Es beinhaltet die Zugabe einer Polyhistidin-kodierenden Sequenz am 3-Zoll-Ende des Gens von Interesse, die eine einfache Reinigung des Genprodukts mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie ermöglicht. Für die genetische Veränderung dieser Methode sind keine anderen enzymatischen Reaktionen als PCR erforderlich. Die Wiederherstellung des Genprodukts durch exogene Addition nach Genstörungen ist eine effiziente Methode zur Bestimmung der Genfunktion, die auch an verschiedene Arten angepasst werden kann.

Einleitung

Die Analyse der Funktion eines Gens beinhaltet in der Regel den Vergleich von phänotypischen Merkmalen wildartigen Stämmen mit Stämmen, in denen das Gen von Interesse gestört wurde. Sobald der gengestörte Stamm produziert ist, ermöglicht die exogene Zugabe des Genprodukts eine funktionelle Wiederherstellung.

Die häufigste Methode zur Gewinnung gereinigter Genprodukte, die für nachfolgende Restaurationstests erforderlich sind, ist die Durchführung einer heterologen Expression bei Escherichia coli1. Allerdings ist die Expression von Membranproteinen oder proteinen mit hoher molekularer Masse mit diesem System oft schwierig1. In diesen Fällen wird das Zielprotein in der Regel aus den Zellen isoliert, die das Protein nativ durch eine komplexe Reihe von Schritten synthetisieren, was zum Verlust des Genprodukts führen kann. Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein einfaches Verfahren für die Genproduktreinigung nach einer Genstörungsmethode2, PCR-basierte DNA-Spleißmethode3 (als zweistufige Fusion PCR bezeichnet) und Elektroporation für genetische Transformation in Streptococcus mutans. Die Zugabe eines Polyhistidin-Tags (His-tag) zum C-Terminus des Genprodukts erleichtert seine Reinigung durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC).

Um den His-tag-exezierenden Stamm zu isolieren, wird die gesamte genomische DNA des Gens von Interesse (in diesem His-Tag-exezierenden Gen-disrupted Stamm) durch ein antibiotikaresistentes Markergen ersetzt. Das Verfahren zur Erzeugung des His-tag-exzierenden Stammes ist fast identisch mit dem Verfahren zur Erzeugung eines gengestörten Stammes, wie zuvorbeschrieben 4,5. Daher sollten die Methoden zur Genstörung und Genproduktisolation als serielle Experimente für die funktionelle Analyse durchgeführt werden.

In der vorliegenden Arbeit wird eine Polyhistidin-Kodierungssequenz am 3-Zoll-Ende des gtfC-Gens (GenBank locus tag SMU_1005) angebracht, die Glucosyltransferase-SI (GTF-SI) in S. mutans6kodiert. Dann wurden Expressionsstudien an einer Streptokokkenart durchgeführt. Die Erzielung einer heterologen gtfC-Expression durch E. coli ist schwierig, wahrscheinlich aufgrund der hohen molekularen Masse von GTF-SI. Diese Sorte heißt S. mutans His-gtfC. Eine schematische Abbildung, die die Organisation der gtfC- und Spectinomycin-Resistenz-Genkassette (spcr)7 loci in Wildtyp S. mutans (S. mutans WT) und deren Derivaten darstellt, ist in Abbildung 1. Der GTF-SI ist ein sekretores Protein, das zur Entwicklung des karogenen Dentalbiofilms6beiträgt. Unter der Anwesenheit von Saccharose wird ein anhaftender Biofilm auf einer glatten Glasoberfläche in WT S. Mutans Stamm, aber nicht in der S. mutans gtfC-disrupted Stamm (S. mutans 'gtfC)2,5 . Die Biofilmbildung wird in S. mutans -gtfC nach exogener Zugabe des rekombinanten GTF-SI wiederhergestellt. Die Sorte, S. mutans His-gtfC, wird dann verwendet, um den rekombinanten GTF-SI zuproduzieren.

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Protokoll

HINWEIS: Die Generierung von S. mutans -gtfC, bei der der gesamte Kodierungsbereich des gtfC-Gens durch spcr ersetzt wird, muss vor der Ausführung dieser Protokolle abgeschlossen werden. Weitere Informationen zu Generation5finden Sie im veröffentlichten Artikel .

1. Primer-Design

  1. Bereiten Sie Primer für den Bau von S. mutans His-gtfC.
    HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 1dargestellt. Die zweistufige Fusion PCR-Methode zur Erzeugung von S. mutans His-gtfC ist schematisch in Abbildung 2dargestellt.
    1. Designprimer (gtfC-reverse und spcr-forward) für die Befestigung der His-tag-codierungssequenz, die zwischen dem gtfC-Gen und spcr (Abbildung 2A) interveniert.
      1. Fügen Sie GS-Linker und His-Tag-Codierungsequenz in gtfC-reverse und spcr-forward Primer ein, in denen 24 Basen in den 5' Regionen einander ergänzen.
        HINWEIS: Die Aminosäuresequenz des GS-Linkers und his-tags (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His-) ist durch Genübersetzung an den C-Terminus von GTF-SI angehängt.
      2. Entwerfen Sie einen gtfC-forward Primer, um das gtfC-Gen im S. mutans WT Genom >1 kb flussabwärts des Gens und des spcr-reverse Primers zu zielen, um den nachgeschalteten flankierenden Bereich von spcr in den S. mutans .gtfC. Stellen Sie die Schmelztemperatur8 (Tm) der gtfC-forward und spcr-reverse Primer auf die Schmelztemperaturen der gtfC-reverse und spcr- Vorwärtsprimer.
    2. Entwerfen Verschachtelter Primer (geschachtelt vorwärts und verschachtelt-rückwärts) für die zweite PCR (Abbildung 2B).
    3. Designprimer (gtfC-forward und colony-reverse) spezifisch für die genomische DNA des Transformants(Abbildung 2C; die Primer werden für Kolonie PCR verwendet).
      HINWEIS: Die Amplicons bewegen sich über den Rahmen zwischen gtfC und spcr. Der gtfC-forward Primer kann als Vorwärtsprimer angewendet werden.
    4. Designprimer (up-forward and down-reverse) zur endgültigen Bestätigung der Generation von S. mutans His-gtfC (Abbildung 2C; das PCR-Produkt, das durch die Primer verstärkt wird, wird für die DNA-Sequenzierung verwendet).

2. Genomische DNA-Extraktion von S. mutans

HINWEIS: Jeder S. Mutansstamm sollte bei einer Hirninfusion (BHI) bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen kultiviert werden. Die mutierten Stämme der S. Mutaner -gtfC und S. mutans His-gtfC werden in BHI kultiviert, ergänzt durch 100 g/ml Spectinomycin.

  1. Streak S. mutans WT und S. mutans -gtfC separat auf jede der BHI-Agarplatten. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
  2. Wählen Sie einzelne Kolonien von S. mutans WT oder S. mutans -gtfC mit einem sterilisierten Zahnstocher und impfen Sie in 1,5 ml BHI-Brühe. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
    HINWEIS: Die Kolonien können als Quelle der Vorlagen-DNA für die erste PCR (Schritt 3.1) verwendet werden.
  3. Übertragen Sie 1 ml jeder Bakterienkultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Kultur für 1 min bei 15.000 x g.
  4. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml des Tris-EDTA-Puffers (pH 8.0) hinzu, um das Zellpellet wieder aufzuhängen.
  5. Zentrifugieren Sie die Suspension für 1 min bei 15.000 x g. Entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 50 l Tris-EDTA-Puffer (pH 8,0) wieder auf.
  6. Erhitzen Sie die Aufhängung mit einem Block-Inkubator für 5 min bei 95 °C. Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 15.000 x g.
  7. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr (der Überstand dient als Vorlagen-DNA für die erste PCR).

3. PCR-Verstärkung

HINWEIS: Tabelle 1, Tabelle 2und Tabelle 3 fassen die PCR-Primer, Reagenzien bzw. Amplifikationszyklen zusammen.

  1. Führen Sie die erste PCR mit dem S. mutans WT und S. mutans -genom als PCR-Vorlagen durch. Verstärken Sie die Regionen, die den nachgelagerten Teil des gtfC-Gens beherbergen, und die Regionen, die spcr beherbergen, mit den in Schritt 1.1.1.2 beschriebenen Primern (Abbildung 2A).
  2. Elektrophorese jedes PCR-Produkt auf 1% Agarose-Gel. Verbrauchen Sie die gewünschten DNA-Fragmente von ca. 1.000 bp und 2.000 bp. Reinigen Sie die Fragmente aus den Gelen mit der Kieselsäure-Membran-basierten Gelextraktionsmethode.
    HINWEIS: Die grundlegenden Verfahren für PCR9, DNA-Gel-Elektrophorese10und DNA-Reinigung11 sind an anderer Stelle detailliert.
  3. Führen Sie eine zweite PCR mit den Produkten der ersten PCR (ungefähr äquimolar) als PCR-Vorlagen mit den verschachtelten Vorwärts- und Verschachtelten-Reverse-Primern(Abbildung 2B) durch.
  4. Elektrophorese ein Zehntel der PCR-Mischung auf dem Agarose-Gel. Bestätigen Sie die Erzeugung des entsprechenden Amplicons von ca. 3.000 bp.
  5. Das verbleibende PCR-Produkt zu überstürzen.
    HINWEIS:     Eine Reinigung des PCR-Produkts ist nicht erforderlich, da unspezifische Amplicons, die von der zweiten PCR erzeugt werden, die homologe Rekombination nicht beeinträchtigen.
    1. Fügen Sie dem PCR-Gemisch nukleasefreies Wasser hinzu und bringen Sie das Gesamtvolumen auf 100 l, gefolgt von 0,1 Volumen (10 l) 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen (250 l) absolutem Ethanol. Mischen und lagern Sie die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
    2. Zentrifugieren Sie die Probe für 20 min bei 15.000 x g bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml 70% Ethanol hinzu, um das DNA-Pellet zu waschen.
    3. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 15.000 x g bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Lufttrocknen und lösen Sie das DNA-Pellet mit 10 l nukleasefreiem Wasser auf.

4. Zelltransformation

  1. Bereiten Sie die zuständige S. mutans WT vor, um das zweite PCR-Produkt einzuführen, indem Sie die in der vorherigen Publikation5beschriebenen Schritte befolgen. Bewahren Sie die Zellen bei -80 °C auf.
    HINWEIS: Für dieses Experiment wurden die kompetenten S. mutans WT-Zellen bereits in -80 °C konserviert, um S. Mutans zuerzeugen.
  2. Mischen Sie 5 l des konzentrierten zweiten PCR-Produkts mit dem 50-L-Aliquot von eiskalten, kompetenten Zellen, die zuvor eingefroren wurden. Fügen Sie die Mischung in Elektroporationsküvetten. Geben Sie den Zellen mit Hilfe des Elektroporationsgeräts einen einzigen elektrischen Impuls (1,8 kV, 2,5 ms, 600 , 10 °F).
  3. Setzen Sie die Zellen in 500 l BHI-Brühe aus. Sofort 10–100 l der Suspension auf BHI-Agarplatten, die Spektinomycin enthalten, verteilen. Die Platten für 2–6 Tage bei 37 °C bebrüten, bis die Kolonien ausreichend gewachsen sind, um abgeholt zu werden.

5. Überprüfung der G-Enome-Rekombination und -Lagerung

  1. Führen Sie Kolonie-PCR mit gtfC-forward und Kolonie-Reverse-Primer für die Rekombination. Elektrophorese jedes Kolonie PCR-Produkt auf einem Agarose-Gel. Bestätigen Sie das DNA-Fragment von ca. 1.500 bp.
  2. Wählen Sie eine der positiven Kolonien mit einem sterilisierten Zahnstocher und Subkultur die Zellen über Nacht in 2 ml BHI-Brühe mit Spektinomycin.
  3. 0,8 ml Bakterienkultur mit 0,8 ml sterilem 50% Glycerin mischen und bei -80 °C oder -20 °C lagern.
  4. Übertragen Sie die restlichen 1 ml Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.7, um die genomische DNA aus den Zellen zu extrahieren.
  5. Führen Sie PCR mit den Up-Forward- und Down-Reverse-Primern und der genomischen DNA als Vorlage aus. Wiederholen Sie Schritt 3.2, um das verstärkte DNA-Produkt von den Gelen zu reinigen.
  6. Bestimmen Sie die DNA-Sequenz des gereinigten Amplicons durch DNA-Sequenzierung.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Erzeugung von S. mutans His-gtfC durch DNA-Sequenzierung bestätigt wird.

6. Reinigung von Polyhistidin-getaggt enden GTF-SI

  1. Streak S. mutans His-gtfC auf eine spectinomycinhaltige BHI Agarplatte. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
  2. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie mit einem sterilisierten Zahnstocher und Subkulturzellen in 3 ml BHI-Brühe auf. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  3. Bereiten Sie zwei konische Kolben mit 1 L BHI Brühe ohne Spectinomycin. 1 ml der Nachtkultursuspension in 1 L der BHI-Brühe impfen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  4. Konzentratproteine aus dem Kulturüberstand durch Ammoniumsulfatfällung.
    HINWEIS:     Extrahieren Sie aus Zellkörpern, wenn ein Zielprotein intrazellulär ist. Die grundlegenden Verfahren für Ammoniumsulfat-Fällung sind an anderer Stelle detailliert12.
    1. Zentrifugieren Sie die bakterielle Kultursuspension für 20 min bei 10.000 x g bei 4 °C. Erholen Sie den Kulturüberstand in einem 3 L Glasbecher.
    2. 1.122 g Ammoniumsulfat zu 2 L des Überstandes (80% Sättigung) mit kräftigem Rühren mit einem Magnetischen Rührer hinzufügen. Lassen Sie den Niederschlag bei 4 °C unter Rühren 4 h oder mehr bilden.
      HINWEIS: Die Niederschlagsbildung kann über Nacht fortgesetzt werden.
    3. Zentrifugieren Sie die ammoniumsulfat-ausgefällte Lösung bei 15.000 x g für 20 min bei 4 °C. Dekant den Überstand.
    4. Sammeln Sie den Niederschlag mit einem Spachtel und übertragen Sie in ein 200 ml Glasbecher. Die Pellets in 35 ml Bindungspuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol, pH 8,0) wieder aufsetzen.
    5. Dialyse die Suspension gegen 2.500 ml des Bindungspuffers mit einem regenerierten Cellulosedialyseschlauch bei 4 °C unter Rühren dialyzieren. Ersetzen Sie die Dialyselösung nach 2 h und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort.
    6. Ersetzen Sie die Dialyselösung erneut. Fahren Sie fort, um für weitere 2 h zu dialyze.
  5. Zentrifugieren Sie die Dialyseaufhängung bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C. Filtern Sie den Überstand durch einen Membranfilter mit Saugfiltrationsgeräten. Das Filtrat in einen 75 cm2 Kolben überführen.
  6. Fraktionieren Sie den mit Polyhistidin markierten GTF-SI aus der filtrierten Suspension durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC).
    1. 2 ml der Ni-geladenen IMAC-Harzschlämme (ca. 1 ml Harz) auf eine chromatographische Säule übertragen, deren Auslass an einem Silikonrohr angebracht ist. Entfernen Sie die Speicherlösung durch den Schwerkraftfluss.
      ACHTUNG: Lassen Sie das Harz nicht im gesamten IMAC austrocknen.
    2. Fügen Sie 3 ml destilliertes Wasser in die Säule, um das Harz zu waschen. Fügen Sie 5 ml des Bindungspuffers hinzu, um das Harz auszueinemt.
    3. Schließen Sie den Fluss mit einem Hoffmann-Pinch-Hahn ab. Fügen Sie 5 ml der gefilterten Suspension aus Schritt 6.5 hinzu, um die Gülle herzustellen.
    4. Fügen Sie die gesamte Gülle der verbleibenden gefilterten Aufhängung hinzu. Die Mischung 30 min bei 4 °C vorsichtig verwirbeln.
    5. Laden Sie die Mischung wieder auf die Spalte. Entfernen Sie die Suspension durch den Schwerkraftfluss. Waschen Sie das IMAC-Harz mit 20 ml Bindungspuffer.
      HINWEIS: Stellen Sie den Durchfluss während des nachfolgenden IMAC mit einem Hoffmann-Pinch-Hahn auf ca. 2 ml/min ein.
    6. Elute den rekombinanten GTF-SI mit 20 ml des Elutionspuffers (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol, pH 8.0).
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Das Eluat sollte bei 4 °C gelagert werden. IMAC-Harz kann wiederverwendet werden. Beachten Sie die Anweisungen für das IMAC-Harz.
  7. Ersetzen Sie den Elutionspuffer durch den Speicherpuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 6,5) und konzentrieren Sie die rekombinante GTF-SI-Lösung mit einer Zentrifugal-Ultrafiltrationseinheit auf ca. 1 ml. Bewahren Sie die rekombinante GTF-SI-Lösung bei 4 °C auf.
    HINWEIS: Bestätigen Sie die mit Polyhistidin gekennzeichnete GTF-SI-Reinigung mit SDS-PAGE13 und Western Blotting14, indem Sie einen mit Meerrettich peroxidase konjugierten monoklonalen Antipolyhistidin-Antikörper verwenden. Zugabe von CHAPS (Endkonzentration, 0,1%) je nach Zielprotein kann erforderlich sein, um eine unspezifische Adsorption an die Einheit zu vermeiden.

7. Funktionelle Wiederherstellung durch rekombinantes GTF-SI

  1. Streichen Sie jede S. mutans Belastung auf eine BHI AgarPlatte einzeln. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  2. Mit einem sterilisierten Zahnstocher, nehmen Sie eine einzelne Kolonie auf, um in 2 ml BHI-Brühe zu impfen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  3. Verwenden Sie 20 l der Nachtkultur von S. Mutans -gtfC, um 2 ml BHI-Brühe zu impfen, die 1% Saccharose ohne Antibiotika in einem Glas-Reagenzglas enthält. Fügen Sie den GTF-SI oder ein gleichwertiges Volumen des Fahrzeugs zur S. mutans-gtfC-Kultur hinzu und kulturieren Sie die Zellen mit der Röhre, die über Nacht in eine geneigte Position gebracht wird.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie die GTF-SI-Lösung mit einem sterilen Spritzenfilter und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure-Protein-Assay15 vor der Anwendung.
  4. Rühren Sie die Kulturaufhängungen mit einem Wirbelmischer für 10 s. Decant die Suspensionen. Waschen Sie die Reagenzgläser mit einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser.
  5. Die Biofilme an der Rohrwand mit 1 ml 0,25% Coomassie brillantblau (CBB) beflecken.
  6. Die Färbelösung nach 1 min dekantieren. Die Reagenzgläser mit ausreichend destilliertem Wasser waschen. Die Reagenzgläser lufttrocknen.

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Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt die Größe jedes Amplicons aus der ersten PCR (Abbildung 3A) und der zweiten PCR (Abbildung 3B). Die Größe jedes Amplicons entsprach der vorhergesagten Größe, wie in Tabelle 1beschrieben. Abbildung 4A zeigt S. Mutane-Kolonien, die mit dem zweiten PCR-Produkt transformiert und auf den BHI-Agarplatten mit Spektinomycin plattiert s...

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Diskussion

Das Design von Primern ist der kritischste Schritt im Protokoll. Die Sequenzen der gtfC-reverse und spcr-forward Primer wurden automatisch bestimmt, basierend auf den Sequenzen sowohl des 3-Zoll-Endbereichs von gtfC als auch des 5-Zoll-Endbereichs von spcr. Jeder Primer enthält 24 komplementäre Basen, die einen GS-Linker und eine His-Tag-Codierungssequenz in ihren 5' Regionen kodieren. Eine Störung der nativen regulatorischen Sequenzen in den vorgelagerten Flanken...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant-Nummern 16K15860 und 19K10471 bis T. M., 17K12032 bis M. I., und 18K09926 an N. H.) und der SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (Grant-Nummer 2018.09.10 Nr. 1) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseNippon GeneticsNE-AG02Für die Agarose-Gelelektrophorese
AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03Anaerobes Kultursystem
Monoklonaler Anti-His-Tag-AntikörperMBLD291-7HRP-konjugiertes
BCA-Protein-Assay-KitThermo Fisher Scientific23227Messung der Proteinkonzentration
Gehirn Herz InfusionsbrüheBecton, Dickinson237500Bakterienkulturmedium
CBB R-250Wako031-17922Für die Biofilmfärbung
Zentrifugale UltrafiltrationseinheitSartoriusVS2032Pufferersatz und Proteinkonzentration
ZentrifugeKubota7780II
Chromatographische SäuleBio-Rad7321010Für IMAC
DialysemembranklemmeFisher Marke21-153-100
DialyseschlauchAs One2-316-06
DNA-PolymeraseTakaraR045AHigh-Fidelity DNA-Polymerase
DNA-SequenzierungEurofins Genomics
ECL-SubstratBio-Rad170-5060Für Western Blotting
EDTA (0,5 M, pH 8,0)Wako311-90075Tris-EDTA Puffervorbereitung
ElektroporationsküvetteBio-Rad16520860,2 cm Spalt
ElektroporatorBio-Rad1652100
EtBr LösungNippon Gene315-90051Für die Agarose-Gelelektrophorese
GelbandschneiderNippon GeneticsFG-830
Gel ExtraktionskitNippon GeneticsFG-91202DNA-Extraktion aus Agarosegel
ImagerGE Healthcare 29083461Für SDS-PAGE und Western Blotting
ImidazolWako095-00015Vorbereitung von Bindungspuffer und Elutionspuffer
InkubatorNippon Medical & Chemical InstrumentsEZ-022Temperatureinstellung: 4 ° C
InkubatorNippon Medical & Chemical InstrumentsLH-100-RDSTemperatureinstellung: 37 ° C
MembranfilterMerck MilliporeJGWP047000,2 µ
MikrozentrifugeKubota3740
NaClWako191-01665Präparation von Bindungspuffer und Elutionspuffer
NaH2PO4· 2H2OWako192-02815Herstellung von Bindungspuffer und Elutionspuffer
NaOHWako198-13765Herstellung von Bindungspuffer und Elutionspuffer
(NH4)2SO4Wako015-06737Ammoniumsulfatfällung
Ni-geladenes HarzBio-Rad1560133Für IMAC
PCR-PrimerEurofins GenomicsKundenspezifischer
ProteinstandardBio-Rad161-0381Für SDS-PAGE und Western Blotting
Lösungsmittel-FiltrationsapparatAs OneFH-1G
SpectinomycinWako195-11531Antibiotika; Verwendung bei 100 μm; g/mL
Steriler SpritzenvorsatzfilterMerckmilliporeSLGV004SL0,22 & Mikro; m diameter
Streptococus mutans Δ gtfCStammstamm im Labor.gtfC ersetzt durch spcr
Streptococus mutans UA159Stammstamm im Labor.S. mutans ATCC 700610, Wildtyp-Stamm
SaccharoseWako196-00015Für die Biofilmentwicklung
TAE (50 & mal; )Nippon Gene313-90035Für die Agarose-Gelelektrophorese
ThermocyclerBio-RadPTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)Wako314-90065Tris-EDTA Puffervorbereitung

Referenzen

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

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