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Methodenartikel

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

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DOI:

10.3791/59831

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28. Juni 2019

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1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle zur Herstellung von peptidbasierten kleinen unilamellalaren Vesikeln vorgestellt, die wachstumsfähig sind. Um die Vesiculo-Produktion des Membranpeptids zu erleichtern, sind diese Vesikel mit einem Transkriptions-Translation-System und dem Peptid-kodierenden Plasmid ausgestattet.

Zusammenfassung

Die Abteilisierung biochemischer Reaktionen ist ein zentraler Aspekt synthetischer Zellen. Zu diesem Zweck dienen Peptid-basierte Reaktionsfächer als attraktive Alternative zu Liposomen oder fettsäurebasierten Vesikeln. Äußerlich oder innerhalb der Vesikel können Peptide leicht exprimiert werden und vereinfachen die Synthese von Membranvorläufern. Hier ist ein Protokoll zur Herstellung von Vesikeln mit Durchmessern von 200 nm auf Basis der amphiphilen Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) unter Verwendung von Dehydrierung-Rehydratation aus Glasperlen vorgesehen. Ebenfalls vorgestellt werden Protokolle zur bakteriellen ELP-Expression und -Reinigung über inverseS Temperaturzyklierung sowie deren kovalente Funktionalisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht ein Protokoll, das die Transkription von RNA-Aptamer dBroccoli in ELP-Vesikeln als weniger komplexes Beispiel für eine biochemische Reaktion ermöglicht. Schließlich wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, das die Vesiculo-Expression von fluoreszierenden Proteinen und dem Membranpeptid ermöglicht, während die Synthese des letzteren zu einem Vesikelwachstum führt.

Einleitung

Die Schaffung von synthetischen lebenden zellulären Systemen wird in der Regel aus zwei verschiedenen Richtungen angegangen. Bei der Top-Down-Methode wird das Genom eines Bakteriums auf seine wesentlichen Bestandteile reduziert, was letztlich zu einer minimalen Zelle führt. Im Bottom-up-Ansatz werden künstliche Zellen de novo aus molekularen Komponenten oder zellulären Subsystemen zusammengesetzt, die funktional in ein konsistentes zellähnliches System integriert werden müssen.

Im de novo-Ansatz wird die Kompartimentierung der notwendigen biochemischen Komponenten in der Regel mit Membranen aus Phospholipiden oder Fettsäuren1,2,3,4erreicht. Denn "moderne" Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden, während Fettsäuren als plausible Kandidaten präbiotischer Membrangehäuse5,6gelten. Zur Bildung neuer Membranen oder zur Erleichterung des Membranwachstums müssen amphiphile Bausteine von außen7 oder idealerweise durch die Produktion innerhalb eines membranösen Fachs mit den entsprechenden anabolen Verfahren 4 ,8.

Während die Lipidsynthese ein relativ komplexer Stoffwechselprozess ist, können Peptide recht leicht mit zellfreien Genexpressionsreaktionen9,10produziert werden. Daher stellen Peptidmembranen, die durch amphiphile Peptide gebildet werden, eine interessante Alternative zu Lipidmembranen als Gehäuse für künstliche Zellmimiks dar, die11wachsen können.

Amphiphile Elastin-ähnliche Diblock-Copolymere (ELPs) sind eine attraktive Klasse von Peptiden, die als Baustein für solche Membranen dienen können12. Das grundlegende Aminosäuresequenzmotiv von ELPs ist (GaGVP)n, wobei "a" eine beliebige Aminosäure außer Prolin und "n" die Anzahl der Motivwiederholungen13,14,15,16,17 . ELPs wurden mit einem hydrophoben Block erstellt, der hauptsächlich Phenylalanin für a enthält, und einem hydrophilen Block, der hauptsächlich aus Glutaminsäurebesteht 11. Je nach A- und Lösungsparametern wie pH- und Salzkonzentration weisen ELPs einen sogenannten inversen Temperaturübergang bei Temperatur Ttauf, bei dem die Peptide einen vollständig reversiblen Phasenübergang von einem hydrophilen zu hydroben zustand. Die Synthese der Peptide kann einfach in Vesikelmit dem Bakterienzellextrakt "TX-TL" implementiert werden11,18,19,20,21, alle notwendigen Komponenten für gekoppelte Transkriptions- und Übersetzungsreaktionen.

Das TX-TL-System wurde zusammengekapselt, wobei die DNA-Vorlage die ELPs in ELP-Vesikel kodiert, wobei die Dehydrierung-Rehydratation von Glasperlen als feste Stütze verwendet wird. Die Bildung von Vesikel n.A. erfolgt durch Rehydrierung der getrockneten Peptide von der Perlenoberfläche11. Es können andere Methoden22 zur Vesikelbildung eingesetzt werden, die möglicherweise eine geringere Polydispersität und größere Vesikelgrößen aufweisen (z. B. Elektrobildung, Emulsionsphasentransfer oder mikrofluidische Verfahren). Zur Prüfung der Lebensfähigkeit der Verkapselungsmethode kann alternativ die Transkription des fluorogenen Aptamers dBroccoli23 verwendet werden11, was weniger komplex ist als die Genexpression mit dem TX-TL-System.

Durch die Expression der Membranbausteine in vesiculo und deren anschließende Einbindungin die Membran beginnen die Vesikel 11 zu wachsen. Die Membranintegration der ELPs kann durch einen FRET-Assay nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck werden die ELPs, die für die Bildung der ursprünglichen Vesikelpopulation verwendet werden, mit fluoreszierenden Farbstoffen in gleichen Teilen konjugiert, die ein FRET-Paar bilden. Bei Expression von nicht gekennzeichneten ELPs in vesiculo und deren Einbau in die Membran werden die beschrifteten ELPs in der Membran verdünnt und damit das FRET-Signal um11abgenommen. Als vielseitige und gängige Methode zur Konjugation wird kupferkatalysierte Azid-Alkyn-Zyklusverwendet verwendet. Mit der Verwendung eines stabilisierenden Liganden wie Tris (Benzyltriazolylmethyl)-amin kann die Reaktion in einer wässrigen Lösung bei einem physiologischen pH-Wert ohne Hydrolyse von Reaktanten11durchgeführt werden, die für Konjugationsreaktionen geeignet ist. Peptide.

Das folgende Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der Vorbereitung für wachsende ELP-basierte Peptidosomen. Die Expression der Peptide und vesikelbildung mit der Glasperlenmethode werden beschrieben. Darüber hinaus wird beschrieben, wie die Transkription des fluorogenen dBroccoli Aptamers und die Transkriptions-Translation-Reaktion für die Proteinexpression innerhalb der ELP-Vesikel implementiert werden kann. Schließlich ist ein Verfahren für die Konjugation von Elp mit Fluorophoren vorgesehen, das verwendet werden kann, um das Vesikelwachstum durch einen FRET-Assay11nachzuweisen.

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Protokoll

1. Expression von Elastin-ähnlichen Polypeptiden

  1. Tag 1: Vorbereitung einer Starterkultur und Vorräte für Peptidexpression
    1. Vorbereiten und Autoklavausdruckskulturkolben (4 x 2,5 l) und 3 L LB-Medium. Für 1 L LB Medium 25 g LB-Pulver zu 1 L Reinstwasser hinzufügen.
    2. Bereiten Sie eine Starterkultur mit 100 ml LB-Medium, 50 l sterilgefilterter (0,22-m-Filter)-Chloramphenicol-Lösung (25 mg/ml in EtOH) und 50 l sterilgefiltertem (0,22-mm-Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg/ml in 50 % EtOH und 50 % Reinstwasser) vor.
    3. Fügen Sie einen kleinen Streifen aus einem vorgefertigten Bakterienbestand hinzu, der den E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS mit dem pET20b(+)-Expressionsvektor kodiert, der die Polypeptidsequenz MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abgekürzt EF) zu einer vorgewärmten 100 ml Starterkultur und inkubieren bei 37 °C für 16 h mit 250 U/min in einem Schüttelinkubator (E. coli-Stämme und Vektoren sind auf Anfrage erhältlich).
    4. Die Ausdruckskulturkolben und die LB-Medien über Nacht bei 37 °C vorwärmen, so dass sie für den nächsten Tag vorbereitet werden.
  2. Tag 2: Proteinexpression
    1. Fügen Sie 750 ml LB-Medium zu jedem Expressionskulturkolben, 375 l sterilgefilterten (0,22 m Filter) Chloramphenicol-Bestand (25 mg/ml in EtOH) und 375 l sterilgefilterten (0,22 -m-Filter) Carbenicillin-Bestand (100 mg/ml in 50% EtOH und 50% Ultrareinstwasser) hinzu.
    2. Nach dem Rühren, um die Antibiotika zu verteilen, nehmen Sie 2 ml des Mediums als Referenzprobe für die optische Dichtemessung bei 600 nm (OD600).
    3. 7,5 ml der Startkultur zum Ausdruckskolben hinzufügen und 1 h bei 37 °C mit 250 U/min brüten.
    4. Nach diesem Schritt wird die OD600 jedes Kolbens alle 20 min überprüft.
    5. Wenn die optische Dichte etwa 0,8 erreicht, reduzieren Sie die Temperatur auf 16 °C und induzieren Sie die Peptidexpression, indem Sie 750 l von 1 M steril-gefiltertem Isopropylthiogalactosid (IPTG) in reinem Wasser in jeden Expressionskolben einbauen.
    6. Inkubieren Sie den Expressionskolben mit den induzierten Bakterien bei 16 °C für 16 h mit 250 U/min.
  3. Tag 3: Extraktion des exprimierten Polypeptids
    1. Den Zentrifugationskolben vorwiegen, um die Bestimmung der Masse des Zellpellets nach der Ernte zu ermöglichen.
    2. Ernten Sie alle Bakterien aus den Expressionskolben durch Zentrifugation für 20 min mit einer vorgekühlten Zentrifuge bei 4.000 x g und 4 °C.
    3. Gießen Sie den Überstand aus und blots die Zentrifugenflaschen auf ein steriles Papiertuch.
    4. Wiegen Sie die Zentrifugationskolben und berechnen Sie die Zellpelletmasse.
    5. Setzen Sie die Zellen, die von 750 ml der ursprünglichen Zellkultur nach unten pelletiert werden, in 15 ml phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) durch Pipettieren und Zentrifuge bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C. Gießen Sie den Überstand aus und blots die Zentrifugenflaschen auf ein steriles Papiertuch.
    6. Das Zellpellet für den Lyseschritt in 2 ml Puffer pro 1 Gramm Zellpellet mit PBS (pH 7.4) mit Lysozym (1 mg/ml), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Benzamidin und 0,5 U DNase I, aufsetzen.
    7. Beschallen Sie die Zellen für die weitere Lyse auf Eis mit einem Beschallungsgerät bei 8 W für 9 min mit abwechselnd10 s Beschallung und 20 s Pausenschritten, gefolgt von einer 9-min Pause, in der die Probe auf Eis gekühlt werden sollte. Wiederholen Sie den 9 min Beschallungsschritt noch einmal.
    8. Fügen Sie 2 ml 10% (w/v) Polyethyleneimin (PEI) pro 1 L der ursprünglichen Zellkultur für Nukleinsäurefällung hinzu.
    9. Die Probe in 2 ml Zentrifugenröhrchen verteilen und bei 60 °C 10 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation für 10 min bei 4 °C.
    10. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand, der das ELP enthält.
  4. Proteinreinigung durch inverses Temperaturradfahren:
    1. Stellen Sie den Überstand auf einen pH-Wert von 2 ein, um den hydrophilen Teil des Peptids auf hydrophobe zu schalten und eine Aggregation zu induzieren. Zur Einstellung des pH-Wertes werden Phosphorsäure und Natriumhydroxid verwendet. pH-Streifen reichen aus, um den pH-Wert zu bestimmen.
    2. Um die Ausbeute der Reinigung der Probe zu verbessern, erhitzen Sie die Probe auf 60 °C und fügen Sie Natriumchlorid bis zu 2 M hinzu.
    3. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
    4. Entsorgen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in PBS wieder auf (aber nur die Hälfte des Anfangsvolumens wird im Vergleich zum vorherigen Schritt verwendet).
    5. Stellen Sie den pH-Wert mit Phosphorsäure und Natriumhydroxid auf 7 ein. pH-Streifen sind ausreichend genau, um den pH-Wert zu bestimmen.
    6. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C.
    7. Sammeln Sie den Überstand und wiederholen Sie die Schritte 1.4.1–1.4.6 bis 3x insgesamt, mit der Ausnahme, dass in der letzten Wiederholung von Schritt 1.4.4 nur Wasser anstelle von PBS hinzugefügt wird.
    8. Messen Sie die Konzentration der Peptide mit einem Absorptionsspektrometer. Verwenden Sie einen Aussterbekoeffizienten von 5500/M/cm bei 280 nm.
    9. Stellen Sie die Konzentration des ELP auf 700 m ein.

2. Vesikelproduktion mit der Glasperlen-Methode

  1. Konzentrieren Sie die ELP-Lösung mit einem Zentrifugalvakuumkonzentrator auf 1,1 mM.
  2. Mischen Sie 200 l der konzentrierten ELP-Lösung mit 1.250 l eines 2:1 Chloroform/Methanol-Gemischs, gefolgt von Wirbeln.
  3. 1,5 g kugelförmige Glasperlen (212–300 m groß) zu einem runden Bodenkolben von 10 ml hinzufügen.
  4. Fügen Sie die Lösung mit ELP und dem Chloroform/Methanol-Gemisch in den runden Bodenkolben und mischen Sie sie durch sanftes Schütteln.
  5. Schließen Sie den Kolben an einen Rotationsverdampfer an. Stellen Sie die Drehzahl auf 150 Umdrehungen pro Minute ein und regulieren Sie den Druck auf -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) ca. 4 min, bis die Flüssigkeit bei Raumtemperatur verdampft ist.
  6. Legen Sie den runden Bodenkolben mindestens 1 h in einen Trockenrestor, um sicherzustellen, dass die verbleibenden Chloroformen und Methanolverdampfen verdampfen. Um den Verlust der Glasperlen zu vermeiden, sollte lose befestigte Aluminiumfolie um die runde Bodenkolbenöffnung gewickelt werden.
  7. Für ein einzelnes Experiment 100 mg der Peptid bedeckten Glasperlen mit 60 l der Quelllösung, wie PBS, mischen. Inkubieren Sie diese Probe bei 25 °C für 5 min.
  8. Zentrifugieren Sie die Probe schnell mit einer Tischzentrifuge, um die Glasperlen zu sedimentieren.
  9. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu sammeln, der die Vesikel enthält.

3. Transkription von RNA Aptamer dBroccoli In den Vesikeln

  1. Reinigen Sie den Labortisch mit Tüchern, die die RNase-Dekontaminationslösung enthalten, um eine RNase-freie Arbeitsumgebung zu schaffen.
  2. Mischen Sie die ssDNA (5 M) bestehend aus der T7-Promotor- und dBroccoli-Sequenz (GAGACGGTCGGGTCCTCTCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTGTCTCTCTCGAGTAGAGTGTGTGGGGGCTC) sowie dem nicht kodierenden Strang (5 RNAPol-Reaktionspuffer [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 mM Spermidin], um die DNA-Vorlage für die Transkriptionsreaktion vorzubereiten.
  3. Inkubieren Sie die Lösung bei 90 °C für 5 min, gefolgt von einem langsamen Temperaturabfall auf 20 °C für 30 min.
  4. Bereiten Sie eine 1 mM (5Z)-5-(3,5-Difluor-4-hydroxybenzyliden)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-on (DFHBI) Lösung vor, indem Sie 1,26 mg DFHBI in 5 ml DMSO auflösen.
  5. Vorbereitung der Transkriptionsreaktion durch Mischen des RNAPol-Reaktionspuffers [40 mM Tris-HCl (pH = 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 2 mM Spermidin] mit 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 mM DFHBI, 200 nM DNA-Vorlage, 0,5 U/L Inhibitor murin und Wasser.
  6. Unmittelbar vor Beginn der Reaktion 4 U/L T7-Polymerase hinzufügen.
  7. Verwenden Sie diesen Reaktionsmix als Quelllösung in Schritt 2.7 und inkubieren Sie bei 37 °C für die Dauer des Experiments, die in der Regel 1 h beträgt.

4. Transkriptions-Übersetzung (TX-TL) Reaktion

HINWEIS: Für die Transkriptions-Translation-Reaktion wird ein roher Zellextrakt sowie Reaktionspuffer und DNA benötigt. Der Rohzellextrakt wird wie in Sun et al.18beschrieben hergestellt. Für eine TX-TL-Reaktion verwenden Sie Folgendes: 33% (v/v) des Rohextrakts E. coli, 42% (v/v) Reaktionspuffer und 25% (v/v) phenol-chloroform gereinigte DNA plus Additive. Die Endkonzentrationen betragen ca. 9 mg/ml Protein, 50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM Coenzym A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM Folinsäure, 1 mM , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM Maltose, 1 U T7 RNA Polymerase und 50 nM Plasmid-DNA in Reinstwasser.

  1. Phenol-Chlorform-Reinigung der DNA-Schablone
    1. Bereiten Sie sechs Nachtkulturen mit 5 ml Medium und 5 l steril-gefilterter (0,22 m Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg/ml in 50% EtOH und 50% Reinstwasser) vor.
    2. Fügen Sie einen kleinen Streifen aus einem vorgefertigten Bakterienbestand, der DH5-E. coli mit dem pET20b(+)-Expressionsvektor enthält, zu jeder vorgewärmten 5 ml Nachtkultur hinzu und brüten bei 37 °C für 16 h mit 250 U/min. Je nachdem, welches Peptid (EF) oder Protein (YPet oder mVenus) exprimiert werden soll, wird ein spezifisches Kodierungsplasmid verwendet.
    3. Extrahieren Sie das Plasmid mit einem Mini-Prep-Kit, wie in der Bedienungsanleitung beschrieben oder durch Befolgung des Protokolls von Zhang et al.24.
    4. Bereiten Sie 100 l der vorgereinigten Plasmid-DNA vor (die Konzentration kann zwischen 200–600 ng/l liegen) und mischen Sie sie mit 100 l Roti-Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (pH = 7,5–8,0) in einem Mikrozentrifugenrohr, um eine bessere Phasentrennung zu ermöglichen.
    5. Umkehren Sie das Rohr vorsichtig bis zu 6x und Zentrifuge für 5 min bei 16.000 x g bei RT.
    6. Fügen Sie der oberen Phase des Rohres 200 l Chloroform hinzu und invertieren Sie das Rohr bis zu 6x.
    7. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 5 min bei RT.
    8. Pfeifen Sie den Überstand auf ein separates Rohr und fügen Sie 10 l von 3 M Natriumacetat für die Ethanolfällung hinzu.
    9. 1 ml -80 °C kaltes Ethanol hinzufügen und die Probe bei -80 °C für 1 h lagern.
    10. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C.
    11. Den Überstand dekantieren und 1 ml -20 °C kaltes 70% (v/v) Ethanol hinzufügen.
    12. Zentrifuge bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C.
    13. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren. Achten Sie darauf, das DNA-Pellet nicht zu stören.
    14. Lagern Sie die Probe ca. 15 min bei RT, um das verbleibende Ethanol zu verdampfen.
    15. Fügen Sie der Probe Reinstwasser hinzu, um die Probenkonzentration auf ca. 300 nM einzustellen, die durch Absorption bei 260 nm gemessen wird.
  2. Vorbereitung der TX-TL-Reaktion
    1. Den vorbereiteten Rohzellextrakt und den Reaktionspuffer auf Eis auftauen.
    2. Für einen 60-L-Reaktionsmix die Plasmid-DNA (phenol-chloroform gereinigt) auf 37,5 l des Reaktionspuffers [50 mM HEPES (pH = 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/ml tRNA, 26 mM Coenzym A, 0,33 mM NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM Folinsäure, 1 mM Spermidin, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 und 13,3 mM Maltose), gefolgt von der Zugabe von 28,7 l Rohzellextrakt. Auf ein endreines Volumen mit Reinstwasser auf 58,8 l füllen.
    3. Unmittelbar vor Beginn der Reaktion 1,2 l der T7-RNA-Polymerase-Lösung hinzufügen und die Probe durch Pipettieren nach oben und unten mischen.
    4. Verwenden Sie diesen Reaktionsmix als Quelllösung in Schritt 2.7 und inkubieren Sie bei 29 °C für die Dauer des Experiments, die in der Regel 4–8 h beträgt.

5. Konjugation von Elastin-ähnlichen Polypeptiden mit Fluorophoren über Kupfer katalysierteS Aszid-Alkyn-Huisgen-Cycloaddition

  1. Bereiten Sie eine 20 mM NHS-Azid-Linker -Lösung (Azidobutylsäure N-Hydroxysuccinimid-Ester) in DMSO vor.
  2. Mischen Sie 250 l der ELP-Lösung (600 m) mit PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/L K2HPO4, pH = 7,2) und NHS-Azid (1,2 mM) und inkubieren sie für 12 h bei RT.
  3. Die Probe in eine 10 kDa Dialysekassette legen und bei 4 °C für 12 h in 1 L Reinstwasser lagern, um die Salze und das Rest-NHS-Azid zu entfernen.
  4. Mischen Sie das aktivierte ELP (500 m) mit dem alkynkonjugierten Farbstoff (500 m), Cy5-Alkyn oder Cy3-Alkyn.
  5. Mischen Sie diese Probe mit 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylylmethyl)amin), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid) und 10 mM CuSO4 und inkubieren bei 4 °C für 12 h.
  6. Die Probe in eine 10 kDa Dialysekassette geben und bei 4 °C für 12 h in 1 L Reinstwasser lagern, um die Salze und Restfarbstoffe zu entfernen.
  7. Diese farbmodifizierten ELPs werden in einer 1:1-Mischung aus den Cy3-gekennzeichneten ELPs und den Cy5-gekennzeichneten ELPs analog zu den Peptiden im zweiten Teil verwendet.

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Ergebnisse

Vesikelproduktion
Abbildung 1 zeigt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Vesikeln, die mit verschiedenen Schwellungslösungen hergestellt wurden, und die Glasperlenmethode (siehe auch Vogele et al.11). Für die Probe in Abbildung 1Awurde nur PBS als Quelllösung verwendet, um die Bildung von Vesikeln zu beweisen und ihre Größe zu bestimmen. Wenn TX-TL als Quelllösung verwendet wurde (Ab...

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Diskussion

Filmrehydratation ist ein gängiges Verfahren zur Herstellung von kleinen unilamellalaren Vesikeln. Die Hauptursache des Versagens ist die falsche Handhabung der im Verfahren verwendeten Materialien.

Zunächst werden die ELPs von E. coli-Zellen produziert. Die Ausbeute nach der ELP-Reinigung kann je nachdem, wie sorgfältig das Protokoll während seiner entscheidenden Schritte durchgeführt wird, erheblich variieren. Dies ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Wir danken der finanziellen Unterstützung durch die DFG TRR 235 (Emergence of Life, Projekt P15), den European Research Council (Fördervertrag Nr. 694410 AEDNA) und die TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (Projekt Nr. 9.05) . Wir danken E. Falgenhauer für ihre Hilfe bei der Probenvorbereitung. Wir danken A. Dupin und M. Schwarz-Schilling für ihre Hilfe beim TX-TL System und nützliche Diskussionen. Wir danken N. B. Holland für die nützlichen Diskussionen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2xYTMP biomedicals3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock GelTM TubeVWR733-2478
Alkin-konjugiert Cy3Sigma-Aldrich777331
Alkin-konjugiert Cy5Sigma-Aldrich777358
ATPSigma-AldrichA8937
BenzamidinCarl RothCN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli StammNovagen71402
Bradford BSA Protein Assay KitBio-rad500-0201
cAMPSigma-AldrichA9501
CarbenicillinCarl Roth6344.2
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
ChloramphenicolCarl Roth3886.3
ChloroformCarl Roth4432.1
CoASigma-AldrichC4282
CTPUSB14121
CuSO4Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOCarl RothA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
EthanolCarl Roth9065.2
FolinsäureSigma-AldrichF7878
Glasperlen, säuregewaschenSigma-AldrichG1277
GTPUSB16800
HEPESSigma-AldrichH6147
IPTG (β-IsopropylthiogalactosidSigma-AldrichI6758
KClCarl RothP017.1
K-GlutamatSigma-AldrichG1149
LB BouillonCarl RothX968.2
LysozymSigma-AldrichL6876
MethanolCarl Roth82,2
MgCl2Carl RothKK36.3
Mg-GlutamatSigma-Aldrich49605
Mikro-Bio-Spin-Chromatographie-SäulenBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
NHS-Azid-Linker (y-Azidobuttersäureoxysuccinimidester)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263,2
pH-StreifenCarl Roth549,2
PhenylmethylsulfonylfluoridCarl Roth6367,2
Phosphatgepufferte KochsalzlösungVWR76180-684
PhosphorsäureSigma-AldrichW290017
PolyethyleniminSigma-Aldrich408727
Kaliumphosphat zweibasische LösungSigma-AldrichP8584
Kaliumphosphat monobasische LösungSigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
RNAPol-ReaktionspufferNEBB9012
RNase-Inhibitor murineNEBM0314S
RNaseZap TücherThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
Roti-Phenol/Chloroform/IsoamylalkoholCarlrothA156.1
RTS Aminosäure-Probenehmer5 Prime2401530
Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 10k MWCO (Kit)Thermo-Scientific66382
NatriumchloridCarl Roth9265.1
NatriumhydroxidCarl Roth8655.1
SpermidinSigma-Aldrich85558
Sterilfiltriert (0,22 &μ; m filter)Carl RothXH76.1
T7 PolymeraseNEBM0251S
TBTA (Tris(benzyltriazolylmethyl)amin)Sigma-Aldrich678937
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid)Sigma-AldrichC4706
TrisbaseFischerBP1521
tRNA (aus E. coli)Roche angewendet WissenschaftMRE600
UTPUSB23160
)

Referenzen

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