In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle zur Herstellung von peptidbasierten kleinen unilamellalaren Vesikeln vorgestellt, die wachstumsfähig sind. Um die Vesiculo-Produktion des Membranpeptids zu erleichtern, sind diese Vesikel mit einem Transkriptions-Translation-System und dem Peptid-kodierenden Plasmid ausgestattet.

Zusammenfassung

Die Abteilisierung biochemischer Reaktionen ist ein zentraler Aspekt synthetischer Zellen. Zu diesem Zweck dienen Peptid-basierte Reaktionsfächer als attraktive Alternative zu Liposomen oder fettsäurebasierten Vesikeln. Äußerlich oder innerhalb der Vesikel können Peptide leicht exprimiert werden und vereinfachen die Synthese von Membranvorläufern. Hier ist ein Protokoll zur Herstellung von Vesikeln mit Durchmessern von 200 nm auf Basis der amphiphilen Elastin-ähnlichen Polypeptide (ELP) unter Verwendung von Dehydrierung-Rehydratation aus Glasperlen vorgesehen. Ebenfalls vorgestellt werden Protokolle zur bakteriellen ELP-Expression und -Reinigung über inverseS Temperaturzyklierung sowie deren kovalente Funktionalisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht ein Protokoll, das die Transkription von RNA-Aptamer dBroccoli in ELP-Vesikeln als weniger komplexes Beispiel für eine biochemische Reaktion ermöglicht. Schließlich wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, das die Vesiculo-Expression von fluoreszierenden Proteinen und dem Membranpeptid ermöglicht, während die Synthese des letzteren zu einem Vesikelwachstum führt.

Einleitung

Die Schaffung von synthetischen lebenden zellulären Systemen wird in der Regel aus zwei verschiedenen Richtungen angegangen. Bei der Top-Down-Methode wird das Genom eines Bakteriums auf seine wesentlichen Bestandteile reduziert, was letztlich zu einer minimalen Zelle führt. Im Bottom-up-Ansatz werden künstliche Zellen de novo aus molekularen Komponenten oder zellulären Subsystemen zusammengesetzt, die funktional in ein konsistentes zellähnliches System integriert werden müssen.

Im de novo-Ansatz wird die Kompartimentierung der notwendigen biochemischen Komponenten in der Regel mit Membranen aus Phospholipiden oder Fettsäuren

Protokoll

1. Expression von Elastin-ähnlichen Polypeptiden

1. Tag 1: Vorbereitung einer Starterkultur und Vorräte für Peptidexpression
   1. Vorbereiten und Autoklavausdruckskulturkolben (4 x 2,5 l) und 3 L LB-Medium. Für 1 L LB Medium 25 g LB-Pulver zu 1 L Reinstwasser hinzufügen.
   2. Bereiten Sie eine Starterkultur mit 100 ml LB-Medium, 50 l sterilgefilterter (0,22-m-Filter)-Chloramphenicol-Lösung (25 mg/ml in EtOH) und 50 l sterilgefiltertem (0,22-mm-Filter) Carbenicillin-Lösung (100 mg/ml in 50 % EtOH und 50 % Reinstwasser) vor.
   3. Fügen Sie einen kleinen Streifen aus einem vorgefertigten Bakterienbestand hinzu, der den E.....

Ergebnisse

Vesikelproduktion
Abbildung 1 zeigt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Vesikeln, die mit verschiedenen Schwellungslösungen hergestellt wurden, und die Glasperlenmethode (siehe auch Vogele et al.¹¹). Für die Probe in Abbildung 1Awurde nur PBS als Quelllösung verwendet, um die Bildung von Vesikeln zu beweisen und ihre Größe zu bestimmen. Wenn TX-TL als Quelllösung verwendet wurde (Ab.......

Diskussion

Filmrehydratation ist ein gängiges Verfahren zur Herstellung von kleinen unilamellalaren Vesikeln. Die Hauptursache des Versagens ist die falsche Handhabung der im Verfahren verwendeten Materialien.

Zunächst werden die ELPs von E. coli-Zellen produziert. Die Ausbeute nach der ELP-Reinigung kann je nachdem, wie sorgfältig das Protokoll während seiner entscheidenden Schritte durchgeführt wird, erheblich variieren. Dies .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
5PRIME Phase Lock GelTM Tube	VWR	733-2478
Alkin-konjugiert Cy3	Sigma-Aldrich	777331
Alkin-konjugiert Cy5	Sigma-Aldrich	777358
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Benzamidin	Carl Roth	CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli Stamm	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Carbenicillin	Carl Roth	6344.2
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Chloramphenicol	Carl Roth	3886.3
Chloroform	Carl Roth	4432.1
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
CuSO4	Carl Roth	P024.1
DFHBI	Lucerna Technologies	410
DMSO	Carl Roth	A994.1
DNase I	NEB	M0303S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Ethanol	Carl Roth	9065.2
Folinsäure	Sigma-Aldrich	F7878
Glasperlen, säuregewaschen	Sigma-Aldrich	G1277
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
IPTG (β-Isopropylthiogalactosid	Sigma-Aldrich	I6758
KCl	Carl Roth	P017.1
K-Glutamat	Sigma-Aldrich	G1149
LB Bouillon	Carl Roth	X968.2
Lysozym	Sigma-Aldrich	L6876
Methanol	Carl Roth	82,2
MgCl2	Carl Roth	KK36.3
Mg-Glutamat	Sigma-Aldrich	49605
Mikro-Bio-Spin-Chromatographie-Säulen	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
NHS-Azid-Linker (y-Azidobuttersäureoxysuccinimidester)	Baseclick	BCL-033-5
PEG-8000	Carl Roth	263,2
pH-Streifen	Carl Roth	549,2
Phenylmethylsulfonylfluorid	Carl Roth	6367,2
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	VWR	76180-684
Phosphorsäure	Sigma-Aldrich	W290017
Polyethylenimin	Sigma-Aldrich	408727
Kaliumphosphat zweibasische Lösung	Sigma-Aldrich	P8584
Kaliumphosphat monobasische Lösung	Sigma-Aldrich	P8709
Qiagen Miniprep Kit	Qiagen	27106
RNAPol-Reaktionspuffer	NEB	B9012
RNase-Inhibitor murine	NEB	M0314S
RNaseZap Tücher	ThermoFisher	AM9788
rNTP	NEB	N0466S
Roti-Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol	Carlroth	A156.1
RTS Aminosäure-Probenehmer	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer Dialysekassetten, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Natriumchlorid	Carl Roth	9265.1
Natriumhydroxid	Carl Roth	8655.1
Spermidin	Sigma-Aldrich	85558
Sterilfiltriert (0,22 &μ; m filter)	Carl Roth	XH76.1
T7 Polymerase	NEB	M0251S
TBTA (Tris(benzyltriazolylmethyl)amin)	Sigma-Aldrich	678937
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid)	Sigma-Aldrich	C4706
Trisbase	Fischer	BP1521
tRNA (aus E. coli)	Roche angewendet Wissenschaft	MRE600
UTP	USB	23160

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