Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine automatisierte Plasmaprotein-Verdauungsmethode für die Massenspektrometrie-basierte quantitative proteomische Analyse vor. In diesem Protokoll werden die Flüssigkeitsübertragungs- und Inkubationsschritte zur Proteindenaturierung, Reduktion, Alkylierung und Trypsinverdauungsreaktionen gestrafft und automatisiert. Es dauert etwa fünf Stunden, um eine 96-Well-Platte mit der gewünschten Präzision vorzubereiten.

Zusammenfassung

Die Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie-Analyse in der Proteomik erfordert eine enzymatische Spaltung von Proteinen in eine Peptidmischung. Dieser Prozess beinhaltet zahlreiche Inkubations- und Flüssigkeitstransferschritte, um Denaturierung, Reduktion, Alkylierung und Spaltung zu erreichen. Die Anpassung dieses Workflows an eine automatisierte Arbeitsstation kann die Effizienz steigern und die Varianzkoeffizienten reduzieren und somit zuverlässigere Daten für statistische Vergleiche zwischen Stichprobentypen liefern. Wir haben zuvor einen automatisierten proteomischen Probenvorbereitungsworkflow¹beschrieben. Hier berichten wir über die Entwicklung eines effizienteren und besser gesteuerten Workflows mit folgenden Vorteilen: 1) Die Anzahl der Flüssigkeitstransferschritte wird durch die Kombination von Reagenzien von neun auf sechs reduziert; 2) Pipettierzeit wird durch selektive Spitzenpipettierung mit einem 96-Positionen Pipettierkopf mit mehreren Kanälen reduziert; 3) Potenzieller Durchsatz wird durch die Verfügbarkeit von bis zu 45 Deckpositionen erhöht; 4) Vollständige Gehäuse des Systems bietet verbesserte Temperatur- und Umweltkontrolle und reduziert das Kontaminationspotenzial von Proben oder Reagenzien; und 5) Die Zugabe von stabilen, isotopmarkierten Peptiden sowie dem Protein "Galactosidase" zu jeder Probe ermöglicht die Überwachung und Qualitätskontrolle während des gesamten Prozesses. Diese Hardware- und Prozessverbesserungen bieten eine gute Reproduzierbarkeit und verbessern die Intra-Assay- und Inter-Assay-Präzision (CV von weniger als 20 %) für die LC-MS-basierte Protein- und Peptidquantifizierung. Der gesamte Workflow zur Verdauung von 96 Proben in einer 96-Well-Platte kann in ca. 5 Stunden abgeschlossen werden.

Einleitung

Die Massenspektrometrie (MS) -basierte Protein- und Peptidquantifizierung wird zunehmend als bioanalytisches Werkzeug für die Plasmaanalyse in der Grundlagenforschung und klinischen Laboratorien^2,3eingesetzt. Die erforderliche Instrumentierung und Informatik haben sich schnell weiterentwickelt, da MS zur Methode der Wahl für die Quantifizierung von Proteinen oder modifizierten Proteinen geworden ist, indem bestimmte Peptidsequenzen aufgrund seiner Fähigkeit, Hunderte von Peptiden in einem einzigen MS-Lauf⁴zu quantifizieren, gezielt sind. Die Probenvorbereitung dient als Grundlage für jede proteomische Analyse. Vor der MS-Analyse werden die Proteine in einer biologischen Probe in der Regel denaturiert, reduziert, alkyliert, in tryptische Peptide verdaut und⁵entsalzt. Alkylierung blockiert Zysen, um unkontrollierte Modifikationen zu verhindern und sicherzustellen, dass alle Cysteins die gleiche Masse haben. Als nächstes wird Trypsin hinzugefügt, um Proteine in Peptide zu verdauen. Jeder dieser Schritte erfordert eine Optimierung, und der gesamte Prozess wird traditionell manuell durchgeführt, sodass analytische Fehler auftreten können.

Die traditionelle Biomarker-Entwicklungspipeline besteht aus zwei Hauptprozessen: Schrotflintenproteomik für die globale Proteinentdeckung, um ein detailliertes Proteininventar zu erstellen⁶ und gezielte Proteomik zur Verifizierung und Validierung, die auf hochpräzise und hochdurchsatzreiche Proteinquantierung⁷abzielt. Unabhängig vom MS-Ansatz ist die Probenvorbereitung gleich und konzentriert sich auf die enzymatische Spaltung von Proteinen in eine Peptidmischung. Wie von Van Eyk und Sobhani⁸vorgeschlagen, ist eine Methode mit einer Methode, die eine genaue, präzise und reproduzierbare Analyse sowohl für Entdeckungen als auch für gezielte Assays ermöglicht, wünschenswert, um Entdeckungsbiomarker effektiv auf klinisch implementierte Assays zu verschieben. Dazu ist die Automatisierung der Probenvorbereitung hilfreich und bietet die Möglichkeit, die Effizienz bis hin zur Analyse mit hohem Durchsatz zu steigern. Manuelle Methoden führen in der Regel zu analytischen Fehlern, die über akzeptable Grenzwerte hinausgehen, die von der Food and Drug Administration (FDA) in der überarbeiteten Anleitung zur Validierung bioanalytischer Methoden festgelegt wurden, die Biomarker und Diagnostika^2,9enthält. Die Entwicklung eines schnellen, hochpräzisen und freihändigen MS-Proteinprobenvorbereitungs-Workflows wird notwendig sein, um die Biomarkerforschung zu erleichtern, die die Vorbereitung und Analyse tausender biologischer Proben erfordert. Die MS-Beispielvorbereitung hat viele Schritte, in denen Fehler auftreten können, und der Prozess ist mühsam und zeitaufwändig.

In unserer verbesserten Methode wurde eine automatisierte Workstation so installiert, dass alle notwendigen Plasmaprobenvorbereitungsverfahren in insgesamt 6 Schritten durchgeführt werden (Abbildung 1), um sicherzustellen, dass 1) genaue Flüssigkeitsübertragungen durchgeführt werden; 2) die Reaktion wird zu einem konsistenten Zeitpunkt eingeleitet und gestoppt; 3) die Reaktion wird bei einer kontrollierten Temperatur (d. h. Inkubator) durchgeführt; und 4) die Reaktion hat eine gleichmäßige Mischung für alle Reaktionen. Wir haben auch die Zugabe von exogenen Qualitätskontrollproteinen und internen Standards (stabile, isotopmarkierte Peptidstandards) implementiert, um einen qualitativ hochwertigen und reproduzierbaren Durchsatz von LC-MS-basierter Protein- und Peptidquantifizierung in einem 96-Well-Format zu gewährleisten. Inklusive Reagenzvorbereitung, Arbeitszeitstunden und insgesamt 1.000.000 Pipettierschritten wären 96 Proben in einzelnen Rohren zu verarbeiten. Automatisierung reduziert die praktische Zeit und die Anzahl der menschlichen Interaktionen.

Protokoll

1. Programmierung für den automatisierten Flüssigkeitshandler

1. Erstellen einer neuen Methode aus dem Menü Datei (Datei | Neue Methode)
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte in der angegebenen Reihenfolge aus. Die kursive Schriftart bezeichnet den Text, der in die Biomek-Software eingegeben werden soll. Bitte wenden Sie sich an die Autoren, um Informationen zu Pipettiertechniken und Vorlagen zu erhalten.
2. Geben Sie Startschrittvariablen und ihre Werte im Startschritt ein, wie in Tabelle 1 aufgeführt.
3. Legen Sie Spalten für selektive Spitzenpipetten fest. Klicken Sie für die Schritte 1.3-1.7 in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Global festlegen, und ziehen Sie ihn in die Methode.
   1. Legen Sie mit dem Schritt Global festlegen den Wert =FirstColumn auf die Variable FirstColumn_Global, value =LastColumn auf variable LastColumn_Global, value =LastColumn-FirstColumn+1 to variable Columnsund value =Columns*8 to variable Wells.
   2. Wählen Sie den Skriptschritt in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte aus, und ziehen Sie ihn zur Methode. Geben Sie das VB-Skript wie in Abbildung 2angegeben ein.
4. Festlegen von Volumes für Mischungen Set Global und Lösungen.
   1. Legen Sie mit dem Schritt Global festlegen die entsprechenden Werte auf die Volume-Mix-Variablen fest, wie in Tabelle 2 dargestellt.
   2. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den If-Schritt, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Geben Sie unter Bedingungen Autosamplerein.
   3. Klicken Sie unter Dannauf den Schritt Global festlegen in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte, und ziehen Sie ihn in die Methode.
   4. Legen Sie mit dem Schritt Global festlegen den Wert =(MobilePhase*Columns)+10 auf die Variable MobilePhaseWellfest.
   5. Klicken Sie unter Elseauf den Schritt Global festlegen in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte, und ziehen Sie ihn in die Methode.
   6. Legen Sie mit dem Schritt Global festlegen den Wert =0 auf die Variable MobilePhaseWell fest.
5. Konfigurieren von Guided Labware Setup (GLS)
   1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Dienstprogrammeauf den Schritt Deck-Editor in der Symbolleiste. Erstellen Sie ein neues Deck, das dem Decklayout in Abbildung 3 entspricht, und beschriften Sie es als Deck 1.
   2. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Devices auf den Schritt "Geführtes Setup", und ziehen Sie ihn zur Methode. Ziehen Sie die Labware-Typen in den Deckpositionen, wie in Tabelle 3angegeben. Füllen Sie anschließend die Registerkarten in der Tabelle aus, wie in Tabelle 3 und Abbildung 4 (Einrichten des geführten Setups) dargestellt.
6. Einrichten des Verfahrens für die Tippzählung
   1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur definieren, und ziehen Sie ihn in die Methode. Namensprozedur als TipCount.
   2. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Skriptschritt, und ziehen Sie ihn zur Methode. Geben Sie das VB-Skript wie in Abbildung 5 (Tippzählskript) angegeben ein.
   3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den If-Schritt, und ziehen Sie ihn auf die Methode.
   4. Geben Sie unter Bedingungen den Typ TL5 = 0 ein.
   5. Klicken Sie unter Dannauf den Schritt Labware verschieben in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps, und ziehen Sie ihn zur Methode. Verschieben Sie Labware von TL5 in TR3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Labware verschieben, und ziehen Sie ihn zur Methode. Verschieben Sie Labware von TL2 auf TL5. Klicken Sie schließlich in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Labware verschieben, und ziehen Sie ihn zur Methode. Verschieben Sie Labware von BC90 auf TL2.
7. Definieren des Verfahrens für inkubator
   1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur definieren, und ziehen Sie ihn in die Methode. Namensprozedur als Inkubator.
   2. Geben Sie HalfTime als Variablennamen und 1800 als Standardwert ein.
   3. Geben Sie NextTemp als Variablennamen und 22 als Standardwert ein.
   4. Geben Sie temp als Variablenname und 60 als Standardwert ein.
   5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Enhanced Move Labware, und ziehen Sie ihn zur Methode. Verschieben Sie Labware von P11 nach INHECO1.
   6. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Namensprozedur als TipCount.
   7. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Integrationen auf den Schritt INHECO Incubate, und ziehen Sie ihn zur Methode. Geben Sie INHECO1 ein, um das Gerät an der Position zu verwenden, =HalfTime für Inkubation für, =Temp für °C und 3 für °C der Zieltemperatur. Wählen Sie die Shake-Option während der Inkubation und Orbital ( im Uhrzeigersinn )Shake-Stil. Geben Sie für Einstellungen 1,00 mm seite an Seite, 6,6-mal pro Sekunde, 1,00 mm Vorwärtsanzeige und 6,6-fache Sekunde ein.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die INHECO Incubator-Software installiert ist.
   8. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Integrationen auf den Schritt INHECO Incubate, und ziehen Sie ihn zur Methode. Geben Sie INHECO1 ein, um das Gerät an der Position zu verwenden, =HalfTime für Inkubation für, =Temp für °C und 3 für °C der Zieltemperatur. Wählen Sie die Shake-Option während der Inkubation und Orbital ( gegen den Uhrzeigersinn )Shake-Stil. Geben Sie für Einstellungen 1,00 mm Seite an Seite, 6,6-mal pro Sekunde, 1,00 mm vorwärts und rückwärts bei 6,6-facher Sekunde ein.
   9. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Pause, und ziehen Sie ihn zur Methode. Halten Sie das gesamte System für 1 s.
   10. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur definieren, und ziehen Sie ihn in die Methode. Namensprozedur als Inkubator.
   11. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Integrationen auf den Schritt INHECO Incubate, und ziehen Sie ihn zur Methode. Geben Sie INHECO1 ein, um das Gerät in Position, 1 für Inkubation für, =NextTemp für °C und 3 für °C der Zieltemperatur zu verwenden.
8. Definieren des Verfahrens für Orbital.
   1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Enhanced Move Labware, und ziehen Sie ihn zur Methode. Verschieben Sie Labware von P11 nach Orbital1.
   2. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie die Prozedur TipCount aus.
   3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt "Geräteaktion", und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie Device OritalShaker0, Command TimedShake. Geben Sie Shaking Geschwindigkeit 1000, Zeit, um volle Geschwindigkeit zu erreichen 2, Zeit zu schütteln 30.
   4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Enhanced Move Labware, und ziehen Sie ihn zur Methode. Verschieben Sie Labware Orbital1 auf P11.
9. Einrichten des ersten Mixes
   1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipp auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie Position TL4 neu anordnen.
   2. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Integrationen auf den Schritt INHECO Incubate, und ziehen Sie ihn zur Methode. Geben Sie INHECO1 ein, um das Gerät in Position, 1 für Inkubat für, 60 für °C und 3 für °C der Zieltemperatur zu verwenden.
   3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Schleife, und ziehen Sie ihn in den Schritt Tipp auswählen in die Methode. Geben Sie col als Variable =FirstColumn als Start, =LastColumn als End und 1 als Inkrement ein.
   4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn innerhalb des Schleifenschritts auf die Methode. Wählen Sie BC90-Tipps, TL5-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus, und geben Sie 1ein.
   5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn innerhalb des Schleifenschritts auf die Methode. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reagent Plate Position. Geben Sie Volume =FirstMix, Aspirat an Spalte 1 und Zeile 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
   6. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn innerhalb des Schleifenschritts auf die Methode. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reagent Plate Position. Geben Sie Volume =FirstMix, abgabe an Spalte =col und Zeile 1. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
   7. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn innerhalb des Schleifenschritts auf die Methode. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus.
10. Einrichten der Beispiele
    1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den If-Schritt, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Geben Sie SamplePlate als Bedingung ein.
    2. Klicken Sie unter Dannin der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps zum Laden auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie BC90-Tipps, TL5-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus und geben Sie in =tipcolumnsein.
    3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn auf die Methode, dann. Wählen Sie Greiner96RoundPS Labware Type und Samples Position. Geben Sie volume =Sample, Aspirate at column =FirstColumn und row 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode, dann. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reaction Plate Position. Geben Sie Volume =Sampleein, geben Sie an spalte = FirstColumn und Zeile 1. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode, dann. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus.
    6. Klicken Sie nach If dem Ende des If-Schritts in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie die Prozedur Inkubator aus. Geben Sie HalfTime als Variablennamen und 1800 als Standardwert ein. Geben Sie NextTemp als Variablennamen und 22 als Standardwert ein. Geben Sie temp als Variablenname und 60 als Standardwert ein.
11. Einrichten des Cystein-Blocks
    1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Schleife, und ziehen Sie ihn in den Schritt Tipp auswählen in die Methode. Geben Sie col als Variable =FirstColumn als Start, =LastColumn als End und 1 als Increment ein.
    2. Klicken Sie unter Schleifein der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie BC90-Tipps, TL5-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus, und geben Sie 1ein.
    3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reagent Plate Position. Geben Sie Volumen =CysteinMix, Aspirat an Spalte 2 und Zeile 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Volumen eingeben = CysteinMix, Abgabe an Spalte = col und Zeile 1. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode, dann. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus.
    6. Klicken Sie nach dem Ende der If-Schleife in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie die Prozedur Inkubator aus. Geben Sie HalfTime als Variablennamen und 300 als Standardwert ein. Geben Sie NextTemp als Variablennamen und 43 als Standardwert ein. Geben Sie temp als Variablenname und 25 als Standardwert ein.
12. Einrichten des zweiten Mixes
    1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Schleife, und ziehen Sie ihn in den Schritt Tipp auswählen in die Methode. Geben Sie col als Variable =FirstColumn als Start, =LastColumn als End und 1 als Increment ein.
    2. Klicken Sie unter Schleife in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps zum Laden auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie BC90-Tipps, TL5-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus, und geben Sie 1ein.
    3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reagent Plate Position. Geben Sie Volume =SecondMix, Aspirat an Spalte 3 und Zeile 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reaction Plate Position. Geben Sie Volume = SecondMix, Dispense at column = col und row 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode, dann. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus.
    6. Klicken Sie nach dem Ende der If-Schleife in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie die Prozedur Orbital aus.
    7. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Pause, und ziehen Sie ihn zur Methode. Halten Sie das gesamte System für 1 s.
13. Einrichten der Trypsin-Addition
    1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Schleife, und ziehen Sie ihn in den Schritt Tipp auswählen in die Methode. Geben Sie col als Variable =FirstColumn als Start, =LastColumn als End und 1 als Increment ein.
    2. Klicken Sie unter Schleifein der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie im Dropdown-Menü BC90-Tipps, TL5-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus, und geben Sie 1ein.
    3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reagent Plate Position. Geben Sie Volume =Trypsin, Aspirat in Spalte 4 und Zeile 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reaction Plate Position. Geben Sie Volume =Trypsin, Dispense at column = col und row 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode, dann. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus.
    6. Klicken Sie nach dem Ende der If-Schleife in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie die Prozedur Inkubator aus. Geben Sie HalfTime als Variablennamen und 3600 als Standardwert ein. Geben Sie NextTemp als Variablennamen und 25 als Standardwert ein. Geben Sie temp als Variablenname und 43 als Standardwert ein.
    7. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Integrationen auf den Schritt INHECO Incubate, und ziehen Sie ihn zur Methode. Stellen Sie sicher, dass die INHECO Incubator-Software installiert ist. Geben Sie INHECO1 ein, um das Gerät in Position, 1 für Inkubat für, 25 für °C und 5 für °C der Zieltemperatur zu verwenden.
14. Einrichten von Lösch-
    1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Schleife, und ziehen Sie ihn in den Schritt Tipp auswählen in die Methode. Geben Sie col als Variable =FirstColumn als Start, =LastColumn als End und 1 als Increment ein.
    2. Klicken Sie unter Schleifein der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie BC90-Tipps, TL5-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus, und geben Sie 1ein.
    3. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type und Reagent Plate Position. Geben Sie Volume =Quench, Aspirat an Spalte 5 und Zeile 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Geben Sie Volume =Quench, Dispense at column = col und row 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in dann auf die Methode. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus.
    6. Klicken Sie nach dem Ende der If-Schleife in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie prozedur Orbital.
    7. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Pause, und ziehen Sie ihn zur Methode. Halten Sie das ganze System für 1 san.
    8. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Setup & Device Steps auf den Schritt Pause, und ziehen Sie ihn zur Methode. Wählen Sie Das gesamte System anhalten aus, und zeigen Sie diese Meldung an. Geben Sie die Meldung 'Weiter nach der Zentrifugation' ein.
15. Einrichten der Platte für Autosampler
    1. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Kontrollschritte auf den Schritt Wenn, und ziehen Sie ihn in die Methode im Schritt Tipp auswählen. Geben Sie Autosampler als Bedingung ein.
    2. Klicken Sie unter Dannauf den Schleifenschritt in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte, und ziehen Sie ihn zur Methode. Geben Sie col als Variable =FirstColumn als Start, =LastColumn als End und 1 als Increment ein.
    3. Klicken Sie unter Schleifein der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie BC230-Tipps, TL6-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus, und geben Sie 1ein.
    4. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type and Reagent Plate Position. Geben Sie Volume =MobilePhase, Aspirat in Spalte 6 und Zeile 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    5. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie Bio_RadPCR96 Labware-Typ und Autosampler-Plattenposition aus. Geben Sie Volume =MobilePhase, Dispense at column = col und row 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    6. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in dann auf die Methode. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus.
    7. Klicken Sie nach dem Ende der If-Schleife in der Symbolleiste unter Steuerelementschritte auf den Schritt Prozedur ausführen, und ziehen Sie ihn in die Methode. Wählen Sie die Prozedur TipCount.
    8. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps zum Laden auswählen, und ziehen Sie ihn auf die Methode. Wählen Sie im Dropdown-Menü BC90-Tipps, TL5-Standort und TL2-Backup-Tipps-Speicherort aus. Wählen Sie Einzelne Spalten aus und geben Sie in =tipcolumnsein.
    9. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps anzeigen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie BCDeep96Round Labware Type and Reaction Plate Position. Geben Sie Volume =DigestTransfer, Aspirat an Spalte =firstcolumn und Zeile 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    10. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode innerhalb der Schleife. Wählen Sie Bio_RadPCR96 Labware-Typ und Autosampler-Plattenposition aus. Geben Sie Volume =MobilePhase, Dispense at column =FirstColumn und row 1ein. Wählen Sie eine optimierte Technik aus dem Dropdown-Menü Technik aus.
    11. Klicken Sie in der Symbolleiste unter Flüssigkeitsbehandlungsschritte auf den Schritt Tipps auswählen, und ziehen Sie ihn in die Methode in Then. Wählen Sie Tipps zum Entladen für TR1 aus. Der Schritt "Ausgewählte Tipps" endet hier.
    12. Speichern und benennen Sie die Methode.

2. Bereiten Sie Proben, Laborwaren und Reagenzien vor

1. Übertragen Sie 5 L gepooltes gesundes menschliches Plasma in eine Polypropylen, 96-Runde Tiefbrunnenplatte.
   HINWEIS: Siehe Materialtabelle für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien, die in diesem Protokoll verwendet werden. TPCK behandelt Trypsin wurde gekauft und Trypsin zu Substrat Verhältnis und Inkubationszeit wurde speziell optimiert. Wenn eine andere Klasse von Trypsin verwendet wird, wie z. B. rekombinantes Trypsin in Sequenzklasse, sollten das Verhältnis von Enzym zu Substrat und die Inkubationszeit getestet und optimiert werden.

3. Betriebsablauf

1. Doppelklicken Sie auf das Softwaresymbol.
2. Wählen Sie unter der Registerkarte Methode Alle Achsen aus, um den automatisierten Flüssigkeitshandler auszurichten und vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass alle Workstation-Spritzen keine sichtbaren Luftblasen enthalten.
3. Wählen Sie unter Dateidie Option Öffnen | Methode.
4. Wählen Sie die Methode aus (Abbildung 6).
5. Starten Sie die Methode, indem Sie auf das grüne Dreieckssymbol Run klicken.
6. Um eine Autosampler-Platte am Ende der Methode zu verwenden, geben Sie den Wert 'true' in die Eingabe eines Werts ein, der für die Eingabeaufforderung 'Autosampler' verwendet werden soll, und klicken Sie dann auf OK. Wenn eine Autosampler-Platte nicht vorbereitet wird, geben Sie den Wert 'false' ein, und klicken Sie dann auf OK.
7. Geben Sie den Wert '1' in die Eingabeeines ein, das für die Eingabeaufforderung "firstcolumn" verwendet werden soll, und klicken Sie dann auf OK.
8. Geben Sie den Wert '12' in die Eingabeaufforderung für die Eingabeaufforderung "letzte Spalte" ein, und klicken Sie dann auf OK.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt und Schritt 4.7 weisen die Arbeitsstation an, eine Verdauung an 12 Spalten einer 96-Well-Platte durchzuführen, was dazu führt, dass alle Brunnen der Platte für die Verdauung verwendet werden
9. Wenn eine Probenplatte mit Probenvolumen von mindestens 20 L verwendet wird, geben Sie den Wert 'true' in die Eingabe eines Werts ein, der für die Eingabeaufforderung 'SamplePlate' verwendet werden soll, und klicken Sie dann auf OK. Wenn kein Beispielschild verwendet wird, geben Sie den Wert 'false' ein, und klicken Sie dann auf OK.
   HINWEIS: Wenn keine Probenplatte verwendet wird, fügen Sie jedem entsprechenden Bohrstein der Reaktionsplatte 5 l Probe hinzu.
10. Folgen Sie den Anweisungen im Fenster Guided Labware Setup und klicken Sie auf Weiter.
    HINWEIS: Das nächste Fenster beschreibt das Layout für die zu erstellende "Reagenzienplatte"(Abbildung 7, Ergänzungstabelle 1). Die folgenden Bände werden in jede der 8 Brunnen einer einzelnen Säule in der 1 mL Deep Round 96-Well-Platte aufgenommen:
    Spalte 1: 540 l Reaktionsmix 1.
    Spalte 2: 50 l Cysteinblock.
    Spalte 3: 730 l Reaktionsmix 2.
    Spalte 4: 130 L Trypsin.
    Spalte 5: 130 L Quench Solution.
    Spalte 5: 1090 L mobile Randphasenlösung (Wenn der Benutzer in Schritt 6 'true' eingegeben hat).
11. Klicken Sie auf Weiter, und das folgende Fenster beschreibt das minimale Volumen (20 l), das in die Probenplatte eingegliedert werden muss. Wenn der Benutzer den Wert 'false' für die Eingabeaufforderung mit der Probenplatte (Schritt 9) eingegeben hat, wird der Benutzer aufgefordert, der Reaktionsplatte eine 5-L-Probe hinzuzufügen.
12. Klicken Sie auf Weiter.
    HINWEIS: Das nächste Fenster zeigt, dass eine leere 90-L-Spitzenbox auf dem automatisierten Flüssigkeitshandlerdeck platziert werden muss.
13. Klicken Sie erneut auf Weiter, legen Sie das Deck des automatisierten Flüssigkeitshandlers wie angegeben und dargestellt(Abbildung 8) einschließlich der Reagenzplatte, der Reaktionsplatte, der Probenplatte, der Autosampler-Platte, 6 vollen 90-L-Spitzenboxen, einer leeren 90-L-Spitzenbox und einer vollständigen 230-L-Spitzenbox aus.
14. Klicken Sie auf Fertig stellen, um die Methode zu beginnen.
    HINWEIS: Nachdem Sie auf Fertig stellengeklickt haben, kann der Benutzer nicht in den automatisierten Flüssigkeitshandler gelangen. Dadurch wird der Lichtvorhang der Maschine "gebrochen" und der Flüssigkeitshandler aus Sicherheitsgründen gestoppt.
15. Rufen Sie die Reaktionsplatte an der Schnellgifufugationsaufforderung "Weiter nach der Zentrifugierung" ab und zentrieren Sie sie 30 Minuten lang bei 3.000 U/min.
16. Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist, kehren Sie die Reaktionsplatte an den automatisierten Flüssigkeitshandler an die Position zurück, in der sie sich vor der Zentrifugation befand, und klicken Sie auf Weiter.
    HINWEIS: Der automatisierte Flüssigkeitshandler wird erneut angehalten, wenn die Methode abgeschlossen ist. Wenn der Benutzer für Schritt 6 "true" eingegeben hat, kann die Autosampler-Platte von der Arbeitsstation entfernt und zur Analyse in den Autosampler eines Flüssigchromatographieinstruments gelegt werden.

4. LC-MSMS

1. Lösen Sie Peptide auf einem Hochstrom-HPLC, der aus einer C18 2,1 mm x 100 mm, 3,5 m-Säule mit einer Durchflussrate von 0,25 ml/min besteht, und analysierte inline auf einem dreifachen Vierfach-Massenspektrometer.
   HINWEIS: Nach der Peptidverdauung wird die gezielte LC-MSMS-Methode zur Quantifizierung von Peptiden aus robotisch hergestellten Proben nach einer kurzen Beschreibung von LC-MSMS ausführlich¹ beschrieben.
2. Stellen Sie die Temperatur des Säulenofens auf 40 °C ein. Verwenden Sie Puffer A (2% ACN, 98% Wasser, 0,1% Ameisensäure) und Puffer B (95% ACN, 5% Wasser, 0,1% Ameisensäure) als die beiden mobilen Phasen.
3. Die Säule nach dem Laden 5 Minuten lang mit 5% B ausdemieren. Elute die Peptide über 30 Minuten mit einem linearen 5% bis 35% Gradienten von Puffer B.
   1. Recyceln Sie die Säule vor dem Laden der nächsten Probe, indem Sie sie mit 98% B für 10 Minuten und dann 5% B für 5 Minuten waschen.
   2. Für die Online-Umleitung wird das Postkolonnen-Eluent mit einem Zweiphasen-Schaltventil in den Abfall umgeleitet, bevor es in die Ionenquelle gelangt.
4. Verarbeiten Sie die MRM-Daten.

Ergebnisse

Der automatisierte Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow auf der automatisierten Workstation wurde aus unserem bisherigen automatisierten Protokoll mit einer robusten LC-SRM-MS Erfassungsmethode¹ für Albumin, das ausgewählte Plasmaprotein und das für die Qualitätskontrolle verwendete exogene Protein von A-Galactosidase ('-gal) angepasst. Nach der Verarbeitung wurden die Samples auf einem dreifachen Quadrupol-LC-MS in einem SRM-Assay ausgeführt, der auf Serumalbumin, '-Galactosidase abzielte. Der Variationskoeffizient (CV) des SRM-Signals für jeden Übergang wurde verwendet, um die Reproduzierbarkeit des automatisierten Verdauungsprotokolls zu überwachen.

Wir haben die Reagenzadditions- und Mischschritte für die Verdauung von 5 L-Plasmaproben mit einer 2-stündigen Trypsin-Inkubation auf dem Deck automatisiert. Zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit wurden 5 L eines Plasmapools in mehrere Brunnen einer Reaktionsplatte mit einem Mehrkanalkopf (96 Pin) geleitet. Um die Konsistenz zu überwachen, haben wir vor den Reduktions- und Alkylierungsreaktionen das Protein von '-gal hinzugefügt. Der automatisierte Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow wurde mit einer robusten LC-SRM-MS-Erfassungsmethode getestet, einschließlich Albumin, dem plasmahaltigen Plasmaprotein mit der höchsten Häufigkeit und dem für die Qualitätskontrolle verwendeten Protein von 'gal. Drei -Gal-Peptide und zwei Albuminpeptide wurden aus verarbeiteten Plasmaalbuminproteinen und gespickten -gal-Proteinen überwacht (Tabelle 4).

Um Zeit zu sparen und das Verfahren zu vereinfachen, haben wir die flüssigen Übertragungsschritte des Hinzufügens/Mischens/Inkubation von Reagenz und Reaktionsgemisch mit dem Arbeitsplatz von einem neunstufigen Workflow auf einen sechsstufigen Workflow reduziert (Abbildung 1). Der gesamte proteomische Workflow bestand aus zwei experimentellen Komponenten: der automatisierten Probenvorbereitung und LC-MS/MS. Zunächst haben wir die Genauigkeit der LC-MS/MS SRM-Datenerfassung durch acht aufeinander folgende Injektionen aus demselben Verdauungsbrunnen der Autosamplerplatte bewertet. Die Genauigkeit des automatisierten Probenvorbereitungs-Workflows wurde anhand des prozentualen Varianzkoeffizienten (%CV) des gesamten proteomischen SRM-Workflows minus%CV des LC-MS/MS(Abbildung 9B) berechnet. Mit dem optimierten Plasmaverdauungsverfahren auf dem automatisierten Arbeitsplatz betrug die experimentelle Präzision der automatisierten Probenvorbereitung weniger als 11,4 % für exogene Spike-Gal-Proteine (10,0 % als Durchschnitt) und weniger als 14,9 % für das am häufigsten vorkommende menschliche Serumalbumin (9,9 % im Durchschnitt) (Abbildung 9). Wie erwartet wurden sowohl für humanes Serumalbumin als auch für die Proteine des G-Gal-Proteins gute Signalintensitäten beobachtet(Abbildung 9C).

Für jeden Pipettier- und Flüssigkeitstransferschritt wurden die Techniken speziell optimiert. Um die Präzision der flüssigkeitsübertragenden Schritte zu überwachen, haben wir stabile isotop-markierte (SIL) Peptidstandards für endogenes humanes Serumalbuminprotein und exogenes -gal-Protein in drei unabhängigen Reagenzübertragungsschritten gespickt: Reaction Mix 1, Cystein Blocker und Reaction Mix 2 (Abbildung 10). MRM-Signale aus diesen fünf SIL-Peptiden wurden erfasst, um die Präzision automatisierter Flüssigkeitsübertragungsschritte zu überwachen. Der durchschnittliche %CV für Peptide, DDNPNLPR und GDFNISR (die N15-markierte Aminosäure) aus Reaction Mix 1 Schritt reichte von 1,8 % bis 11,2 %. Der durchschnittliche %CV eines Peptids (IDPNAWVER) aus dem Schritt Cystein Blocker reichte von 6,6 bis 8,8 %. Der durchschnittliche %CV von zwei Peptiden (WVGYGQDSR und LVNEVTEFAK) lag zwischen 6,2 % und 11,9 %(Abbildung 10).

Zur Validierung des automatisierten Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflows haben wir die Reproduzierbarkeit über mehrere Proteine und mehrere Tage auf humanes Serumalbumin, exogenes B-Gal und 40 zusätzliche Plasmaproteine untersucht. Wir verarbeiteten 21 Replizienproben (gepooltes normales menschliches Plasma), brunnen Lage in Abbildung 11Agezeigt, an drei verschiedenen Tagen. Intra-Day-Lebensläufe wurden aus 21 Brunnen berechnet, die am selben Tag vorbereitet wurden. Die durchschnittlichen intra-day %CVs für 40 Proteine reichten von 4% - 20% (Abbildung 11B). Um den Kanteneffekt des plattenbasierten automatisierten Workflows auszuwerten, wurde %CV aus bestimmten Brunnen innerhalb bestimmter Spalten und Zeilen berechnet(Abbildung 12A für Spalten- und Zeilenzuordnung). Die MRM-Signalintensitäten waren in allen Spalten- und Zeilenkonfigurationen ähnlich, wobei %CV zwischen 3 % und 22 % lag (Abbildung 12B).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der optimierte automatisierte Workflow 96 einheitlich verarbeitete Proben in weniger als fünf Stunden mit hervorragender experimenteller Präzision liefert. Zur Kompatibilität mit einem automatisierten Workflow haben wir Reagenzien ausgewählt, die vernachlässigbare unspezifische Seitenreaktionen haben, im Umgebungslicht stabil sind, LC-MS/MS-freundlich sind und als gefrorene Aliquots gelagert werden können.

Abbildung 1: Schema des Beispielvorbereitungsworkflows. Die wichtigsten 6 Flüssigkeitsübertragungsschritte sind aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Tipp laden Skript. Die VB-Skriptdetails werden hier angezeigt. Das Skript gibt Tippladebedingungen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Automatisiertes Workstation Deck-Layout. Das Deck besteht aus 1x1 ALPs, Tip Loading ALPs, Trash, Tip Wash, Peltier und einem Inkubator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Eigenschaften der Reagenzplatte. Gezeigt werden Eigenschaften, die für die Reagenzien-Platte-Labware benötigt werden, wenn sie mit dem Guided Labware Setup darauf zugegriffen wird. Wählen Sie die entsprechende Spalte aus und geben Sie die variablen ein, wie in der Abbildung angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Tippzählskript. Dieses Skript hilft, die Anzahl der Tipps auf dem Deck zu verfolgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Überblick über die Methode zur Verdauung und Aliquotierung von Plasmaproben. Schritte für Reagenzienberechnungen, Labware-Setup und Flüssigkeitsmanipulationen in der Methode des Flüssigkeitshandlers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Layout der Reagenzplatte. Gezeigt werden die chemischen Reagenzien, die für die Plasmaverdauung und die Autosampler-Zubereitung benötigt und über die Laborware der Reagenzienplatte verteilt werden. Diese Zahl wurde aus einem technischen Vermerk¹⁰geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Layout für die Labware auf dem Deck der automatisierten Workstation. Gezeigt wird das Decklayout für die Plasmaverdauungsmethode für den Flüssigkeitshandler. Diese Zahl wurde aus einem technischen Vermerk¹⁰geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Die Genauigkeit des gesamten proteomischen Workflows besteht aus Workstation-Lebenslauf und zielgerichtetem LC MS/MS CV.
Es wurden fünf Peptide aus dem B-Gal und dem Albumin überwacht, die Chromatogramme und die Peptidretentionszeit für jedes Peptid (A) angezeigt, Präzision wurde aus 30 Bohrbrunnen/Proben verarbeitungsrepräsentatives Experiment bestimmt, CVs% für den gesamten proteomischen Workflow, LC MS/MS-Analyse und automatisierte Probenverarbeitung wurden berechnet (B). Insgesamt zeigten die verdauten Peptide gute Signale von 1x10⁵ bis 1x10⁸. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Bestimmung der Genauigkeit für Flüssigkeitsübertragungsschritte. Synthetische Peptide wurden in stufenspezifischen Reagenzien gewürzt, und die automatisierte Flüssigkeitsübertragung wurde durch total%CV bestimmt. Aus 30 Bohrungen/Proben experimentieren minus% CV LC MSMS (bestimmt durch 8 wiederholte LC MSMS-Injektionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Mehrtägige Reproduzierbarkeit des automatisierten proteomischen Probenvorbereitungs-Workflows mit 42 Protein-MRM-Analysen. (A) Die Reaktionsplattenkarte für jeden von drei Tagen zeigt hier, dass jedem von 21 Brunnen 5 l Plasma zugesetzt wurde. 3 Brunnen, die 5 ul Wasser erhielten, wurden als negative/leere Kontrollen verwendet. (B) Die durchschnittlichen Intensitäten von 190 Übergängen umfassen 75 Peptide und 42 Proteine (links) und %CV für jeden MRM-Übergang wurde aus 21 Brunnen vergändefürjeden Tag (rechts) berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Reproduzierbarkeit bestimmter Standorte von Brunnen (Position von Säulen und Reihen). (A) Die Position Spalten und Zeilen mit einer Plattenkarte wird hier angezeigt. (B) Säulen- und Zeilenstandortspezifische MRM-Signale mit durchschnittlichen Intensitäten aus bestimmten Brunnen (links) und cv% (rechts) aus einer einzigen Platte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 13: Screenshot des Technik-Editors. Definieren Sie für jede Pipetting-Vorlage die Eigenschaften der Flüssigkeitsstandserfassung, Clot-Erkennung, Piercing, Flüssigkeitstyp, Allgemein, Aspirat, Dispense, Mix und Kalibrierung. Die Vorlage und die in diesem Protokoll verwendeten Techniken sind in der ergänzenden Tabelle 2dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Variable	Variable	Wert	Beschreibung
Autosampler	Boolean	STIMMT	Autosampler verwenden
Betagal	Ganzzahl	5	Betagales Volumen
BG1	Ganzzahl	0.8	BG1-Volumen
BG2	Ganzzahl	0.8	BG2-Volumen
BG3	Ganzzahl	0.8	BG3-Volumen
CysteinBlocker	Ganzzahl	1.25	Cystein-Blockervolumen
CysteinBuffer	Ganzzahl	0.45	Cystein-Puffervolumen
Denaturant	Ganzzahl	5	Denaturantvolumen
DigestTransfer	Ganzzahl	10	Digest-Übertragungsvolumen
Erster Puffer	Ganzzahl	25.9	Erstes Puffervolume
Erste Spalte	Ganzzahl	1	Erste Spalte
HSA1	Ganzzahl	0.8	HSA1-Volumen
HSA2	Ganzzahl	0.8	HSA2-Volumen
Lastspalte	Ganzzahl	12	Letzte Spalte
MobilePhase	Ganzzahl	90	Mobiles Phasenvolumen
Quench	Ganzzahl	10	Quench-Säule
ReducingAgent	Ganzzahl	5	Reduzieren der Agentenspalte
Beispiel	Ganzzahl	5	Beispielspalte
SamplePlate	Boolean	STIMMT	Probenplatte verwenden
SecondBuffer	Ganzzahl	58.4	Zweites Puffervolumen
Trypsin	Ganzzahl	10	Trypsin-Spalte

Tabelle 1: Schrittvariablen starten

Wert	Variable
=FirstBuffer+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1	FirstMix
=CysteinBlocker+CysteinPuffer+BG2	CysteineMix
=SecondBuffer+BG3+HSA2	SecondMix
=(FirstMix*Spalten)+30	FirstMixWell
= (CysteineMix*Säulen)+20	CysteinWell
=(SecondMix*Spalten)+10	SecondMixWell
=(Trypsin*Spalten)+10	TrypsinWell
=(Quench*Spalten)+10	QuenchWell
=(FirstMixWell*8)+100	FirstMixStock
=CysteinWell*8+20	CysteineMixStock
=(SecondMixWell*8)+100	SecondMixStock

Tabelle 2: Volumenmixvariablen

Typ	Namen	Position	Tiefe	Eigenschaften	Verwenden?
BCDeep96Round	Reagenzplatte	P5	1(oben)	#	=nicht SamplePlate
BCDeep96Round	Reagenzplatte	P5	1(oben)	#	=SamplePlate
BCDeep96Round	Reaktionsplatte	P11	1(oben)		STIMMT
Bio_RadPCR96*	Proben	P9	1(oben)		=SamplePlate
Bio_RadPCR96*	Autosampler-Platte	P10	1(oben)		=Autosampler
BC90	Leer		1(oben)		STIMMT
BC90			1(oben)		STIMMT
BC90			1(oben)		STIMMT
BC230			1(oben)		=Autosampler
BC90			1(oben)		=Spalten>1
BC90			1(oben)		=Spalten>3
BC90			1(oben)		=Spalten>5
BC90			1(oben)		=Spalten>7
BC90			1(oben)		=Spalten>9
Hinweis: *: Entspricht der 96-Well-Bio-Rad-Platte. Klicken Sie auf Eigenschaften, und geben Sie dann die Volumenvariablen ein, wie in Abbildung 6 angegeben.

Tabelle 3: Einrichten des geführten Setups

Protein ID	Peptid-Sequenz	Q1 Masse (Da)	Q3 Masse (Da)	Zeit (min)	Fragment Ion	Declustering-Potenzial	Kollisionsenergie	Kollisionszellen-Ausgangspotenzial
sp| P00722| BGAL_ELOCI	GDFQFNISR	542.3	262.1	19.7	+2y2	61	21	8
		542.3	636	19.7	+2y5	61	25	12
		542.3	764.2	19.7	+2y6	61	25	18
	IDPNAWVER	550.3	436.1	18.1	+2y7+2	61	23	8
		550.3	871.2	18.1	+2y7	61	25	18
		550.3	774.2	18.1	+2y6	61	33	8
	WVGYGQDSR	534.3	782.1	12.1	+2y7	51	25	6
		534.3	562.1	12.1	+2y5	51	27	6
		534.2	505.2	12.1	+2y4	90	25	8
sp| P02768| ALBU_HUMAN	DDNPNLPR	470.8	596.2	9.2	+2y5	61	27	16
		470.8	499.3	9.2	+2y4	61	27	18
		470.8	710.4	9.2	+2y6	61	27	18
	LVNEVTEFAK	575.3	694.4	18.2	+2y6	73.1	29.6	18
		575.3	937.5	18.2	+2y8	73.1	29.6	18
		575.3	823.4	18.2	+2y7	73.1	29.6	18

Tabelle 4: MRM-Parameter

Zusatztabelle 1: Reagenzienplatte Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Protokollvorlage Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Die Probenverarbeitung für die Massenspektrometrie erfordert Proteindenaturierung, Reduktion und Alkylierung, um Zysen zu blockieren, und Trypsinverdauung, um Proteine in Peptide zu spalten. Jede chemische oder enzymatische Reaktion muss zu einem bestimmten Zeitpunkt eingeleitet und bei einer kontrollierten Temperatur durchgeführt werden, und jeder Schritt im Prozess umfasst mehrere Flüssigkeitsübertragungsschritte, bei denen experimentelle Variationen eingeführt werden können. Die automatisierte Probenverarbeitung bietet eine Lösung für dieses Dilemma. Die derzeit erhältlichen Flüssigkeitshandhabungssysteme sind in der Lage, Reagenzien mit einer Genauigkeit und Genauigkeit von weniger als 5 % in 96-Well-Platten zu übertragen und Proben bei kontrollierten Temperaturen von 14 °C bis 70 °C zu bebrüten und Proben zu bebrüten, wobei sie auf Wunsch geschüttelt werden. Wir verwendeten einen automatisierten Flüssigkeitshandler, um Plasma für SRM-Assays in einem 96-Well-Format zu verarbeiten.

Es gibt viele Tausende von Protease-Spaltungsstellen innerhalb der komplexen Mischungen von Proteinen in Serum, Plasma und anderen biologischen Proben; und jedes dieser Proteine hat einzigartige Eigenschaften, die die Zugänglichkeit der Spaltungsstelle und die Stabilität der resultierenden Peptide beeinträchtigen. Es ist daher unmöglich, ein Probenverarbeitungsverfahren zu entwerfen, das für jedes Protein optimal ist. Die beste Alternative ist, so konsequent wie möglich zu sein.

Um Konsistenz zu erreichen, haben wir jeden Pipettierschritt optimiert, der vom automatisierten Flüssigkeitshandler durchgeführt wird. Wir berücksichtigten zunächst das benötigte Volumen und die Einschränkungen, die durch den Typ der Flüssigkeit (Plasma, wässrig oder organisch) und die entsprechenden Eigenschaften (Viskosität, Kohäsion und Volatilität), Hardware (Arbeitsplatzpipettierkopf und plattengreifende Arme) und Labware auferlegt werden. Wir variierten dann die Geschwindigkeit und den nachlaufenden Luftspalt für die Aspiration, die Geschwindigkeit und das Ausblasvolumen für die Abgabe sowie die Kraft und Dauer des Mischens, wobei wir eine Spitzenberührung nach dem Absetzen und/oder dosieren, falls erforderlich, einbauen, um flüssigkeitsbindend an der Außenseite der Spitzen zu beseitigen (Abbildung 13, Ergänzungstabelle 1). Ein einzigartiges SIL-Peptid, das auf Stabilität vorgeschirmt wurde, wurde in jedes Reagenz gespritzt, um die Präzision jedes Flüssigkeitsbehandlungsschritts zu überwachen. Nach der Optimierung lagen die Prozess-Lebensläufe für die meisten Übergänge unter 10 %, was eine gute Reproduzierbarkeit mit dem automatisierten Arbeitsplatz zeigte (Abbildung 9, Abbildung 10, Abbildung 11 und Abbildung 12).

Der hier vorgestellte automatisierte Workflow bietet eine konsistente enzymatische Verdauung mit verbesserter Reproduzierbarkeit und Durchsatz im Vergleich zu manuellen Methoden (Abbildung 9, Abbildung 10). Dieser Ansatz verspricht, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Biomarker-Erkennung und -Validierung durch Massenspektrometrie zu verbessern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ein gepooltes gesundes menschliches Plasma	Bioreclamation Inc.		Humanplasma, getestet im Manuskript
Acetonitril, HPLC-Qualität,	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS, Lösungsmittel
B-Galactosidase, rekombinant aus E.Coli	, Sigma-Aldrich,	G3153-5MG	exogene Kontrollproteine.
Biomek i7 Automatisierte Workstation	Beckman Coulter, Inc.		Die Proteomik-Probenvorbereitungs-Workstation: Die automatisierten Biomek-Workstations sind nicht für die Diagnose von Krankheiten oder anderen Zuständen vorgesehen oder validiert.
Biomek i-Serie Tipps 230µ L Unsteril	Beckman Coulter, Inc.	B85903	Spitzen, i7 Verbrauchsmaterial
Biomek i-Serie Spitzen 90µ L Unsteril	Beckman Coulter, Inc.	B85881	Spitzen, i7 Verbrauchsmaterial
FG, Kit Trypsin TPCK	Sciex	4445250	Trypsin für den Aufschluss
Hartschalen-96-Well-PCR-Platten, flaches Profil, dünnwandig, umrandet, grün/klar;	Bio-Rad	#hsp9641	Autosampler-Platte
Octyl B-D-Glucopyranosid	Sigma-Aldrich	O9882-5G	Reinigungsmittel für den Aufschluss
Polypropylen, 96-Schuss-Deep-Well-Platten steril	Beckman Coulter, Inc.	267007	Reagenz- und Aufschlussplatte
Prominence UFLCXR HPLC-System	Shimadzu, Japan		LC-System mit hohem Durchfluss
QTRAP 6500	SCIEX		Massenspektrometer
Wasser, HPLC-Qualität	Thermo Fisher Scientific	W54	LC MS/MS Lösungsmittel
Xbridge BEH30 C18 2,1 mm x 100 mm	Wasser	186003564	LC MSMS-Säule